Name: in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Ringraziamo Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang e Jean Simonnet per il loro aiuto nello sviluppo di versioni precedenti del protocollo di iniezione stereotassico e Marin Manuel e Patrice Jegouzo per l'aiuto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero francese per l'istruzione e la ricerca (L. R., L. S.), Centro Nazionale di Des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio della Comunità europea (2010/63/UE) e approvate dal comitato etico dell'Università Cartesio di Parigi. Lo sperimentatore deve ottenere l'autorizzazione per la procedura di conformità alle normative locali.
1. Pianificazione dell'esperimento
<ol><li>Definire l'area del cervello da prendere di mira. Determinare le coordinate stereotaxiche del sito di iniezione con l'aiuto di un atlante cerebrale del topo<su...

<ol>
	<li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity.">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li><li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal.">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), 870-874 (2015).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I(h).">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li><li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li><li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat.">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li><li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulating+neurons+with+light.">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li><li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex.">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li><li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum.">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032 (2017).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex.">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li><li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na++current.">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).</li><li>Simonnet, J., Eug&#232;ne, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum.">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li><li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system.">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Huang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus,+Thalamus,+or+Medial+Entorhinal+Cortex.">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons.">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex.">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies.">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li></ol>

L'iniezione virale in vivo per esprimere le opsine sensibili alla luce in un'area del cervello definita è un metodo di scelta per l'analisi optogenetica della connettività funzionale a lungo raggio10,11,17,18. Le iniezioni stereotassiche offrono la possibilità di indirizzare con precisione una specifica area del cervello. La coespressione di un opsino con un reporter fluorescente permette co...

La definizione della connettività tra le regioni del cervello è necessaria per comprendere i circuiti neurali. I classici metodi di tracciamento anatomico consentono di stabilire la connettività interregionale e gli studi di lesione aiutano a comprendere l'organizzazione gerarchica del flusso di informazioni. Ad esempio, i circuiti cerebrali per l'orientamento spaziale e la segnalazione della direzione della testa coinvolgono il flusso direzionale di informazioni dal talamo al presubiculum. Ciò è stato dimostrato da studi di lesioni di nuclei talamici cioco-dorsalici (ADN) che degradano il segnale di direzione della testa nel presubiculum dorsale a valle, così come il segnale della rete della griglia paraippocampale1,2.
La connettività funzionale tra le aree del cervello è più difficile da stabilire a livello cellulare e subcellulare. Nell'ippocampo, un'anatomia altamente organizzata permette di studiare le connessioni sinaptiche specifiche del percorso utilizzando la simulazione elettrica nella preparazione della fetta. Gli elettrodi di stimolazione collocati nel radiato stratificato di CA1 possono essere utilizzati specificamente per stimolare l'input collaterale di Schaffer da CA33. Stimolando gli elettrodi collocati nella molecolare di lacunoso stratificante di CA1 attiverà l'ingresso del percorso perforante a CA14,5. La stimolazione elettrica attiva il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali assoni; tuttavia, attiva i neuroni con somata vicino al sito di stimolazione e assoni di passaggio. È quindi di uso limitato per studiare gli afferenti da regioni cerebrali definite quando le fibre di diverse regioni di origine si mescolano nella struttura bersaglio, come è tipicamente il caso nella neocorteccia.
I neuroni possono anche essere stimolati con la luce. I metodi ottici includono la fotoattivazione del glutammato in gabbia, che può essere combinato con la scansione laser a uno o due fotoni. Più siti strettamente distanziati possono essere stimolati in sequenza, senza danni meccanici al tessuto6. Questo è stato utilizzato con successo per mappare i recettori sinaptici così come attivare i singoli neuroni7. Mentre lo sblocco del glutammato può essere utilizzato per l'analisi del circuito locale, non consente l'attivazione specifica di input a lungo raggio.
