Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا كارلا غوميز على مساعدتها التقنية في جيل استنساخ الـ BAC cDNA وSnezhana Dimitrova على مساعدتها في إعداد الفيديو. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا ً بمنح من وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية (MINECO, grant number BFU2016-79127-R) إلى F.A.T. والمعاهد الوطنية للصحة (NIH, grant number 1R21AI120500) إلى L.M.S. and F.A.T.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تشكل استنساخات الـ cDNA المعدية أدوات جزيئية أساسية للبحوث الأساسية لفيروسات الحمض النووي الريبي وتطوير اللقاحات و/أو تحديد الاستراتيجيات المضادة للفيروسات. ومع ذلك، بالنسبة للعديد من فيروسات الحمض النووي الريبي التي تقطعت بها السبل الإيجابية، بما في ذلك الفيروسات الفلافية، فإن توليد استنساخ cDNA المعدية أمر صعب بسبب عدم استقرار cDNAs المستنسخة عند انتشارها في البكتيريا باستخدام بلازميدات عالية الأرقام عالية النسخ القياسية. في حالة ZIKV وغيرها من الفيروسات الفلافية، وهذا عدم الاستقرار يرجع أساسا إلى التعبير راشح من البروتينات الفيروسية السامة من المروجين البكتيرية خفي موجودة في الجينوم الفيروسي14،15،16،17 . هنا، ونحن نصف بروتوكول بديل وقوي لتوليد مستقرة ZIKV كامل طول استنساخ cDNA المعدية كبلازميد واحد، استنادا إلى استخدام pBeloBAC11BAC (الشكل2A)للتغلب على مشكلة السمية، واستخدام CMV المروج للسماح للتعبير عن vRNA في نواة الخلايا المنقولة، وRZ HDV لتوليد vRNAs مع دقيقة 3'-ينتهي (الشكل2B). باستخدام هذه الطريقة، قمنا بنجاح ولدت استنساخ المعدية مستقرة تماما من سلالة ZIKV RGN التي تسمح استرداد كفاءة وموثوق بها من rZIKV المعدية بعد الانفعال المباشر للخلايا فيرو عرضة (الشكل3 و الشكل4).
وقد بذلت جهود ضخمة في السنوات القليلة الماضية للتغلب على مشاكل عدم الاستقرار المرتبطة باستنساخ الحمض النووي الريبي المعديZIKV، وقد تم تنفيذ العديد من النهج بنجاح18، بما في ذلك الربط في المختبر من شظايا cDNA24 ، 25، بلازميدس نسخة منخفضة19،20، وتعطيل المروجين البكتيرية خفي عن طريق إدخال الطفرات الصامتة26،27، إدراج intron21، 22 , 23، وطريقة تجميع جيبسون30، وطريقة ISA28،29، واستخدام CPER31. على الرغم من أن هذه النهج التغلب على مشكلة السمية ومفيدة لتوليد الحيوانات المستنسخة CDNA المعدية ZIKV، وبعضها شاقة والحالية العديد من العيوب، بما في ذلك الحاجة إلى التعليب في المختبر وخطوات النسخ التي تقلل من الفيروس كفاءة الانتعاش أو إدخال عدد كبير من الطفرات الصامتة لتعطيل المروج البكتيري ة الخفية التي يمكن أن تؤثر على اللياقة البدنية الفيروسية، من بين أمور أخرى. ويقدم النهج الموصوف في هذا البروتوكول المزايا التالية. ط) وBAC بلازميد pBeloBAC1134 لديه النسخ المتماثل رقابة صارمة، والحفاظ على نسخة واحدة أو نسختين من بلازميد لكل خلية، مما يقلل من السمية ويسمح بصيانة مستقرة في البكتيريا من cDNAs غير مستقر. '2' إن انتشار وتعديل بلازميدات BAC تكاد تكون مماثلة للتعديلات البسيطة الموصوفة في هذا البروتوكول للتعامل مع شظايا BAC-DNA الكبيرة الحجم والبلازميدات ذات النسخ المنخفضة. وتجدر الإشارة إلى أن استنساخ CDNA BAC يمكن أيضا أن تعدل إلى E. القولونية عن طريق إعادة تركيب متجانسة باستخدام نظام إعادة تركيب الأحمر42،43،44. التعبير داخل الخلايا من VRNA ZIKV متوجواستعادة الفيروسات المعدية دون الحاجة إلى خطوة النسخ في المختبر. '4' يتم توليد rZIKV المعدية بعد التغوط المباشر للخلايا المعرضة (على سبيل المثال، فيرو) مع استنساخ CDNA BAC. بما أنّ [دنا] [ترّكأيشن] في [دمنس] [ترّكأيشن] أكثر فعّالة من [رنا] [ترّفكأيشن], الفيروس إستعادة فعالية مع ال [بك] مقاربة [هيغر] من أنّ يلاحظ يستعمل [رنا] نسخ, يقلّل الرقم الممرات في ثقافة خلايا أن يلد مخزون فيروسيّة و, وبالتالي، الحد من إدخال الطفرات غير المرغوب فيها عن طريق التكيف ثقافة الخلية.
