Name: in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

私たちは、ベルトラン・マトン、メリー・ナサール、Li-Wen Huang、ジャン・サイモンネットが、ステレオタキシック注射プロトコルの以前のバージョンの開発に協力し、マリン・マヌエルとパトリス・ジェグーゾに技術的な助けを与えてくださったことに感謝します。この研究は、フランスの教育研究省(L.R.、L.S.)、センター・ナショナル・デ・エチュード・スプライス(M.B.)、アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レヒャーチェ・<span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">グラントANR-18-CE92-0051-01(D.F.)によって支援されました。

すべての手順は、欧州共同体理事会指令(2010/63/EU)に従って行われ、パリデカルト大学の倫理委員会によって承認されました。実験者は、現地の規制に準拠するための手順の承認を取得する必要があります。
1. 実験の計画
<ol><li>標的とする脳領域を定義します。マウス脳アトラス15の助けを借りて、注射部位の立体座標を決定する。右のアンテロドーサ?...

<ol>
	<li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity.">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li><li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal.">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), 870-874 (2015).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I(h).">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li><li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li><li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat.">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li><li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulating+neurons+with+light.">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li><li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex.">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li><li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum.">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032 (2017).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex.">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li><li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na++current.">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).</li><li>Simonnet, J., Eug&#232;ne, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum.">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li><li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system.">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Huang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus,+Thalamus,+or+Medial+Entorhinal+Cortex.">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons.">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex.">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies.">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li></ol>

定義された脳領域で光感受性オプシンを発現する生体内ウイルス注射は、長距離機能的接続性10、11、17、18の光遺伝学的分析のための選択方法である。ステレオタキシック注射は、正確に脳の特定の領域をターゲットにする可能性を提供します.蛍光レポーターとのオプシンの共発現は、成功した?...