Un metodo di scelta per lo studio della connettività a lungo raggio nei circuiti neuronali è l'uso dell'espressione channelrhodopsin mediata da virus. Utilizzando iniezioni stereotassiche in vivo come descritto qui, l'espressione dei canali ionici illuminati può essere mirata e limitata spazialmente a una regione del cervello desiderata. In questo modo, le channelrhodopsins sono efficaci per mappare la connettività eccitatoria o inibitoria da una regione al suo obiettivo. I terminali degli assoni transettati possono essere stimolati con la luce nella preparazione di una fetta di cervello, e le registrazioni patch-clamp come una lettura consente l'esame delle funzioni e dei punti di forza di specifici componenti del circuito nel cervello8. L'approccio optogenetico combinato con l'iniezione stereotassica di un virus offre una specificità senza precedenti e il controllo genetico9. La stimolazione con la luce consente inoltre un'elevata precisione temporale che spaziale10,11.
Il presubiculum è una struttura corticale a sei strati alla transizione dell'ippocampo e della formazione para-ippocampale12,13. Riceve un importante input sinaptico dall'ADN11 ma anche da diverse altre regioni corticali e subcorticali14. Pertanto, la stimolazione selettiva dei terminali degli assoni talamici all'interno di una fetta presubicolare non è possibile con la stimolazione elettrica né con lo sblocco del glutammato. Descritto in questo protocollo sono metodi per determinare la connettività funzionale tra le regioni del cervello (ADN e presubiculum) utilizzando precise iniezioni stereotassiche di vettori virali che esprimono canali illuminati. È stata descritta anche la fotostimolazione dei terminali degli assoni dei neuroni proiettanti nella loro regione bersaglio, insieme alle registrazioni a morsetto a tutta cellula dei neuroni post-sinaptici nella preparazione delle fette cerebrali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:927px;" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.5 mm bur&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">724962</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10 &#181;L Hamilton syringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">1701 RN - 7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X PBS solution</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">AM9624</td>
			<td>&#160;text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">36% PFA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">470 nm LED&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">P1105/470/LED&#160; DC/59022m</td>
			<td style="width:365px;">use with matched excitation filter 470/40x&#160; and emission filter for GFP&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-5-PV3446</td>
			<td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">All chemicals</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bath temperature controler</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM7</td>
			<td>Set at 34&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">beveled metal needle</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">7803-05</td>
			<td>33 gauge, 13mm, point style 4-20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Big scissors</td>
			<td style="width:183px;">Dahle Allround</td>
			<td style="width:136px;">50038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Biocytin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B4261</td>
			<td>final 1-3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:183px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">GC150-10</td>
			<td>1.5 mm outer, 0.86 inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Brown Flaming electrode puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;">P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BupH Phosphate Buffered Saline pack</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">butterfly needle for perfusion</td>
			<td style="width:183px;">Braun&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Venofix A</td>
			<td>24G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:136px;">DL-604M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;">LSM710</td>
			<td>20X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">curved forceps</td>
			<td style="width:183px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11011-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">CY5 configuration (confocal)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">CY5 configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">DAPI configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digital handheld optical meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Parametered on 475 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Double egde stainless steel razor blades</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:136px;">72000</td>
			<td>Use half of the blade in the slicer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dual Fluorescent Protein Flashlight</td>
			<td style="width:183px;">Nightsea</td>
			<td style="width:136px;">DFP-1</td>
			<td style="width:365px;">excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">EGTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E4368</td>
			<td>final 0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">Eclipse TE-2000E</td>
			<td>10 or 20X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fluoro-Ruby 10%</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">AG335</td>
			<td>disolve 10 mg in 100 &#181;l of distilled water ; inject 150 to 300 nl</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">GFP configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heatingplate</td>
			<td style="width:183px;">Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">HP4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heparin choay 5000 U.I./ml</td>
			<td style="width:183px;">Sanofi</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:183px;">Foredom</td>
			<td style="width:136px;">K.1070</td>
			<td>maximum drill speed 38,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Internal solution compounds :</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:136px;">2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P4504</td>