وأخيرا، فإن إمكانات نهج BAC تدعمها الاستخدام الناجح لهذه الطريقة (مع تعديلات طفيفة) لهندسة استنساخ cDNA المعدية من الفيروسات الفلافية الأخرى، بما في ذلك فيروس حمى الضنك36، والعديد من الفيروسات الإكليلية ذات التأثير الكبير في صحة الإنسان والحيوان، مثل فيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للنقل37 (TGEV)، فيروس التهاب البريتوني المعدي القطط38 (FIPV)، فيروس كورونا البشري OC4339 (HCoV-OC43)، فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الالتهاب الحاد الوخيم (HCoV-OC43)، فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الالتهاب اللاإرادي الحاد الوخيم40 (SARS-CoV)، وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية41 (MERS-CoV)، من بين أمور أخرى.
وفي البروتوكول الوارد وصفه هنا، هناك خطوتان حاسمتان ينبغي النظر فيهما. أحد الاعتبارات الهامة هو تحديد مواقع تقييد فريدة مناسبة في الجينوم الفيروسي التي هي غائبة في بلازميد BAC. وفي حالة عدم توافر مواقع تقييد كافية، يمكن إنشاء مواقع تقييد جديدة أثناء تصميم الاستنساخ عن طريق إدخال طفرات النيوكليوتيدات الصامتة. وثمة مسألة هامة أخرى هي أن بلازميدات BAC موجودة في نسخة واحدة أو نسختين فقط لكل خلية، وبالتالي، يتم الحصول على غلة منخفضة من بلازميدات BAC مع تلوث عال من الحمض النووي الجينومي البكتيري باستخدام بروتوكولات قياسية مصممة لعالية وعالية بلازميدات متوسطة النسخ. يتم التغلب على هذه المشكلة المحتملة بسهولة باستخدام كميات كبيرة من الثقافة وتنقية بلازميد BAC مع مجموعة تجارية وضعت خصيصا لتنقية BAC.
وباختصار، قمنا بتطوير نهج وراثي عكسي قوي ZIKV على أساس استخدام BAC التي يمكن تكييفها لتوليد مستقرة وفعالة تماما استنساخ الحمض النووي الريبي المعدية من فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى التي تقطعت بها السبل الإيجابية لتسهيل دراسة بيولوجيا هذه الفيروسات وتطوير اللقاحات و/أو لتسهيل تحديد الأدوية المضادة للفيروسات.

