Name: in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

हम तकनीकी मदद के लिए स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल और मारिन मैनुअल और Patrice Jegouzo के पिछले संस्करणों के विकास में उनकी मदद के लिए बर्ट्रेंड मैथन, एमजेडी नासर, ली-वेन हुआंग, और जीन साइमननेट को धन्यवाद देते हैं। यह काम शिक्षा और अनुसंधान के लिए फ्रांसीसी मंत्रालय (एल आर, एल एस), केंद्र राष्ट्रीय des Etudes Spatiales (एम. बी.), और Agence Nationale डे ला Recherche अनुदान <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (डी एफ) द्वारा समर्थित किया गया था.

सभी प्रक्रियाओं यूरोपीय समुदाय परिषद के निदेशक (2010/63/EU) के अनुसार प्रदर्शन किया और पेरिस Descartes विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. प्रयोगकर्ता को स्थानीय नियमों का अनुपालन करने के ल?...

<ol>
	<li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity.">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li><li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal.">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), 870-874 (2015).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I(h).">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li><li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li><li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat.">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li><li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulating+neurons+with+light.">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li><li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex.">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li><li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum.">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032 (2017).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex.">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li><li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na++current.">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).</li><li>Simonnet, J., Eug&#232;ne, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum.">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li><li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system.">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Huang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus,+Thalamus,+or+Medial+Entorhinal+Cortex.">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons.">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex.">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies.">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li></ol>

एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में प्रकाश के प्रति संवेदनशील opsins व्यक्त करने के लिए विवो वायरल इंजेक्शन में लंबी दूरी के कार्यात्मक कनेक्टिविटी10,11,17,18के opt...

