Name: in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Мы благодарим Бертрана Матона, Мери Нассара, Ли-Вэнь Хуанга и Джина Симоннет за помощь в разработке предыдущих версий протокола стереотаксических инъекций и Марин Мануэль и Патрис аджегузо за техническую помощь. Эта работа была поддержана Французским министерством образования и исследований (L. R., L. S.), Национальным центром Этюдес Spatiales (M. B.), и Национальным agence de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (Д. Ф.).

Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейского сообщества (2010/63/EU) и одобрены комитетом по этике Парижского университета Декарта. Экспериментатор должен получить разрешение на соблюдение правил, установленных местными правилами.
1. Планиров...

<ol>
	<li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity.">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li><li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal.">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), 870-874 (2015).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I(h).">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li><li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li><li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat.">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li><li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulating+neurons+with+light.">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li><li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex.">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li><li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum.">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032 (2017).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex.">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li><li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na++current.">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).</li><li>Simonnet, J., Eug&#232;ne, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum.">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li><li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system.">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Huang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus,+Thalamus,+or+Medial+Entorhinal+Cortex.">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons.">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex.">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies.">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li></ol>

In vivo вирусная инъекция для выражения светочувствительных опсинов в определенной области мозга является методом выбора для оптогенетического анализа дальнего функционального подключения10,11,17,18. Стереотаксические ?...