ZIKV هو عضو يحمله البعوض من جنس فيروس فلافي داخل عائلة Flaviviridae التي تشكل حاليا حالة طوارئ الصحة العامة العالمية1. مثل غيرها من الفيروسات الفلافية، ZIKV هو فيروس RNA مغلفة مع بنية مثل icosahedral الذي يحتوي علىشعور إيجابي، جزيء RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل من حوالي 10.8 كيلو بايت (الشكل 1)2. الجينوم الفيروسي يشفر بروتين كبير من حوالي 3423 من الأحماض الأمينية التي تتم معالجتها بواسطة البروتياز الفيروسية والخلوية في ثلاثة بروتينات هيكلية (كابسيد [C]، قبل الغشاء / الغشاء [prM/M]، والمغلف [E]) التي تشارك في تشكيل الجسيمات الفيروسية وسبعة بروتينات غير هيكلية (NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5) التي تشارك في النسخ المتماثل الجينوم، وتجميع الفيروسات، والتهرب من الاستجابة المناعية المضيفة (الشكل 1)3.
تاريخيا، وقد ارتبطت عدوى ZIKV مع مرض الحموية خفيفة4،5. ومع ذلك، فإن الوباء المتفجر ة الأخيرة من عدوى زيكف فيجميع أنحاء أمريكا الجنوبية والوسطى، وجنوب المحيط الهادئ، ومنطقة البحر الكاريبي 6،7،8،وارتباطه مع حدوث متلازمة غيلان باريه وصغرالرأس 9،10،11،12،13،غيرت التصور التاريخي وقويت أهمية ZIKV كممرض الإنسان المهم. وبهذا المعنى، فإن تطوير الأدوات الجزيئية، مثل استنساخ الـ cDNA المعدية، سيسهل دراسة مسببات الأمراض الفيروسية وتطوير لقاحات محددة وراثياً وتحديد الأدوية المضادة للفيروسات لعلاج عدوى زيكف. كما هو موضح للفيروسات الفلافية الأخرى، فإن توليد الحيوانات المستنسخة المعدية ZIKV من الصعب بسبب وجود المروجين البكتيرية خفي في الجينوم الفيروسي14 التي تسمح التعبير راشح من البروتينات الفيروسية السامة أثناء انتشار استنساخ cDNA في البكتيريا باستخدام معيار عالية نسخة عدد plasmids15،16،17. وللتغلب على مشكلة السمية هذه، تم بنجاح تنفيذ عدة نُهج غير تقليدية في العامين الماضيين18. وتشمل هذه استخدام منخفضة النسخ عدد بلازميدات19،20، وإدراج الإينترونات لتعطيل المناطق السامة21،22،23،الربط في المختبر من شظايا cDNA 24 , 25, إسكات الطفرة من المروجين البكتيرية خفي موجودة في الجينوم الفيروسي26,27, أمبوليكونات subgenomic المعدية (ISA)28,29, طريقة تجميع جيبسون30 ، واستخدام تفاعل تمديد البوليمرات الدائرية (CPER)31.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل للهندسة من استنساخ cDNA كامل الطول من سلالة ZIKV ZIKV-RGN13، وذلك باستخدام BAC للتغلب على مشكلة السمية ، وإنقاذ rZIKV المعدية عن طريق التحويل المباشر للاستنساخ CDNA BAC في فيرو الخلايا32، وهو خط الخلية التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء (FDA) لتطوير اللقاحات البشرية33. في هذا النظام، يتم تجميع نسخة cDNA كاملة الطول من الجينوم الفيروسي في pBeloBAC1111 BAC (الشكل2A)،وهو بلازميد منخفض الأرقام (نسخة إلى نسختين لكل خلية) مشتقة من عامل F الإشريكية القولونية35، مما يقلل من سمية تسلسل اتلاف الفيروس أثناء انتشاره في البكتيريا. يتم تجميع cDNA الجينوم ZIKV في pBeloBAC11 تحت سيطرة الإنسان CMV المروج الفوري في وقت مبكر، للسماح للتعبير عن الفيروسية (v) RNA في نواة الخلايا المنقولة بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الخلوي الثاني، ويحيط بها في 3'-نهاية من قبل التهاب الكبد فيروس دلتا (HDV) ريبوزيم (RZ)، تليها تسلسل هرمون النمو البقري (BGH) إنهاء