तंत्रिका परिपथों को समझने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच संपर्क को परिभाषित करना आवश्यक है। शास्त्रीय शारीरिक अनुरेखण विधियों से अंतरक्षेत्रीय संपर्क स्थापित करने की अनुमति मिलजाती है, और घाव अध्ययन सूचना प्रवाह के पदानुक्रमिक संगठन को समझने में मदद करते हैं। उदाहरण के लिए, स्थानिक अभिविन्यास और सिर दिशा संकेतन के लिए मस्तिष्क सर्किट presubiculum करने के लिए thalamus से जानकारी के दिशात्मक प्रवाह शामिल है. यह एन्टेरो-डोर्सल थैलेमिक नाभिक (एडीएन) के घाव अध्ययनों द्वारा प्रदर्शित किया गया है जो डाउनस्ट्रीम पृष्ठीय पूर्वउपिकुलम में सिर की दिशा संकेत को नीचा दिखाते हैं, साथ ही पैराहिप्पोकैम्पल ग्रिड सेल संकेत1,2.
मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी एक सेलुलर और subcellular स्तर पर स्थापित करने के लिए और अधिक कठिन है. हिप्पोकैम्पस में, एक अत्यधिक संगठित शरीर रचना विज्ञान टुकड़ा तैयारी में बिजली के अनुकरण का उपयोग कर पथ-विशिष्ट synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए अनुमति देता है। उत्तेजना इलेक्ट्रोड CA1 के स्तर radiatum में रखा विशेष रूप से CA33से Schaffer संपार्श्विक इनपुट को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CA1 के स्तर lacunosum आणविक में रखा इलेक्ट्रोड उत्तेजक CA14के लिए छिद्रक पथ इनपुट सक्रिय हो जाएगा,5. विद्युत उत्तेजना एक्सॉन टर्मिनलों से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को सक्रिय करता है; हालांकि, यह उत्तेजना साइट के पास somata के साथ न्यूरॉन्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारित होने के axons सक्रिय करता है. यह इसलिए परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों से afferents का अध्ययन करने के लिए सीमित उपयोग की है जब मूल के विभिन्न क्षेत्रों के फाइबर लक्ष्य संरचना में intermingle, के रूप में आम तौर पर neocortex में मामला है.
न्यूरॉन्स भी प्रकाश के साथ प्रेरित किया जा सकता है. ऑप्टिकल तरीकों में बंदी ग्लूटामेट की फोटो सक्रियण शामिल है, जिसे एक या दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। एकाधिक बारीकी से अंतरिक्ष साइटों क्रमिक रूप से प्रेरित किया जा सकता है, ऊतक के लिए कोई यांत्रिक क्षति के साथ6. यह सफलतापूर्वक synaptic रिसेप्टर्स नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और साथ ही व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को सक्रिय7. जबकि ग्लूटामेट uncaging स्थानीय सर्किट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह लंबी दूरी की आदानों के विशिष्ट सक्रियण के लिए अनुमति नहीं है.
न्यूरोनल सर्किट में लंबी दूरी की कनेक्टिविटी की जांच के लिए पसंद की एक विधि वायरस मध्यस्थता चैनलहोडोप्सिन अभिव्यक्ति का उपयोग है। यहाँ वर्णित के रूप में विवो stereotaxic इंजेक्शन में प्रयोग, प्रकाश gated आयन चैनलों की अभिव्यक्ति को लक्षित किया जा सकता है और स्थानिक रूप से एक वांछित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित. इस तरह, चैनलहोडोप्सिन एक क्षेत्र से अपने लक्ष्य के लिए उत्तेजक या निरोधात्मक कनेक्टिविटी मानचित्रण के लिए प्रभावी रहे हैं। Transfected axons टर्मिनलों एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में प्रकाश के साथ प्रेरित किया जा सकता है, और पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के रूप में एक पढ़ने के बाहर कार्यों और मस्तिष्क में विशिष्ट सर्किट घटकों की ताकत की परीक्षा की अनुमति8. किसी विषाणु के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के साथ संयोजित ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण अभूतपूर्व विशिष्टता और आनुवंशिक नियंत्रण 9 प्रदान करताहै. इसके अतिरिक्त प्रकाश के साथ उत्तेजक दोनों उच्च लौकिक और स्थानिक परिशुद्धता के लिए अनुमति देता है10,11.
पूर्वाश्म हिप्पोकैम्पस के संक्रमण पर एक छह परतदार कॉर्टिकल संरचना है और पैरा-हिप्पोकैम्पस गठन12,13. यह ADN11 से महत्वपूर्ण synaptic इनपुट प्राप्त करता है लेकिन यह भी कई अन्य cortical और subcortical क्षेत्रों से14. इस प्रकार, एक presubicular टुकड़ा के भीतर thalamic एक्सॉन टर्मिनलों के चयनात्मक उत्तेजना बिजली की उत्तेजना और न ही ग्लूटामेट uncaging के साथ संभव नहीं है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रकाश gated चैनलों को व्यक्त वायरल वैक्टर इंजेक्शन के सटीक स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग कर मस्तिष्क क्षेत्रों (एडीएन और presubiculum) के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी निर्धारित करने के लिए तरीके हैं। इसके अलावा वर्णित अपने लक्ष्य क्षेत्र में न्यूरॉन्स पेश करने के axons टर्मिनलों के photostimulation है, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में पोस्ट synaptic न्यूरॉन्स के पूरे सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के साथ युग्मित.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:927px;" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.5 mm bur&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">724962</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10 &#181;L Hamilton syringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">1701 RN - 7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X PBS solution</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">AM9624</td>
			<td>&#160;text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">36% PFA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">470 nm LED&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">P1105/470/LED&#160; DC/59022m</td>
			<td style="width:365px;">use with matched excitation filter 470/40x&#160; and emission filter for GFP&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-5-PV3446</td>
			<td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">All chemicals</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bath temperature controler</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM7</td>
			<td>Set at 34&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">beveled metal needle</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">7803-05</td>
			<td>33 gauge, 13mm, point style 4-20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Big scissors</td>
			<td style="width:183px;">Dahle Allround</td>
			<td style="width:136px;">50038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Biocytin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B4261</td>
			<td>final 1-3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:183px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">GC150-10</td>
			<td>1.5 mm outer, 0.86 inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Brown Flaming electrode puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;">P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BupH Phosphate Buffered Saline pack</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">butterfly needle for perfusion</td>