Определение связи между областями мозга необходимо для понимания нейронных цепей. Классические методы анатомического отслеживания позволяют установить межрегиональную связь, а исследования поражений помогают понять иерархическую организацию информационного потока. Например, мозговые схемы для пространственной ориентации и сигнализации направления головы включают направленный поток информации от таламуса до пресубикула. Это было продемонстрировано исследования поражения антеро-дорсал саломных ядер (ADN), которые ухудшают сигнал направления головы в вниз по течению дорсальный presubiculum, а также парагиппокампальной сетки сигнала ячейки1,2.
Функциональную связь между областями мозга труднее установить на клеточном и субклеточном уровне. В гиппокампе, высокоорганизованная анатомия позволяет исследовать пути конкретных синаптические соединения с помощью электрического моделирования в срез подготовки. Стимулирующие электроды, помещенные в радиат сточки CA1, могут быть использованы специально для стимулирования ввода залога Schaffer от CA33. Стимулирующие электроды, помещенные в молекулярный слой лачуносума CA1, активируют перфорантный вход пути в CA14,5. Электрическая стимуляция активирует высвобождение нейромедиатора из аксонных терминалов; однако, он активирует нейроны с somata вблизи места стимуляции, а также аксоны прохода. Поэтому он имеет ограниченное применение для изучения афферентов из определенных областей мозга, когда волокна различных регионов происхождения перемешивается в целевой структуре, как это обычно бывает в неокортексе.
Нейроны также могут быть стимулированы светом. Оптические методы включают фотоактивацию глутамата в клетке, который можно комбинировать с одно- или двухфотонным лазерным сканированием. Несколько близко расположенных участков могут быть стимулированы последовательно, без механических повреждений ткани6. Это было успешно использовано для картирования синаптических рецепторов, а также активировать отдельные нейроны7. Хотя глутамат неприкосновения могут быть использованы для локального анализа цепи, это не позволяет для конкретной активации дальнего ввода.
Методом выбора для исследования дальнего подключения в нейронных цепях является использование вирусо-опосредованного выражения channelrhodopsin. Используя виво стереотаксические инъекции, описанные здесь, выражение световых ионных каналов может быть целенаправленным и пространственно ограничено желаемой областью мозга. Таким образом, channelrhodopsins эффективны для картирования возбуждающих или ингибирующих подключения из одного региона в свою цель. Трансинфицированные аксоны терминалы могут быть стимулированы светом в подготовке ломтик мозга, и патч-зажим записи как считывание позволяют изучить функции и сильные стороны конкретных компонентов цепи в мозге8. Оптогенетический подход в сочетании со стереотаксической инъекцией вируса предлагает беспрецедентную специфичность и генетический контроль9. Стимулирование со светом дополнительно позволяет как высокой временной и пространственной точности10,11.
Пресубикул является шестислойной корковой структурой при переходе гиппокампа и парагиппокампа формирования12,13. Он получает важный синаптический вход от ADN11, но и от нескольких других корковых и подкорковых областей14. Таким образом, селективная стимуляция таламических аксонов терминалов в пределах presubicular ломтик не представляется возможным с электрической стимуляции, ни глутамата uncaging. Описанные в этом протоколе методы для определения функциональной связи между областями мозга (ADN и presubiculum) с использованием точных стереотаксических инъекций вирусных векторов, выражающих световые каналы. Также описана фотостимуляция аксонов терминалов проецирования нейронов в их целевой области, в сочетании с цельноклеточными зажимными записями постсинаптических нейронов в подготовке среза мозга.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:927px;" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.5 mm bur&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">724962</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10 &#181;L Hamilton syringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">1701 RN - 7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X PBS solution</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">AM9624</td>
			<td>&#160;text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">36% PFA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">470 nm LED&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">P1105/470/LED&#160; DC/59022m</td>
			<td style="width:365px;">use with matched excitation filter 470/40x&#160; and emission filter for GFP&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-5-PV3446</td>
			<td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">All chemicals</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bath temperature controler</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM7</td>
			<td>Set at 34&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">beveled metal needle</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">7803-05</td>
			<td>33 gauge, 13mm, point style 4-20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Big scissors</td>
			<td style="width:183px;">Dahle Allround</td>
			<td style="width:136px;">50038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Biocytin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B4261</td>
			<td>final 1-3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:183px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">GC150-10</td>
			<td>1.5 mm outer, 0.86 inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Brown Flaming electrode puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;">P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BupH Phosphate Buffered Saline pack</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">butterfly needle for perfusion</td>
			<td style="width:183px;">Braun&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Venofix A</td>
			<td>24G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:136px;">DL-604M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;">LSM710</td>
			<td>20X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">curved forceps</td>
			<td style="width:183px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11011-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">CY5 configuration (confocal)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">CY5 configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">DAPI configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digital handheld optical meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Parametered on 475 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Double egde stainless steel razor blades</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:136px;">72000</td>
			<td>Use half of the blade in the slicer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dual Fluorescent Protein Flashlight</td>
			<td style="width:183px;">Nightsea</td>
			<td style="width:136px;">DFP-1</td>
			<td style="width:365px;">excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">EGTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E4368</td>
			<td>final 0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">Eclipse TE-2000E</td>
			<td>10 or 20X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fluoro-Ruby 10%</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">AG335</td>
			<td>disolve 10 mg in 100 &#181;l of distilled water ; inject 150 to 300 nl</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">GFP configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heatingplate</td>
			<td style="width:183px;">Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">HP4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heparin choay 5000 U.I./ml</td>
			<td style="width:183px;">Sanofi</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:183px;">Foredom</td>
			<td style="width:136px;">K.1070</td>
			<td>maximum drill speed 38,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Internal solution compounds :</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:136px;">2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P4504</td>
			<td>final 1,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketamine 1000</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketofen 10%</td>
			<td style="width:183px;">Merial</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>100 mg/ml : dilute 1 &#181;l in 1ml total (0,1%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laocaine (lidocaine)</td>
			<td style="width:183px;">MSD</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LED hi power spot for surgery</td>
			<td>Photonic (via Phymep)</td>
			<td style="width:136px;">10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">LED Power Supply</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">OptoLED Light Source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Manipulators</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mg-ATP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9187</td>
			<td>final 4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MgCl2</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">63069</td>
			<td>final 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro temperature controler</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">MTC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Milk powder</td>
			<td style="width:183px;">Carnation</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na Phosphocreatine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7936</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na3-GTP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G9002</td>
			<td>final 0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">needle holder/hemostat</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">pClamp acquisition software</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">Minipuls 3</td>
			<td>14-16 on the display for 2-3 ml/min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium gluconate (K-gluconate)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G4500</td>
			<td>Final 135 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">ProLong Gold antifade mounting medium</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P36390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rompun 2% (xylazine)</td>
			<td style="width:183px;">Bayer</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">small scissors</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride 0.9%&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dilute 8.5 mL in 10 ml total</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope VISISCOPE SZT</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">630-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotaxic frame with digital display</td>
			<td style="width:183px;">Kopf</td>
			<td style="width:136px;">Model 940</td>
			<td>Small animal stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:136px;">434315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy5 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">S32357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Superglue3 Loctite</td>
			<td style="width:183px;">Dutscher</td>
			<td style="width:136px;">999227</td>
			<td>1g tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">F3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:183px;">kdScientific</td>
			<td>Legato 130 - 788130</td>
			<td>Use Infuse and Withdraw modes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">VT1200S</td>
			<td>speed 0.07, amplitude 1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">tubing</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F117942, F117946</td>
			<td>Yellow/Black, Purple/Black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">upright microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Versi-dry bench absorbant paper</td>
			<td style="width:183px;">Nalgene</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices

Знание клеточного типа специфических синаптических связей является важнейшей предпосылкой для понимания нейронных цепей в масштабах всего мозга. Функциональное исследование соединений дальнего радиуса действия требует целевых записей одиночных нейронов в сочетании с специфической стимуляцией выявленных удаленных входов. Это часто трудно достичь с помощью обычных и электрических методов стимуляции, потому что аксоны от сходящихся вверх по течению областей мозга может смешение в целевой области. Стереотаксическая ориентация на конкретную область мозга для опосредованного вирусом выражения светочувствительных ионных каналов позволяет селективной стимуляции аксонов, происходящих из этой области со светом. Внутримозговые стереотаксические инъекции могут быть использованы в хорошо разграниченных структурах, таких как передние таламические ядра, в дополнение к другим подкорковышам или корковым областям по всему мозгу.
Описан освоен здесь набор методов для точного стереотаксической инъекции вирусных векторов, выражающих channelrhodopsin в мозге мыши, а затем фотостимуляция аксонтерминалов в подготовке ломтик мозга. Эти протоколы просты и широко применимы. В сочетании с цельноклеточной записи зажима патча с постсинаптически связанного нейрона, фотостимуляция аксонов позволяет обнаруживать функциональные синаптические связи, фармакологическую характеристику и оценивать их прочность. Кроме того, биоцитиновый наполнение записанного нейрона может быть использован для пост-специальной морфологической идентификации постсинаптического нейрона.

Процедура, представленная здесь, была использована для выражения синего светочувствительного канала (Chronos), слитого с GFP в антеро-дорсальном ядре таламуса (ADN), стереотаксической инъекцией антероградного адено-ассоциированного вируса. Стереотаксические координаты были определены в со?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Этот протокол описывает набор методов для определения клеточного типа специфического функционального подключения долгосрочных входов из отдаленных областей мозга с помощью оптогенетических стимуляций в ломтиках мозга ex vivo.