وإشارات polyadenyy لإنتاج RNAs الاصطناعية تحمل أصيلة 5 '- و 3'-ينتهي من الجينوم الفيروسي، على التوالي (الشكل2B). هذا النظام الذي أطلقته cDNA يؤدي إلى التعبير داخل الخلايا من RNA الفيروسية متوجة، مما يسمح باستعادة ZIKV المعدية دون الحاجة إلى خطوة النسخ في المختبر. يوفر نهج BAC منهجية قوية تنطبق على بناء استنساخ cDNA المعدية مستقرة وكاملة التشغيل للفيروسات الفلافية الأخرى، فضلا عن غيرها من الفيروسات RNA إيجابية الذين تقطعت بهم السبل36،37، 38،39،40،41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

وقد أكد ارتباط عدوى فيروس زيكا (ZIKV) بمضاعفات عصبية خلال الفاشية العالمية الأخيرة والافتقار إلى اللقاحات المعتمدة و/أو مضادات الفيروسات الحاجة الملحة إلى تطوير نظم جينية عكسية من هذا المرض لتيسير دراسة علم الأحياء ZIKV وتطوير النهج العلاجية و / أو الوقائية. ومع ذلك، كما هو الحال مع الفيروسات الفلافية الأخرى، تم إعاقة توليد استنساخ الحمض النووي الريبي المعدي ة بالكامل من ZIKV بسبب سمية التسلسلات الفيروسية أثناء تضخيمها في البكتيريا. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير نهج غير تقليدي يقوم على استخدام الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs). باستخدام هذا النهج، يتم إنشاء نسخة كاملة الطول من الحمض النووي الريبي من سلالة ZIKV ريو غراندي دو نورتي ناتال (ZIKV-RGN) من أربع شظايا الحمض النووي الاصطناعية وتجميعها في pBeloBAC11 بلازميد نسخة واحدة تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية (CMV) المروج الفوري في وقت مبكر. استنساخ CDNA BAC تجميعها مستقرة أثناء الانتشار في البكتيريا، ويتم استرداد المؤتلف المعدية (ص) ZIKV في خلايا فيرو بعد الانسياق من استنساخ CDNA BAC. يوفر البروتوكول الموضح هنا تقنية قوية لتوليد الحيوانات المستنسخة المعدية من الفيروسات الفلافية، بما في ذلك ZIKV، وغيرها من فيروسات الحمض النووي الريبي إيجابية حبلا، ولا سيما تلك التي لديها جينوم كبير التي لديها مشاكل الاستقرار خلال البكتيرية نشر.

يسمح البروتوكول الموضح هنا لتوليد استنساخ اتّصال كامل الطول من الـ ZIKV باستخدام BAC لتقليل مشاكل السمية المرتبطة بعدة تسلسلات فلفيروسية. يمكن تحقيق الانتعاش الفعال من rZIKV المعدية من استنساخ CDNA BAC بسهولة بعد التغوط من خلايا فيرو عرضة (الشكل 2). باستخدام هذا البروتوكول، قمنا بإنشاء استنساخ cDNA مستقركامل الطول من سلالة ZIKV RGN32 عن طريق الاستنساخ بالتتابع أربع شظايا cDNA متداخلة في pBeloBAC11BAC 34 باستخدام أساليب الاستنساخ التقليدية وفريدة من نوعها مواقع تقييد موجودة فيالجينوم الفيروسي (الشكل 2). كان يحيط استنساخ cDNA كامل الطول في 5'-نهاية من قبل المروج CMV الإنسان للسماح التعبير عن vRNA في نواة الخلايا المنقولة، وفي 3'-نهاية من قبل RZ HDV تليها تعدد التخصصات BGH وتسلسل الإنهاء، لإنتاج RNAs التي تحتوي على بالضبط 3'-نهاية الجينوم الفيروسي(الشكل2). الاستقرار في البكتيريا من استنساخ CDNA BAC ولدت، جنبا إلى جنب مع التلاعب السهل باستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف القياسية، يسلط الضوء على إمكانات نهج CDNA BAC للجيل السريع وموثوق بها من استنساخ cDNA مستقرة كاملة الطول من ZIKV وغيرها من الفيروسات الفلافية أو الفيروسات RNA إيجابية تقطعت بهم السبل مع الجينوم الفيروسي غير مستقر.