			<td style="width:183px;">Braun&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Venofix A</td>
			<td>24G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:136px;">DL-604M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;">LSM710</td>
			<td>20X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">curved forceps</td>
			<td style="width:183px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11011-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">CY5 configuration (confocal)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">CY5 configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">DAPI configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digital handheld optical meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Parametered on 475 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Double egde stainless steel razor blades</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:136px;">72000</td>
			<td>Use half of the blade in the slicer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dual Fluorescent Protein Flashlight</td>
			<td style="width:183px;">Nightsea</td>
			<td style="width:136px;">DFP-1</td>
			<td style="width:365px;">excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">EGTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E4368</td>
			<td>final 0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">Eclipse TE-2000E</td>
			<td>10 or 20X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fluoro-Ruby 10%</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">AG335</td>
			<td>disolve 10 mg in 100 &#181;l of distilled water ; inject 150 to 300 nl</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">GFP configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heatingplate</td>
			<td style="width:183px;">Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">HP4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heparin choay 5000 U.I./ml</td>
			<td style="width:183px;">Sanofi</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:183px;">Foredom</td>
			<td style="width:136px;">K.1070</td>
			<td>maximum drill speed 38,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Internal solution compounds :</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:136px;">2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P4504</td>
			<td>final 1,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketamine 1000</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketofen 10%</td>
			<td style="width:183px;">Merial</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>100 mg/ml : dilute 1 &#181;l in 1ml total (0,1%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laocaine (lidocaine)</td>
			<td style="width:183px;">MSD</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LED hi power spot for surgery</td>
			<td>Photonic (via Phymep)</td>
			<td style="width:136px;">10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">LED Power Supply</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">OptoLED Light Source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Manipulators</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mg-ATP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9187</td>
			<td>final 4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MgCl2</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">63069</td>
			<td>final 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro temperature controler</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">MTC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Milk powder</td>
			<td style="width:183px;">Carnation</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na Phosphocreatine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7936</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na3-GTP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G9002</td>
			<td>final 0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">needle holder/hemostat</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">pClamp acquisition software</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">Minipuls 3</td>
			<td>14-16 on the display for 2-3 ml/min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium gluconate (K-gluconate)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G4500</td>
			<td>Final 135 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">ProLong Gold antifade mounting medium</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P36390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rompun 2% (xylazine)</td>
			<td style="width:183px;">Bayer</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">small scissors</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride 0.9%&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dilute 8.5 mL in 10 ml total</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope VISISCOPE SZT</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">630-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotaxic frame with digital display</td>
			<td style="width:183px;">Kopf</td>
			<td style="width:136px;">Model 940</td>
			<td>Small animal stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:136px;">434315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy5 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">S32357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Superglue3 Loctite</td>
			<td style="width:183px;">Dutscher</td>
			<td style="width:136px;">999227</td>
			<td>1g tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">F3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:183px;">kdScientific</td>
			<td>Legato 130 - 788130</td>
			<td>Use Infuse and Withdraw modes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">VT1200S</td>
			<td>speed 0.07, amplitude 1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">tubing</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F117942, F117946</td>
			<td>Yellow/Black, Purple/Black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">upright microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Versi-dry bench absorbant paper</td>
			<td style="width:183px;">Nalgene</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices

सेल प्रकार विशिष्ट synaptic कनेक्टिविटी का ज्ञान मस्तिष्क चौड़ा न्यूरॉन सर्किट को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. लंबी दूरी के कनेक्शन के कार्यात्मक जांच की पहचान दूर आदानों की विशिष्ट उत्तेजना के साथ संयुक्त एकल न्यूरॉन्स के लक्षित रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है. यह अक्सर पारंपरिक और विद्युत उत्तेजना तकनीकों के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, क्योंकि अपस्ट्रीम मस्तिष्क क्षेत्रों converging से axons लक्ष्य क्षेत्र में intermingle हो सकता है. प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनलों के वायरस-मध्यस्थ अभिव्यक्ति के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के स्टीरियोटैक्सिक लक्ष्यीकरण प्रकाश के साथ उस क्षेत्र से उत्पन्न axons के चयनात्मक उत्तेजना की अनुमति देता है. इंट्रासेरेब्रल स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग अच्छी तरह से सीमांकित संरचनाओं में किया जा सकता है, जैसे कि मस्तिष्क में अन्य subcortical या cortical क्षेत्रों के अलावा, पूर्वकाल थैलेमिक नाभिक।
यहाँ वर्णित वायरल वैक्टर के सटीक stereotaxic इंजेक्शन के लिए तकनीक का एक सेट है माउस मस्तिष्क में channelrhodopsin व्यक्त, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में एक्सॉन टर्मिनलों के photostimulation द्वारा पीछा किया. इन प्रोटोकॉल सरल और व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं. एक postsynaptically जुड़े न्यूरॉन से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में, axons के photostimulation कार्यात्मक synaptic कनेक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, औषधीय लक्षणीकरण, और उनकी ताकत का मूल्यांकन. इसके अलावा, दर्ज न्यूरॉन के biocytin भरने postynaptic न्यूरॉन के पोस्ट-हॉक रूपात्मक पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया एक नीले प्रकाश के प्रति संवेदनशील channelrhodopsin व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (Chronos) thalamus के antero-dorsal नाभिक में GFP के लिए जुड़े (एडीएन), anterograde एडेनो संबद्ध वायरस के स्टीरियोटैक्सिक इंज?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