В Vivo интрацеребральные стереотаксические инъекции для оптогенетической стимуляции дальнобойных входов в mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Целью данного метода является выявление функциональной связи дальних входных данных из отдаленных областей мозга с использованием фотостимуляции в срезах мозга. Стереотаксис ориентации конкретной области мозга для различных опосредованное выражение светочувствительных ионных каналов позволяет селективной стимуляции аксонов, поступающих из этой области со светом. Демонстрация процедуры будет Луи Richevaux, аспирант из моей группы.Перед операцией убедитесь, что животное хорошо обезболено с щепоткой ноца. Аккуратно вытащите язык, чтобы облегчить дыхание. Затем побрить черепные волосы.Введать 20 микролитров лидокаина гидрохлорида под кожу головы для местной анестезии и ждать пять минут. Чтобы разоблачить череп, сделайте разрез на коже головы. Затем поместите животное в стереотаксис.Вставьте ушные батончики и покойте их на костях слегка ростральными к ушам и потяните вниз кожу, чтобы создать хороший доступ к черепу. Затяните ушные прутья и установите кусок носа. Поддерживайте тело животного горизонтально и на уровне головы с помощью поддержки с поправкой на высоту.Поместите грелку под животное, чтобы держать его при физиологической температуре. Затем очистите череп, применив 0,9% хлорида натрия с помощью ватного тампона для удаления мягких тканей. Отрегулируйте череп так, чтобы доступ к брегме лямбды выровнялся.Затем, найти место инъекции на черепе в соответствии с задней и медиальной координаты и положение инъекции иглы над ним. Отметь череп одноразовой иглой. Впоследствии переместит инъекцию иглы вверх на четыре сантиметра.Используя заусенцев диаметром 0,5 миллиметра, создайте краниотомию диаметром один миллиметр на отметке на половину максимальной скорости. Шваб с тканью, если есть кровотечение происходит. Затем опорожните воду, содержащуюся в шприце Гамильтона для хранения, полностью выбросив ее с помощью насоса.Только игла наполнена водой. Оттепель вирусного раствора, который будет вводиться на льду, затем, кратко удалить его из льда и получить 700 нанолитров раствора с микропипютой. Далее, депозит капли на кусок парафина пленки.Поместите парафиновую пленку поверх краниотомии. Окунитесь иглы в каплю вирусного раствора, не изменяя антеропостер и боковое положение. После этого используйте функцию снятия насоса, чтобы заполнить шприц около 500 нанолитров вирусного раствора на парафиновой пленке.Выполните эту процедуру под стереоскопом, наблюдайте, как капля исчезает, и убедитесь, что не аспирировать любой воздух. Убедитесь, что шприц был заполнен правильно. Проверьте систему выброса, съезжев с поршеня, чтобы проверить выброс небольшой капли жидкости.Впоследствии вставьте иглу в мозг на выбранную глубину. Нажмите кнопку запуска для инъекций. Затем медленно свямите иглу в течение трех-пяти минут.Немедленно вымойте иглу в чистой дистиллированной воде, заполнив опорожнив ее несколько раз, чтобы избежать засорения. После этого удалите животное из стереотаксиаической рамы. Шов кожи и сделать три или четыре стежка связаны с 2-1-1 стандартных хирургических узлов.Чтобы извлечь мозг, сделать разрез на коже от шеи до носа, а затем раздел последних позвонков из черепа с ножницами. Увядите кожу и вырежьте череп вдоль средней линии от каудала до рострального направления. Аккуратно удалите теменной кости и хвостовой части лобной кости.Извлекайте мозг с помощью небольшого округлого шпателя, вставив его между мозгом и черепным полом, разделив обонятельную лампу, зрительный нерв и другие черепные нервы и мозжечок. Аккуратно погрузите мозг в ледяной раствор для резки. Затем перенесите мозг на фильтровальную бумагу и аккуратно высушите корковую поверхность.Приклейте кору головного мозга к держателю образца вибромы с хвостовой стороной, обращенной к лезвию, чтобы сократить горизонтальные ломтики мозга. Далее, заполнить режущей камеры с ледяной кислородом резки раствора, чтобы мозг полностью immerged. Раздел 300 микрометров толщиной ломтиками с вибромой со скоростью 07 миллиметров в секунду при одной миллиметровой амплитуде.На этом этапе рекомендуется кратко проверить экспрессию Chronos-GFP в таламусе с помощью флуоресцентного фонарика и соответствующих очков фильтра. Для выполнения записи цельноклеточного патч-зажима, аккуратно перенесите ломтик мозга, содержащий комплекс гиппокампа, в камеру записи. Непрерывно пронизывая камеру записи с 34 градусами по Цельсию ACSF пузырились карбогеном на два-три миллилитров в минуту.Кратко изучите экспрессию Chronos-GFP в аксон-терминалах в области интереса с синим светодиодным освещением при увеличении 4X. Измените цель погружения 63X и отрегулируйте фокус. Проверьте аксоны, выражаюющие Chronos-GFP, и выберите пирамидальный нейрон для записи патчей.Затем заполните пипетки с глюконатом калия на основе внутреннего раствора. Умонтировать его в держатель пипетки на главной сцене. Патч ячейки в конфигурации зажима напряжения.Подойди к идентифицированного нейрона и деликатно нажмите наконечник пипетки на сому. Положительное давление должно производить ямочки на поверхности мембраны. Затем отпустите давление, чтобы создать печать gigoOm.После запечатыв, установите удерживаемое напряжение до минус 65 милливольт. Разбей мембрану резким пульсом отрицательного давления. Запись реакции нейрона на гиперполяризацию и деполяризацию текущих шагов в режиме зажима цельноклеточного тока.Запись в текущем или напряжения зажима постсинаптических реакций на 475 нанометров светодиодных цельно-полевой стимуляции афферентных волокон, выражаюющих Chronos. Стимулировать с поездами из десяти стимуляций продолжительностью две миллисекунды на 20 герц. Активность предсубикулярных нейронов в слое 3 в ответ на гиперполяризацию и деполяризацию текущих шагов была зафиксирована в конфигурации цельноклеточного патч-зажима.Стимулирование аксоновых терминалов ADN, выражаюющих Chronos-GFP, вызвало возбуждение пост-синаптических потенциалов в предсубикулярном слое трех основных ячеек в текущем режиме зажима. В зависимости от интенсивности света, EPSPs может достичь потенциального порога действия. Пост-синаптические реакции наблюдались также в режиме зажима напряжения, так как возбуждали пост-синаптические токи.Здесь показан слой три пирамидальных нейрона, окруженный таламиными аксонами, выражают Chronos-GFP в предсубикулярных поверхностных слоях с окрашиванием DAPI, изображенным с помощью эпифлюоресцентного микроскопа. И это изображение было сделано при более высоком увеличении с помощью конфокального микроскопа. Тщательное выравнивание брегмы вдоль оси при проведении экспериментальных экспериментов с флуоресцентным трассировщиком имеет решающее значение для повышения точности стереотаксисной инъекции.Эта процедура также может быть использована для исследования конвергентных проекций из разных областей путем введения на двух генеративных сцен чувствительны к двум различным длинам волн. Развитие этого метода позволило точно анатомического и функционального анализа цепи между отдаленными областями мозга в клеточном типе определенным образом.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Селективный Вирусный трансдукция взрослых происхождения обонятельных нейронов при хроническом В естественных условиях Optogenetic Стимуляция

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Волоконно-оптические имплантации для хронической стимуляции Optogenetic ткани головного мозга

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Стимуляция слухового нерва

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...