مرة واحدة تم تجميع استنساخ CDNA BAC (الشكل2) ، يمكن استرداد الفيروس المعدية بسهولة بعد الانسياق المباشر للخلايا الفيرو عرضة مع استنساخ CDNA BAC باستخدام liposomes الموجبة(الشكل 3). سمح هذا النظام الذي أطلقته cDNA التعبير داخل الخلايا من vRNAمتوجا ، مما يسمح باستعادة الفيروسات المعدية دون الحاجة إلى خطوة النسخ في المختبر. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على إنقاذ rZIKV-RGN مع titers أعلى من 106 PFU / مل في 5 أيام posttransfection (الشكل4A). وبالإضافة إلى ذلك، تسبب الفيروس الذي تم إنقاذه في وجود CPE واضح (الشكل4B)،وولدت لويحات متجانسة من حوالي 2 ملم في الحجم (الشكل4C)،وتم تأكيد هويته من خلال التسلسل (البيانات غير المعروضة) وتحليل الفلورة المناعية باستخدام mAb محددة للبروتين ZIKV E، 1176-56 (الشكل4D). وتشير البيانات في المختبر إلى أن rZIKV-RGN المستردة تكرارها بكفاءة في خلايا فيرو وإلى مستويات بالمقارنة مع ZIKV الطبيعية عزل32 (البيانات لم تظهر). عموما، تظهر هذه النتائج أن rZIKV المعدية يمكن إنقاذها من استنساخ cDNA كامل طول تجميعها في BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> الشكل 1 تنظيم الجينوم ZIKV وهيكل فيريون. (أ) منظمة الجينوم: يحتوي ZIKV على RNA إيجابي واحد الذين تقطعت بهم السبل التي يتم ترجمتها كبروتين واحد. تم شق البروتين متعدد البروتين المترجم ة بواسطة البروتياز الفيروسي (الأسهم) والمضيف (الماس) لإنتاج البروتينات الهيكلية كابسيد (C، الأزرق)، مصفوفة (M، البني)، ومغلفة (E، الأخضر)، وسبعة بروتينات غير هيكلية (NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5). يشار إلى 5 ' و 3 ' المناطق غير المترجمة (UTRs) في نهاية الجينوم الفيروسي مع خطوط سوداء. (ب) هيكل فيريون: تم تزيين virions ZIKV مع البروتينات E و M، الراسية في ثنائي ة الدهون مع هيكل مثل icosahedral. تحت الغلاف الفيروسي كان النيوكليوكابسيد الفيروسية تتألف من البروتين C المرتبطة الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي. وقد تم تكييف هذا الرقم من أفيلا - بيريز وآخرون18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> الشكل 2 الجمعية من [زكف] [فولّ-لنغث] معدية [كدنا] استنساخ في [بك]. (أ) التمثيل التخطيطي لpBeloBAC11 BAC: الجينات التنظيمية parA، parB، parC،وrepE،وأصل النسخ المتماثل F-عامل (OriS)،والجينات المقاومة للكلورامفينيكول (سمص)، واللاك يتم الإشارة إلى الجين Z. يتم التأكيد على مواقع التقييد ذات الصلة المستخدمة لتجميع استنساخ الـ ZIKV cDNA المعدية. (ب) الجمعية من ZIKV كامل طول استنساخ cDNA المعدية في pBeloBAC11 BAC: أربعة شظايا الحمض النووي المتداخلة (Z1-Z4)، التي تغطي الجينوم ZIKV كامل (الشكل1)وتحيط بها مواقع تقييد المشار إليها، ولدت من قبل المواد الكيميائية التوليف واستنساخها بالتتابع إلى pBeloBAC11 لتوليد المعدية ZIKV cDNA استنساخ pBAC-ZIKV. تم تجميع الـ ZIKV المعدية كاملة الطول تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية المروج الفوري في وقت مبكر (CMV) ويحيط بها في 3'-نهاية من قبل ريبوزيم HDV (RZ) وهرمون النمو البقري (BGH) إنهاء وتسلسل polyadenylation. وفيما يلي وصف المختصرات للجينات الفيروسية والعناصر التنظيمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> الشكل 3 سير العمل لتوليد rZIKV من استنساخ CDNA BAC. تم نقل خلايا فيرو في 90٪ من التقاء في أحادية الطبقة مع ZIKVكامل طول المعدية cDNA استنساخ pBAC-ZIKV (الشكل 2) باستخدام liposomes الموجبة. في 4-6 أيام ما بعد transfection، عندما كان CPE واضح، تم جمع supernatants زراعة الأنسجة التي تحتوي على rZIKV وتقييمها لوجود الفيروس (الشكل4) وتستخدم للتضخيم الفيروسي في خلايا فيرو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> الشكل 4 الانتعاش والتوصيف في المختبر من rZIKV. (أ) إنقاذ rZIKV المعدية من استنساخ CDNA BAC: خلايا فيرو في 90٪ من التقاء (6-شكل لوحة جيدا، triplicates) كانت وهمية transfected أو transfected مع 4 ميكروغرام / جيدا من pBAC-ZIKV (الشكل3)،وفي الأيام المشار إليها posttransfection، تم تحديد البنفسس الفيروس في الأنسجة ثقافة supernatants عن طريق فحص البلاك (PFU / مل). تشير أشرطة الخطأ إلى انحرافات قياسية عن ثلاث تجارب مختلفة للتغوط. يشير الخط الأسود المنقط إلى حد الكشف (50 PFU/mL). (B) الخلايا الفيروسية CPE: Vero في 90٪ التقاء (6-شكل لوحة جيدا، triplicates) كانت وهمية المصابة (أعلى) أو المصابة (وزارة الداخلية من 0.5 PFU / الخلية) مع rZIKV، وفي 48 ساعة بعد العدوى، تم تقييم وجود CPE عن طريق الفحص المجهري الخفيف. قضبان مقياس = 100 درجة مئوية (C) فحص البلاك الفيروسي وتلطيخ المناعة: خلايا فيرو في 90٪ التقاء (12 جيدا شكل لوحة) كانت مصابة rZIKV، وفي 72 ح بعد العدوى، وتصور لويحات الفيروسية من قبل الكريستال البنفسجي تلطيخ (اليسار) أو عن طريق تلطيخ المناعة ( الحق) باستخدام pan-flavivirus E بروتين mAb 4G2. قضبان مقياس = 5ملم (D) الفلورة المناعية: خلايا فيرو في 90٪ التقاء (24 جيدا شكل لوحة، triplicates) أصيب (وزارة الداخلية من 0.5 PFU / خلية) مع rZIKV، وفي 48 ساعة بعد العدوى، وتحليلها من قبل الفلورة المناعية باستخدام mAb 1176-56، محددة لZIKV E البروتين. كانت النوى الخلوية ملطخة DAPI. يتم عرض صورة مدمجة لخلايا فيرو المصابة بـ ZIKV. يمثل المربع الأبيض في أعلى اليمين صورة مكبرة لخلايا فيرو المصابة بـ ZIKV. قضبان مقياس = 100 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank"></a> درجة.

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

ويبرز وباء فيروس زيكا الذي أُحدث مؤخراً أهمية وضع نُهُج جينية عكسية لتطوير اللقاحات و/أو الاستراتيجيات العلاجية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لإنقاذ فيروس زيكا المؤتلف المعدية من استنساخ cDNA كامل الطول تجميعها في كروموسوم اصطناعي البكتيرية تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية المروج الفوري في وقت مبكر.