इस प्रोटोकॉल पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में optogenetic उत्तेजनाओं का उपयोग कर दूर मस्तिष्क क्षेत्रों से लंबी दूरी की आदानों की सेल प्रकार विशिष्ट कार्यात्मक कनेक्टिविटी की पहचान करने के लिए तरीकों का एक सेट का वर्णन करता है.

माउस मस्तिष्क स्लाइस में लंबी-रेंज इनपुट के Optogenetic उत्तेजना के लिए Vivo Intracerebral Stereotaxic इंजेक्शन में

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

इस विधि का उद्देश्य मस्तिष्क स्लाइस में फोटोस्मुलेशन का उपयोग करके दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों से लंबी दूरी के आदानों की कार्यात्मक कनेक्टिविटी की पहचान करना है। प्रकाश संवेदनशील आयन चैनलों की विभिन्न मध्यस्थता अभिव्यक्ति के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र का स्टीरियोटैक्सिक लक्ष्यीकरण प्रकाश के साथ उस क्षेत्र से आने वाले अक्षों की चयनात्मक उत्तेजना की अनुमति देता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन लुई Richevaux, मेरे समूह से एक पीएचडी के छात्र होगा ।सर्जरी से पहले, सत्यापित करें कि जानवर अच्छी तरह से एक अंगुली चुटकी के साथ एनेस्थेटाइज्ड है। धीरे से सांस लेने की सुविधा के लिए अपनी जीभ बाहर खींचो। इसके बाद कपाल के बालों को शेव करें।स्थानीय संज्ञाहरण के लिए सिर की त्वचा के नीचे लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड के 20 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें और पांच मिनट इंतजार करें। खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए, खोपड़ी पर एक कट बनाएं। इसके बाद जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें।कान की सलाखों डालें और उन्हें हड्डियों पर आराम करें कानों में थोड़ा रॉक्रल करें और खोपड़ी तक अच्छी पहुंच बनाने के लिए त्वचा को नीचे खींचें। कान की सलाखों को कस लें और नाक के टुकड़े को स्थापित करें। ऊंचाई-समायोजित समर्थन का उपयोग करके जानवर के शरीर को क्षैतिज रूप से और सिर के स्तर पर बनाए रखें।शारीरिक तापमान पर रखने के लिए जानवर के नीचे एक हीटिंग पैड रखें। फिर नरम ऊतक को हटाने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ 0.9% सोडियम क्लोराइड लगाने से खोपड़ी को साफ करें। खोपड़ी को समायोजित करें ताकि ब्रेग्मा लैम्ब्डा एक्सेस समतल हो।फिर, पीछे और औसत के बाद निर्देशांक के अनुसार खोपड़ी पर इंजेक्शन साइट का पता लगाएं और इसके ऊपर इंजेक्शन सुई की स्थिति। खोपड़ी को डिस्पोजेबल सुई से चिह्नित करें। इसके बाद इंजेक्शन की सुई को चार सेंटीमीटर ऊपर ले जाएं।0.5 मिलीमीटर बर्र का उपयोग करके, अधिकतम गति के एक आधे हिस्से पर निशान पर एक मिलीमीटर व्यास क्रैनिओटॉमी बनाएं। यदि कोई रक्तस्राव होता है तो ऊतक के साथ झाड़ू। इसके बाद, स्टोरेज के लिए हैमिल्टन सिरिंज में निहित पानी को पूरी तरह से पंप से बाहर निकालकर खाली करें।सिर्फ सुई से पानी भरा जाता है। बर्फ पर इंजेक्ट किए जाने वाले वायरल समाधान को पिघलाएं, फिर, संक्षेप में इसे बर्फ से हटा दें और एक माइक्रोपिपेट के साथ समाधान के 700 नैनोलीटर प्राप्त करें। इसके बाद, पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर एक बूंद जमा करें।पैराफिन फिल्म को क्रैनिओटॉमी के ऊपर रखें। एंटीरोडेर और पार्श्व स्थिति को बदले बिना वायरल समाधान की बूंद में सुई डुबकी। इसके बाद, पैराफिन फिल्म पर वायरल समाधान के लगभग 500 नैनोलीटर के साथ सिरिंज को भरने के लिए पंप के वापस लेने के कार्य का उपयोग करें।स्टीरियोस्कोप के तहत इस प्रक्रिया को करें, ड्रॉप को गायब देखें, और सुनिश्चित करें कि किसी भी हवा को एस्पिरेट न करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज सही ढंग से भर दिया गया है। तरल की एक छोटी बूंद को बाहर निकालने के लिए प्लंजर को नीचे चलाकर रिजेक्शन सिस्टम का परीक्षण करें।बाद में, चुनी हुई गहराई में सुई को मस्तिष्क में डालें। इंजेक्शन के लिए रन बटन पुश करें। फिर, धीरे-धीरे तीन से पांच मिनट से अधिक सुई वापस लें।क्लोजिंग से बचने के लिए कई बार खाली करके सुई को साफ आसुत पानी में तुरंत धोएं। इसके बाद, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से जानवर को हटा दें। त्वचा को सीवन करें और 2-1-1 मानक सर्जिकल नॉट के साथ बंधे तीन या चार टांके बनाएं।मस्तिष्क निकालने के लिए, गर्दन से नाक तक त्वचा पर एक कट बनाएं, फिर कैंची के साथ खोपड़ी से अंतिम कशेरुकी को अनुभाग करें। त्वचा को वापस लें और मिडलाइन के साथ खोपड़ी को कौडल से रोस्ट्रल दिशा में काट लें। ललाट की हड्डी के पार्श्व की हड्डी और कौंडल भाग को सावधानी से हटा दें।मस्तिष्क और कपाल तल के बीच इसे डालकर एक छोटे गोल स्पैटुला के साथ मस्तिष्क निकालें, घ्राण बल्ब, ऑप्टिक तंत्रिका, और अन्य कपाल तंत्रिकाओं और सेरिबैलम को खंडित करें। धीरे-धीरे बर्फ ठंड काटने के समाधान में मस्तिष्क जलमग्न। बाद में, मस्तिष्क को एक फिल्टर पेपर में स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे कॉर्टिकल सतह को सुखाएं।