			<td>final 1,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketamine 1000</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketofen 10%</td>
			<td style="width:183px;">Merial</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>100 mg/ml : dilute 1 &#181;l in 1ml total (0,1%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laocaine (lidocaine)</td>
			<td style="width:183px;">MSD</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LED hi power spot for surgery</td>
			<td>Photonic (via Phymep)</td>
			<td style="width:136px;">10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">LED Power Supply</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">OptoLED Light Source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Manipulators</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mg-ATP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9187</td>
			<td>final 4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MgCl2</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">63069</td>
			<td>final 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro temperature controler</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">MTC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Milk powder</td>
			<td style="width:183px;">Carnation</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na Phosphocreatine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7936</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na3-GTP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G9002</td>
			<td>final 0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">needle holder/hemostat</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">pClamp acquisition software</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">Minipuls 3</td>
			<td>14-16 on the display for 2-3 ml/min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium gluconate (K-gluconate)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G4500</td>
			<td>Final 135 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">ProLong Gold antifade mounting medium</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P36390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rompun 2% (xylazine)</td>
			<td style="width:183px;">Bayer</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">small scissors</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride 0.9%&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dilute 8.5 mL in 10 ml total</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope VISISCOPE SZT</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">630-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotaxic frame with digital display</td>
			<td style="width:183px;">Kopf</td>
			<td style="width:136px;">Model 940</td>
			<td>Small animal stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:136px;">434315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy5 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">S32357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Superglue3 Loctite</td>
			<td style="width:183px;">Dutscher</td>
			<td style="width:136px;">999227</td>
			<td>1g tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">F3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:183px;">kdScientific</td>
			<td>Legato 130 - 788130</td>
			<td>Use Infuse and Withdraw modes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">VT1200S</td>
			<td>speed 0.07, amplitude 1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">tubing</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F117942, F117946</td>
			<td>Yellow/Black, Purple/Black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">upright microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Versi-dry bench absorbant paper</td>
			<td style="width:183px;">Nalgene</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices

La conoscenza della connettività sinaptica specifica di tipo cellulare è un prerequisito fondamentale per comprendere i circuiti neuronali a livello di cervello. Lo studio funzionale delle connessioni a lungo raggio richiede registrazioni mirate di singoli neuroni combinati con la stimolazione specifica di input distanti identificati. Questo è spesso difficile da ottenere con tecniche di stimolazione convenzionali ed elettriche, perché gli assoni provenienti da aree cerebrali a monte convergenti possono mescolarsi nella regione bersaglio. Il targeting stereotassico di una regione cerebrale specifica per l'espressione mediata da virus dei canali ionici sensibili alla luce consente una stimolazione selettiva degli assoni provenienti da quella regione con la luce. Le iniezioni stereotassiche intracerebrali possono essere utilizzate in strutture ben delimitate, come i nuclei talamici anteriori, oltre ad altre aree subcorticali o corticali in tutto il cervello.
Descritto qui è un insieme di tecniche per l'iniezione stereotassica precisa di vettori virali che esprimono channelrhodopsin nel cervello del topo, seguita da fotostimolazione dei terminali assoni nella preparazione della fetta del cervello. Questi protocolli sono semplici e ampiamente applicabili. In combinazione con la registrazione di morsetto di cervo a tutta cellula da un neurone postsynaptaptically collegato, la fotostimolazione degli assoni consente il rilevamento di connessioni sinaptiche funzionali, la caratterizzazione farmacologica e la valutazione della loro forza. Inoltre, il riempimento della biocitina del neurone registrato può essere utilizzato per l'identificazione morfologica post-hoc del neurone post-sinaptico.

La procedura qui presentata è stata utilizzata per esprimere una channelrhodopsin (Chronos) blu sensibile alla luce fusa alla GFP nel nucleo antero-dorsale del talamo (ADN), mediante iniezione stereotassica di virus anterogrado adeno-associato. Le coordinate stereotassiche sono state determinate secondo un atlante cerebrale del topo e testate iniettando 200 nL di fluoro-ruby fluorescente. L'animale è stato sacrificato 10 min dopo l'iniezione, e il cervello è stato estratto e fissato durante la notte. Le sezioni cerebr...