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

الهدف العام لهذا الإجراء التجريبي هو توليد فيروس زيكا المؤتلف المعدي من استنساخ cDNA كامل الطول ، تم تجميعه في كروموسوم اصطناعي بكتيري تحت سيطرة المروج الفوري لفيروس استئصال الفجل الكيسي البشري. ويتيح تطوير نظام وراثي عكسي لفيروسات الحمض النووي الريبي الريبي مثل فيروس زيكا التلاعب المباشر بجينوم الفيروس لدراسة جوانب متعددة من البيولوجيا الفيروسية والأمراض واستنباط استراتيجية اللقاح. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن بناء فيروس زيكا المستنسخ المعدي ككروموسوم اصطناعي بكتيري يتغلب على السمية المرتبطة بجينوم فيروس الفلافلايا ويسمح بإنقاذ الفيروس المعدي عن طريق العدوى المباشرة باستنساخ BAC cDNA في الخلايا المعرضة للخطر.ويمكن تطبيق هذه المنهجية على بناء مستنسخات معدية مستقرة وكاملة الوظائف من الحمض النووي الريبي (cDNA) لغيرها من فيروسات الفلافويين وكذلك فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى التي تقطعت بها السبل. للبدء في هذا الإجراء، إنشاء استنساخ فيروس زيكا cDNA كما هو موضح في بروتوكول النص، وذلك باستخدام مواقع تقييد المخصصة. يتم تجميع أربع شظايا الحمض النووي التي تغطي الجينوم فيروس زيكا محاطة بمروج CMV الإنسان في نهاية خمسة رئيس وريبوسوم فيروس دلتا التهاب الكبد وإنهاء هرمون النمو البقري وتسلسلات تعدد الأدنيلي في نهاية ثلاثة prime في بلازمي كروموسوم اصطناعي بكتيري.أولاً، تنمو مستعمرة واحدة من E.coli DH10B تحمل استنساخ فيروس PBAC-Zika المعدية في خمسة ملليلتر من متوسطة LB تحتوي على الكلورامفينيكول لمدة ثماني ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. ثم، إضافة 500 ملليلتر من متوسطة LB التي تحتوي على الكلورامفينيكول إلى قارورة سعة لترين. إضافة ملليلتر واحد من الثقافة البكتيرية المعدة إلى القارورة وتنمو الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 14 إلى 16 ساعة حتى OD600 هو تقريبا 0.6 إلى 0.8.بعد ذلك، استخدم مجموعة تجارية وضعت خصيصا لتنقية BAC لتنقية استنساخ عدوى CDNA عدوى BAC عن طريق تحلل القلوية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قبل يوم واحد من عملية نقل الدم، لوحة خلايا فيرو في آبار لوحة ستة بئر في كثافة 500،000 الخلايا في بئر في متوسط النمو. لإعداد مزيج transfection، إضافة أربعة ميكروغرام من استنساخ CDNA BAC إلى 250 ميكرولترات من المصل خفضت المتوسطة ومزيج بعناية.في أنبوب منفصل، تمييع 12 ميكرولترات من عامل transfection في 250 ميكرولترات من المصل متوسطة مخفضة. دوامة لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، الجمع بين cDNA BAC المخفف مع عامل transfection.اخلطي بعناية ويندمجي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة هذه، استخدام متوسط النمو دون المضادات الحيوية لغسل خلايا فيرو وترك الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة دون المضادات الحيوية. ثم، وتوزيع 500 ميكرولترات من cDNA وخليط كاشف transfection على خلايا فيرو قطرة.صخرة لوحة ذهابا وإيابا لخلط واحتضان الخلايا في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. بعد ذلك، إزالة الوسيط transfection وإضافة ملليلتر اثنين من متوسطة النمو الطازجة مع المضادات الحيوية. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، مع التأكد من التحقق من كل يوم لالتحث عن تأثير cytopathic.