क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस को काटने के लिए ब्लेड का सामना कर रहे कौडल पक्ष के साथ एक वाइब्रेकोम के नमूना धारक को मस्तिष्क कॉर्टेक्स गोंद करें। इसके बाद, काटने वाले कक्ष को बर्फ के ठंडे ऑक्सीजनयुक्त काटने के समाधान से भरें ताकि मस्तिष्क पूरी तरह से स्थिर हो जाए। धारा 300 माइक्रोमीटर मोटी स्लाइस एक मिलीमीटर आयाम पर 07 मिलीमीटर प्रति सेकंड की गति से वाइब्रेटरोम के साथ।इस स्तर पर, फ्लोरोसेंट टॉर्च और इसी फिल्टर चश्मे का उपयोग करके थैलेसीमिया में क्रोनोस-जीएफपी अभिव्यक्ति की संक्षेप में जांच करने की सिफारिश की जाती है। पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग करने के लिए, धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग कक्ष में हिप्पोकैम्पल परिसर युक्त एक मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरित करें। लगातार 34 डिग्री सेल्सियस ACSF के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर को दो से तीन मिलीलीटर प्रति मिनट पर कार्बोजन के साथ बुलबुला।संक्षेप में 4X आवर्धन पर नीले एलईडी रोशनी के साथ ब्याज के क्षेत्र में एक्सोन टर्मिनलों में क्रोनोस-जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें। 63X विसर्जन उद्देश्य में बदलें और ध्यान समायोजित करें। क्रोनोस-जीएफपी को व्यक्त करते हुए एक्सॉन की जांच करें और पैच रिकॉर्डिंग के लिए एक पिरामिड न्यूरॉन चुनें।इसके बाद, पोटेशियम ग्लूकोनेट आधारित आंतरिक समाधान के साथ एक पिपेट भरें। इसे सिर के चरण पर पिपेट धारक में माउंट करें। वोल्टेज क्लैंप विन्यास में सेल पैच।पहचाने गए न्यूरॉन से संपर्क करें और सोमा पर पिपेट टिप को नाजुक रूप से दबाए। सकारात्मक दबाव झिल्ली की सतह पर एक डिंपल का उत्पादन करना चाहिए। फिर, एक गीगोम सील बनाने के लिए दबाव जारी करें।एक बार सील होने के बाद, होल्डिंग वोल्टेज को माइनस 65 मिलीवोल्ट्स पर सेट करें। नकारात्मक दबाव की तेज नब्ज से झिल्ली को तोड़ें। पूरे सेल वर्तमान क्लैंप मोड में वर्तमान चरणों को हाइपरपोलेराइज करने और डीपोलराइज करने के लिए न्यूरॉन की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें।वर्तमान या वोल्टेज क्लैंप पोस्टसिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं में रिकॉर्ड 475 नैनोमीटर एलईडी पूरे क्षेत्र उत्तेजना के लिए क्रोनोस व्यक्त करते हैं। 20 हर्ट्ज पर दो मिलीसेकंड अवधि के दस उत्तेजनाओं की गाड़ियों के साथ उत्तेजित करें। हाइपरपोलेरेशन और डिपोलराइजिंग वर्तमान चरणों के जवाब में परत तीन में प्रीसुबिकुलर न्यूरॉन्स की गतिविधि पूरे सेल पैच-क्लैंप विन्यास में दर्ज की गई थी।क्रोनोस-जीएफपी को व्यक्त करने वाले एडीएन एक्सॉन टर्मिनलों को उत्तेजित करते हुए वर्तमान क्लैंप मोड में प्रीसुबिकुलर लेयर थ्री प्रिंसिपल कोशिकाओं में उत्तेजक उत्तेजक पोस्ट-सिनेप्टिक क्षमता। प्रकाश तीव्रता के आधार पर, ईपीएसपी कार्रवाई संभावित सीमा तक पहुंच सकता है। वोल्टेज क्लैंप मोड में पोस्ट-सिनैप्टिक प्रतिक्रियाएं भी देखी गईं, क्योंकि उत्तेजक पोस्ट-सिनैप्टिक धाराओं को प्राप्त किया गया था।यहां दिखाया गया एक परत तीन पिरामिड न्यूरॉन है जो थैलेसीमिक एक्सॉन से घिरा हुआ है जो प्रीसुबिकुलर सतही परतों में क्रोनोस-जीएफपी को व्यक्त करता है जिसमें एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग डैपी धुंधला होता है। और इस छवि को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक उच्च आवर्धन पर लिया गया था। फ्लोरोसेंट ट्रेसर के साथ पायलट प्रयोगों को करने में धुरी के साथ ब्रेग्मा का सावधानीपूर्वक लेवलिंग स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन की सटीकता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया का उपयोग दो अलग-अलग तरंगदैर्ध्य के प्रति संवेदनशील दो जनरेटिव दृश्य पर इंजेक्शन देकर विभिन्न क्षेत्रों से अभिसरण अनुमानों की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। इस तकनीक के विकास ने कोशिका प्रकार विशिष्ट तरीके से दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच सटीक शारीरिक और कार्यात्मक सर्किट विश्लेषण की अनुमति दी है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

जीर्ण के लिए वयस्क जन्म घ्राण न्यूरॉन्स के चयनात्मक वायरल transduction Vivo में Optogenetic उत्तेजना

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

कार्यात्मक न्यूरोइमेजिंग अल्ट्रासोनिक रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन और मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई का उपयोग

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

मस्तिष्क के ऊतकों के जीर्ण Optogenetic उत्तेजना के लिए फाइबर ऑप्टिक आरोपण

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के विवो प्रसव के बाद electroporation में और समय चूक इमेजिंग

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

कृंतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विवो optogenetic उत्तेजना में

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

ब्रेन स्लाइस में डर सर्किट के पूर्व vivo optogenetic विच्छेदन

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

वयस्क सेरेबेलर स्लाइस में दीर्घकालिक अवसाद प्रेरण का आकलन

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...