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In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Lo scopo di questo metodo è identificare la connettività funzionale degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando la fotostimolazione nelle fette cerebrali. Il targeting stereotassico di una specifica regione cerebrale per varie espressioni mediate di canali ionici sensibili alla luce consente la stimolazione selettiva di assoni provenienti da quella regione con la luce. A dimostrare la procedura sarà Louis Richevaux, un dottorando del mio gruppo.Prima dell'intervento chirurgico, verificare che l'animale sia ben anestetizzato con un dito del piedi. Estrarre delicatamente la lingua per facilitare la respirazione. Quindi, radersi i capelli cranici.Iniettare 20 microlitri di cloridrato di lidocaina sotto la pelle della testa per l'anestesia locale e attendere cinque minuti. Per esporre il cranio, fai un taglio sul cuoio capelluto. Quindi, posizionare l'animale in una cornice stereotassica.Inserire le barre dell'orecchio e appoggiarle sulle ossa leggermente rostrali alle orecchie e tirare giù la pelle per creare un buon accesso al cranio. Stringere le barre dell'orecchio e installare il nasello. Mantenere il corpo dell'animale orizzontalmente e a livello della testa utilizzando un supporto regolato in altezza.Posizionare una pastiglia riscaldante sotto l'animale per mantenerla a temperatura fisiologica. Quindi pulire il cranio applicando lo 0,9% di cloruro di sodio con un batuffolo di cotone per rimuovere i tessuti molli. Regolare il cranio in modo che l'accesso alla bregma lambda sia livellato.Quindi, individuare il sito di iniezione sul cranio in base alle coordinate posteriori e mediali e posizionare l'ago di iniezione sopra di esso. Segna il cranio con un ago usa e getta. Successivamente, spostare l'ago di iniezione verso l'alto di quattro centimetri.Utilizzando una bava di 0,5 millimetri, creare una craniotomia di un millimetro di diametro sul segno a metà della velocità massima. Tampone con un tessuto in caso di sanguinamento. Quindi, svuotare l'acqua contenuta nella siringa Hamilton per la conservazione espellendola completamente con una pompa.Solo l'ago è pieno d'acqua. Scongelare la soluzione virale da iniettare sul ghiaccio, quindi rimuoverla brevemente dal ghiaccio e ottenere 700 nanolitri della soluzione con una micropipetta. Quindi, deposita una goccia su un pezzo di pellicola di paraffina.Posizionare il film di paraffina sopra la craniotomia. Immergere l'ago nella goccia di soluzione virale senza cambiare l'anteroposterior e la posizione laterale. Successivamente, utilizzare la funzione di ritiro della pompa per riempire la siringa con circa 500 nanolitri della soluzione virale sul film di paraffina.Eseguire questa procedura sotto lo stereoscopio, guardare la goccia scomparire e assicurarsi di non aspirare aria. Assicurarsi che la siringa sia stata riempita correttamente. Testare il sistema di espulsione guidando verso il basso lo stantuffo per testare espellere una piccola goccia di liquido.Successivamente, inserire l'ago nel cervello alla profondità scelta. Premere il pulsante esegui per l'iniezione. Quindi, ritirare lentamente l'ago per tre o cinque minuti.Lavare immediatamente l'ago in acqua distillata pulita riempiendolo più volte per evitare l'intasamento. Successivamente, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico. Suturare la pelle e fare tre o quattro punti legati con 2-1-1 nodi chirurgici standard.Per estrarre il cervello, fare un taglio sulla pelle dal collo al naso, quindi sessare le ultime vertebre dal cranio con le forbici. Ritrarre la pelle e tagliare il cranio lungo la linea mediana dalla direzione caudale a quella rostrale. Rimuovere con cura l'osso parietale e la parte caudale dell'osso frontale.Estrarre il cervello con una piccola spatola arrotondata inserendolo tra il cervello e il pavimento cranico, separando il bulbo olfattivo, il nervo ottico e altri nervi cranici e cervelletto. Immergere