神経回路を理解するには、脳領域間の接続性を定義する必要があります。古典的な解剖学的トレース方法は、地域間接続を確立することを可能にし、病変研究は情報フローの階層的な組織を理解するのに役立ちます。例えば、空間的な向きと頭方向シグナリングのための脳回路は、視床から前亜皮への情報の方向流れを伴う。これは、下流の後部前subiculumにおける頭部方向信号を劣化させるアンテロドーサルタラミック核(ADN)の病変研究、ならびに海馬グリッド細胞信号1、2によって実証されている。
脳領域間の機能的な接続性は、細胞レベルと細胞内レベルで確立することがより困難です。海馬では、高度に組織化された解剖学により、スライス調製中の電気シミュレーションを使用して経路特異的シナプス接続を調べることができる。CA1の地層ラジエータムに配置された刺激電極は、CA333からのシャファー担保入力を特異的に刺激するために使用することができる。CA1の層ラクノサム分子に置かれた電極を刺激すると、CA14,5への穿開経路入力が活性化する。電気刺激はアクソン端子からの神経伝達物質の放出を活性化します。しかし、 刺激部位の近くにソマタを持つニューロンと通路の軸が活性化します。したがって、ネオコルテックスの場合と同様に、起源の異なる領域の繊維が標的構造内で混ざり合う場合、定義された脳領域からのアフェレントを研究するための使用は限られています。
ニューロンはまた、光で刺激されてもよいです.光学的方法には、ケージ付きグルタミン酸の光活性化が含まれており、これは1つまたは2つの光子レーザー走査と組み合わせることができる。複数の密接に間隔をあけた部位は、組織6に機械的損傷を与えなく、順次刺激されてもよい。これは、シナプス受容体をマッピングするだけでなく、個々のニューロン7を活性化するために正常に使用されています.グルタミン酸アンカシングは局所回路解析に使用できますが、長距離入力の特定の活性化は許可されません。
神経回路における長距離接続性の調査のための選択の方法は、ウイルス媒介性チャネルロドプシン発現の使用である。ここで説明するように生体内立体注射を用いて、光ゲートイオンチャネルの発現を標的とし、所望の脳領域に空間的に制限することができる。このように、チャネルロドプシンは、ある領域からその標的に興奮性または阻害性の接続性をマッピングするのに有効である。トランスフェクトされた軸子末端は、脳スライス調製中の光で刺激され、脳内の特定の回路成分の機能および強度を調べることができるように読み出しとしてパッチクランプ記録を行う。ウイルスの立体注射と組み合わせた光遺伝学的アプローチは、前例のない特異性と遺伝的制御9を提供しています。光で刺激することはさらに高い時間的および空間的な精密10、11を可能にする。
従属体は、海馬および海馬形成12,13の遷移における6層皮質構造である。これは、ADN11からだけでなく、いくつかの他の皮質および皮質下領域14から重要なシナプス入力を受け取ります。従って、前subasubs内のタラミック軸線端子の選択的刺激は、電気刺激またはグルタミン酸の無加分化では不可能である。このプロトコルに記載されているのは、光ゲートチャネルを発現するウイルスベクターの正確な立体注射を用いて脳領域(ADNおよび従属体)間の機能的接続性を決定する方法である。また、標的領域にニューロンを投影する軸子末端の光刺激と、脳スライス調製におけるシナプス後ニューロンの全細胞パッチクランプ記録についても説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:927px;" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.5 mm bur&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">724962</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10 &#181;L Hamilton syringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">1701 RN - 7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X PBS solution</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">AM9624</td>
			<td>&#160;text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">36% PFA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">470 nm LED&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">P1105/470/LED&#160; DC/59022m</td>
			<td style="width:365px;">use with matched excitation filter 470/40x&#160; and emission filter for GFP&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-5-PV3446</td>
			<td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">All chemicals</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bath temperature controler</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM7</td>
			<td>Set at 34&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">beveled metal needle</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">7803-05</td>
			<td>33 gauge, 13mm, point style 4-20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Big scissors</td>
			<td style="width:183px;">Dahle Allround</td>
			<td style="width:136px;">50038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Biocytin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B4261</td>
			<td>final 1-3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:183px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">GC150-10</td>
			<td>1.5 mm outer, 0.86 inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Brown Flaming electrode puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;">P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BupH Phosphate Buffered Saline pack</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">butterfly needle for perfusion</td>
			<td style="width:183px;">Braun&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Venofix A</td>
			<td>24G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:136px;">DL-604M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;">LSM710</td>
			<td>20X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">curved forceps</td>
			<td style="width:183px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11011-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">CY5 configuration (confocal)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">CY5 configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">DAPI configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digital handheld optical meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Parametered on 475 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Double egde stainless steel razor blades</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:136px;">72000</td>
			<td>Use half of the blade in the slicer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dual Fluorescent Protein Flashlight</td>
			<td style="width:183px;">Nightsea</td>
			<td style="width:136px;">DFP-1</td>
			<td style="width:365px;">excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">EGTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E4368</td>
			<td>final 0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">Eclipse TE-2000E</td>
			<td>10 or 20X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fluoro-Ruby 10%</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">AG335</td>
			<td>disolve 10 mg in 100 &#181;l of distilled water ; inject 150 to 300 nl</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">GFP configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heatingplate</td>
			<td style="width:183px;">Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">HP4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heparin choay 5000 U.I./ml</td>
			<td style="width:183px;">Sanofi</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:183px;">Foredom</td>
			<td style="width:136px;">K.1070</td>
			<td>maximum drill speed 38,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Internal solution compounds :</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:136px;">2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P4504</td>
			<td>final 1,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketamine 1000</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketofen 10%</td>
			<td style="width:183px;">Merial</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>100 mg/ml : dilute 1 &#181;l in 1ml total (0,1%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laocaine (lidocaine)</td>
			<td style="width:183px;">MSD</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LED hi power spot for surgery</td>
			<td>Photonic (via Phymep)</td>
			<td style="width:136px;">10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">LED Power Supply</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">OptoLED Light Source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Manipulators</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mg-ATP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9187</td>
			<td>final 4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MgCl2</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">63069</td>
			<td>final 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro temperature controler</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">MTC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Milk powder</td>
			<td style="width:183px;">Carnation</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na Phosphocreatine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7936</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na3-GTP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G9002</td>
			<td>final 0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">needle holder/hemostat</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">pClamp acquisition software</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">Minipuls 3</td>
			<td>14-16 on the display for 2-3 ml/min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium gluconate (K-gluconate)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G4500</td>
			<td>Final 135 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">ProLong Gold antifade mounting medium</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P36390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rompun 2% (xylazine)</td>
			<td style="width:183px;">Bayer</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">small scissors</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride 0.9%&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dilute 8.5 mL in 10 ml total</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope VISISCOPE SZT</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">630-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotaxic frame with digital display</td>
			<td style="width:183px;">Kopf</td>
			<td style="width:136px;">Model 940</td>
			<td>Small animal stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:136px;">434315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy5 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">S32357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Superglue3 Loctite</td>
			<td style="width:183px;">Dutscher</td>
			<td style="width:136px;">999227</td>
			<td>1g tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">F3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:183px;">kdScientific</td>
			<td>Legato 130 - 788130</td>
			<td>Use Infuse and Withdraw modes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">VT1200S</td>
			<td>speed 0.07, amplitude 1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">tubing</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F117942, F117946</td>
			<td>Yellow/Black, Purple/Black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">upright microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Versi-dry bench absorbant paper</td>
			<td style="width:183px;">Nalgene</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices

細胞型特異的シナプス結合の知識は、脳全体の神経回路を理解するための重要な前提条件である。長距離接続の機能的調査では、特定された遠隔入力の特定の刺激と組み合わせた単一ニューロンの標的を絞った記録が必要です。上流の脳領域を収束させる軸が標的領域に混入する可能性があるため、従来の電気刺激技術では実現が困難な場合が多い。光感受性イオンチャネルのウイルス媒介発現のための特定の脳領域の立体標的は、光でその領域から発信された軸ゾンの選択的刺激を可能にする。脳内立体注射は、脳全体の他の皮質下または皮質領域に加えて、前視体核などの十分に区切られた構造で使用することができる。
ここでは、マウス脳中のチャネルロドプシンを発現するウイルスベクターの正確な立体注射のための技術のセットであり、続いて脳スライス調製における軸線末端の光刺激を行う。これらのプロトコルはシンプルで広く適用可能です。シナプス後に接続されたニューロンからの全細胞パッチクランプ記録と組み合わせることで、軸子の光刺激は、機能的シナプス接続の検出、薬理学的特性評価、および強度の評価を可能にします。さらに、記録されたニューロンのバイオシチン充填は、後のシナプス後ニューロンのポストホック形態学的同定に使用することができる。

ここで提示される手順は、視床(ADN)の前歯核(ADN)でGFPに融合した青色光感受性チャネルロドプシン(Chronos)を発現するために用いられた。立体座標はマウス脳アトラスに従って決定し、蛍光トレーサーフルオロルビーの200 nLを注入することによって試験した。動物は注射の10分後に犠牲になり、脳を一晩抽出して固定した。冠状脳切片は、正しく配置され、ADNに限定された注射部位を調べるため?...

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In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