بعد أربعة إلى ستة أيام من transfection، عندما CPE حوالي 50 إلى 75٪ جمع اعالي ثقافة الأنسجة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام الخلوي. ثم، حصاد supernatnatants تحتوي على فيروس زيكا المؤتلف والتخلص من الكريات الخلية. Aliquot المُندفع في الأنابيب المبردة وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.للبدء، تنمو خلايا فيرو إلى التقاء 90٪. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتصيبهم مع الفيروس انقاذ مع تعدد العدوى من 0.1 في متوسطة النمو التي تحتوي على 2٪ FBS. ضع الصفائح من الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والصخور كل 15 دقيقة لفترة الامتزاز 90 دقيقة.بعد الامتزاز الفيروسي، وإزالة inoculum الفيروسية وإضافة متوسط النمو جديدة مع 2٪ FBS. احتضان ثلاثة أو أربعة أيام بنفس الشروط المستخدمة سابقا. عندما CPE هو ما يقرب من 75٪ جمع ثقافة الأنسجة الفائقة والطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوي.ثم، حصاد فائقة تحتوي على فيروس زيكا المؤتلف والتخلص من بيليه. Aliquot المُندفع إلى أنابيب التبريد. ضع الأنابيب في صندوق تجميد وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.عندما تكون جاهزة، إزالة aliquot الفيروس من الفريزر وتحديد titer الفيروسية عن طريق فحص البلاك كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم إنشاء نسخة مستقرة وكاملة cDNA من سلالة فيروس زيكا ريو غراندي دو نورتي ناتال عن طريق استنساخ تسلسلي أربع شظايا cDNA متداخلة في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري pBeloBAC11 باستخدام طرق الاستنساخ التقليدي ومواقع تقييد فريدة موجودة في الجينوم الفيروسي. وقد أحاطت هذه النسخة cDNA كامل الطول في نهاية خمسة رؤساء من قبل المروج الفيروس المضخم للخلايا البشرية للسماح للتعبير عن الحمض النووي الريبي الفيروسي في نواة الخلايا المصابة وفي نهاية ثلاثة رؤساء من قبل فيروس التهاب الكبد دلتا الريبوسوم تليها إنهاء هرمون النمو البقري وتسلسل polyadenylation لإنتاج الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نهاية ثلاثة رؤساء بالضبط من الجينوم الفيروسي.مرة واحدة يتم تجميعها CDNA BAC، يمكن بسهولة استرداد الفيروس المعدية بعد transfection المباشر من خلايا فيرو عرضة مع استنساخ CDNA BAC باستخدام الدهون الكاتيونية. باستخدام هذا النهج، يمكن إنقاذ فيروس R Zika RGN مع أكثر من مليون وحدة تشكيل البلاك لكل ملليلتر. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي الفيروس الذي تم إنقاذه إلى تأثير خليثي واضح ويولد لويحات متجانسة تبلغ مساحتها حوالي 2 ملليمتر.يتم تأكيد هوية الفيروس التي تم إنقاذها عن طريق تحليل الفلورسنس المناعي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة محدد للبروتين فيروس زيكا E. وعموماً، تثبت هذه النتائج أنه يمكن إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف المعدي من استنساخ cDNA كامل الطول الذي تم تجميعه في شهادة البكالوريا. وخلاصة القول، لقد طورنا نهجا جينيا عكسيا لفيروس زيكا القوي القائم على استخدام كروموسوم اصطناعي بكتيري يمكن تكييفه لتوليد العدوى المستقرة والوظيفية مع استنساخ الحمض النووي من فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى التي تعمل على حبلا إيجابي لتسهيل دراسة علم الأمراض، وتطوير لقاح، أو لتسهيل تحديد المخدرات مع النشاط المضاد للفيروسات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em&gt; في المختبر</em&gt; وقائية تأثير الانترفيرونات

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

التحديد الكمي لتعزيز تعتمد على جسم مضاد الفيروس Zika في خلايا الإنسان الأولية

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...