delicatamente il cervello in una soluzione di taglio a freddo ghiacciato. Successivamente, trasferire il cervello su una carta da filtro e asciugare delicatamente la superficie corticale.Incollare la corteccia cerebrale al portacampioni di un vibratoma con il lato caudale rivolto verso la lama al fine di tagliare le fette cerebrali orizzontali. Quindi, riempire la camera di taglio con una soluzione di taglio ossigenata ghiacciata in modo che il cervello sia completamente immerso. Sezione 300 micrometri fette spesse con il vibratoma ad una velocità di 07 millimetri al secondo ad un'ampiezza millimetra.In questa fase, si consiglia di controllare brevemente l'espressione Chronos-GFP nel talamo utilizzando una torcia fluorescente e i corrispondenti occhiali filtranti. Per eseguire la registrazione patch-clamp a celle intere, trasferire delicatamente una fetta cerebrale contenente il complesso ippocampale alla camera di registrazione. Perfonde continuamente la camera di registrazione con 34 gradi Celsius ACSF bolleto con carbogeno a due o tre millilitri al minuto.Esaminare brevemente l'espressione Chronos-GFP nei terminali axon nella regione di interesse con illuminazione a LED blu con ingrandimento 4X. Passare a un obiettivo di immersione 63X e regolare la messa a fuoco. Verificare la presenza di assoni che esprimono Chronos-GFP e scegliere un neurone piramidale per la registrazione delle patch.Quindi, riempire una pipetta con soluzione interna a base di gluconato di potassio. Montarlo nel supporto della pipetta sul palco della testa. Applicare patch alla cella nella configurazione del morsetto di tensione.Avvicinati al neurone identificato e premi delicatamente la punta della pipetta sul soma. La pressione positiva dovrebbe produrre una fossette sulla superficie della membrana. Quindi, rilasciare la pressione per creare una guarnizione gigoOm.Una volta sigillata, impostare la tensione di tenuta su meno 65 millivolt. Rompere la membrana con un forte impulso di pressione negativa. Registrare le risposte del neurone ai passaggi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti in modalità clamp di corrente intera cellulare.Registrare nelle risposte postsinaptiche del morsetto di corrente o tensione alla stimolazione a led a led da 475 nanometri di fibre afferenti che esprimono Chronos. Stimolare con treni di dieci stimolazioni della durata di due millisecondi a 20 hertz. L'attività dei neuroni presubicolari nello strato tre in risposta ai passaggi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti è stata registrata nella configurazione patch-clamp a cellule intere.Stimolando i terminali di assone ADN che esprimono Chronos-GFP ha suscitato potenziali eccitatori post-sinaptici nello strato presubicolare tre cellule principali in modalità clamp corrente. A seconda dell'intensità della luce, gli EPS potrebbero raggiungere la soglia potenziale d'azione. Le risposte post-sinaptiche sono state osservate anche in modalità clamp di tensione, poiché sono state suscitate correnti eccitatorie post-sinaptiche.Qui è mostrato uno strato tre neuroni piramidali circondati da assoni talamici che esprimono Chronos-GFP in strati superficiali presubicolari con colorazione DAPI immagine con un microscopio a epifluorescenza. E questa immagine è stata scattata ad un ingrandimento più elevato con un microscopio confocale. Un attento livellamento del bregma lungo l'asse nell'esecuzione di esperimenti pilota con un tracciante fluorescente è fondamentale per migliorare la precisione dell'iniezione stereotassica.Questa procedura può anche essere utilizzata per indagare proiezioni convergenti da aree diverse iniettando in due scene generative sensibili a due diverse lunghezze d'onda. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso una precisa analisi anatomica e funzionale del circuito tra regioni cerebrali distanti in modo specifico di tipo cellulare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

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