このプロトコルは、ex vivo脳スライスにおける光遺伝学的刺激を用いて、遠方の脳領域からの長距離入力の細胞型特異的機能的接続性を同定する一連の方法を説明する。

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

この方法の目的は、脳スライスにおける光刺激を用いて、遠くの脳領域からの長距離入力の機能的な結合性を同定することである。光感受性イオンチャネルの様々な媒介発現のための特定の脳領域の立体的標的化は、光でその領域から来る軸索の選択的刺激を可能にする。この手順をデモンストレーションすることは、私のグループの博士課程の学生、ルイ・リシュヴォーです。手術前に、動物がつま先ピンチで十分に麻酔されていることを確認してください。呼吸を容易にするために舌をそっと引き出す。次に、頭蓋毛を剃ります。局所麻酔のために頭の皮膚の下に塩酸リドカインの20マイクロリットルを注入し、5分待ちます。頭蓋骨を露出するには、頭皮に切り傷を付けます。次に、動物を立体的なフレームに入れる。イヤーバーを挿入し、耳にわずかにrostral骨の上にそれらを休ませ、頭蓋骨への良好なアクセスを作成するために皮膚を引き下げます。イヤーバーを締めて、鼻の部分を取り付けます。高さ調節されたサポートを使用して、動物の体を水平に、そして頭部のレベルで維持する。動物の下に加熱パッドを置き、生理学的温度に保ちます。その後、軟部組織を除去するために綿棒で0.9%塩化ナトリウムを適用することによって頭蓋骨をきれいにします。ブレグマラムダアクセスが平準化されるように頭蓋骨を調整します。次に、後部および内側の座標に従って頭蓋骨上の注射部位を見つけ、その上に注射針を置く。使い捨て針で頭蓋骨をマークします。続いて注射針を4センチ上に動かします。0.5ミリのバリを使用して、最高速度の半分でマークに直径1ミリメートルの開頭術を作成します。出血が起こった場合、組織で綿棒。次に、ハミルトンの注射器に含まれる水を空にして、ポンプで完全に排出して保管します。針だけが水で満たされています。氷上に注入されるウイルス溶液を解凍し、その後、氷から簡単に除去し、マイクロピペットで溶液の700ナノリットルを得る。次に、パラフィンフィルムの一部に滴を堆積する。パラフィンフィルムを頭蓋骨切り出しの上に置きます。前部および横方向の位置を変えずに、ウイルス溶液の滴に針を突き落とす。その後、ポンプの引き出し機能を使用して、パラフィンフィルム上の約500ナノリットルのウイルス溶液をシリンジに充填する。ステレオスコープの下でこの手順を実行し、落下が消えるのを見て、空気を吸引しないようにしてください。注射器が正しく充填されていることを確認します。プランジャーを下ろして、液体の小さな滴を排出テストして、排出システムをテストします。その後、選択した深さに脳に針を挿入します。インジェクションの実行ボタンを押します。その後、3〜5分以上ゆっくりと針を引き出します。目詰まりを避けるために、数回空に充填することによって、すぐにきれいな蒸留水で針を洗います。その後、ステレオタキシックフレームから動物を取り除きます。皮膚を縫合し、2-1-1標準外科結び目で結ばれた3つまたは4つのステッチを作ります。脳を抽出するには、首から鼻まで皮膚を切り取り、頭蓋骨から最後の椎骨をはさみで切り離します。皮膚を引き込み、正中線から鼻の方向に頭蓋骨をカットします。頭頂骨と前頭骨の尾骨部分を慎重に取り除きます。脳と頭蓋床の間に挿入し、嗅球、視神経、その他の脳神経や小脳を切り離すことによって、小さな丸みを帯びたへらで脳を抽出します。氷冷切断液で脳を穏やかに沈めます。その後、脳を濾紙に移し、皮質表面を静かに乾燥させます。水平脳スライスをカットするために、ブレードに面した尾骨側を持つビブラートームの標本ホルダーに脳皮質を接着します。次に、脳が完全に沈み込むように、氷冷酸素切断溶液で切断室を満たします。1ミリメートルの振幅で毎秒07ミリメートルの速度でビブラードームとのセクション300マイクロメートル厚いスライス。この段階では、蛍光懐中電灯とそれに対応するフィルターグラスを使用して視床のクロノス-GFP発現を簡単に確認することをお勧めします。全細胞パッチクランプ記録を行うために、海馬複合体を含む脳スライスを記録チャンバーに静かに移す。連続して34°C ACSFで録音チャンバーを1分あたり2〜3ミリリットルでカルボーゲンで泡立てる浸透。関心領域の軸索端子におけるクロノス-GFPの発現を、4倍の青色のLED照明で簡単に調べます。63倍の浸漬目標に変更し、フォーカスを調整します。クロノス-GFPを表現する軸索を確認し、パッチ記録用のピラミッド型ニューロンを選択します。次に、ピペットにグルコン酸カリウムベースの内部溶液を充填します。ヘッドステージのピペットホルダーに取り付けます。電圧クランプ構成でセルにパッチを当てる。特定されたニューロンにアプローチし、繊細にソーマにピペットの先端を押します.正圧は膜表面にディンプルを生じるはずです。次に、圧力を解放してgigoOmシールを作成します。密封したら、保持電圧をマイナス65ミリボルトに設定します。負圧の鋭いパルスで膜を壊します。全細胞電流クランプモードで過分極および脱分極電流ステップに対するニューロンの応答を記録します。クロノスを発現する発泡繊維の475ナノメートルLED全野原刺激に対する電流または電圧クランプポストナプティクス応答で記録します。20ヘルツで2ミリ秒の持続時間の10の刺激の列車で刺激します。超分極および脱分極電流ステップに応答した層3におけるサブラーニューロンの活性を、全細胞パッチクランプ構成に記録した。クロノス-GFPを発現する刺激ADN軸索末端は、現在のクランプモードにおけるサブラー層3主細胞における興奮性シナプス後電位を引き出した。光の強度に応じて、Epsはアクションの潜在的なしきい値に達する可能性があります。興奮性シナプス後電流が引き出されたように、ポストシナプス応答は電圧クランプモードでも観察された。ここに示されているのは、表皮顕微鏡で画像化されたDAPI染色を用いたサブ濾過前の表面層でクロノスGFPを発現する視床軸索に囲まれた3つの錐体ニューロンである。そして、この画像は、共焦点顕微鏡でより高い倍率で撮影されました。蛍光トレーサによるパイロット実験を行う際には、軸に沿ったブレグマの慎重なレベリングは、立体的注入の精度を向上させるために重要です。この手順は、2つの異なる波長に敏感な2つの生成シーンに注入することによって、異なる領域からの収束投影を調査するためにも使用できます。この技術の開発により、細胞型特有の方法で遠くの脳領域間の正確な解剖学的および機能的回路解析が可能になった。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...