Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Les auteurs tient à remercier Carla Gomez pour son assistance technique dans la génération de clones de l'ADNc BAC et Snezhana Dimitrova pour son aide à la préparation de la vidéo. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Ministère espagnol de l'économie et de la compétitivité (MINECO, numéro de subvention BFU2016-79127-R) à la F.A.T. et aux National Institutes of Health (NIH, subvention numéro 1R21AI120500) à L.M.S. et F.A.T.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les clones infectieux de l'ADNc constituent des outils moléculaires essentiels pour la recherche fondamentale sur les virus à ARN et le développement de vaccins et/ou l'identification de stratégies antivirales. Cependant, pour de nombreux virus à ARN à brin positif, y compris les flavivirus, la génération de clones infectieux d'ADNc est difficile en raison de l'instabilité des CDNA clonés lorsqu'ils se propagent dans des bactéries utilisant des plasmides standard à grand nombre de copies. Dans le cas de ZIKV et d'autres flavivirus, cette instabilité est principalement due à l'expression de fuites de protéines virales toxiques provenant de promoteurs bactériens cryptiques présents dans le génome viral14,15,16,17 . Ici, nous décrivons un protocole alternatif et puissant pour générer un clone d'ADNc infectieux complet zikV stable comme un plasmide simple, basé sur l'utilisation du plasmique BAC pBeloBAC1134 (figure 2A) pour surmonter le problème de toxicité, l'utilisation de la Promoteur CMV pour permettre l'expression de l'ARNr v dans le noyau des cellules transfectées, et le HDV RZ pour générer des vRNAs avec des 3'-extrémités précises (Figure 2B). En utilisant cette méthode, nous avons réussi à générer un clone infectieux entièrement stable de la souche ZIKV RGN qui permet la récupération efficace et fiable du rZIKV infectieux après la transfection directe des cellules Vero sensibles (figure3 et Figure 4).
Un énorme effort a été fait au cours des dernières années pour surmonter les problèmes d'instabilité associés aux clones d'ADNc infectieux ZIKV, et plusieurs approches ont été mises en œuvre avec succès18, y compris la ligature in vitro des fragments d'ADNc24 ,25, plasmides à faible copie19,20, l'inactivation des promoteurs bactériens cryptiques par l'introduction de mutations silencieuses26,27, insertion intron21, 22 Ans , 23, la méthode d'assemblage Gibson30, la méthode ISA28,29, et l'utilisation de CPER31. Bien que ces approches surmontent le problème de toxicité et soient utiles pour générer des clones d'ADNc infectieux ZIKV, certaines d'entre elles sont laborieuses et présentent plusieurs inconvénients, y compris la nécessité de la ligature in vitro et des étapes de transcription qui réduisent le virus l'efficacité de récupération ou l'introduction d'un nombre élevé de mutations silencieuses pour inactiver le promoteur bactérien cryptique qui pourrait affecter la forme physique virale, entre autres. L'approche décrite dans ce protocole présente les avantages suivants. i) Le plasmique BAC pBeloBAC1134 a une réplication strictement contrôlée, en gardant une ou deux copies de plasmide par cellule, ce qui minimise la toxicité et permet un entretien stable dans les bactéries de cDNA instables. ii) La propagation et la modification des plasmides BAC sont presque similaires à celles des plasmides conventionnels, compte tenu des légères modifications décrites dans ce protocole pour manipuler des fragments d'ADN BAC de grande taille et des plasmides à faible copie. Notamment, le clone d'ADNc BAC peut également être modifié en E. coli par recombinaison homologue à l'aide du système de recombinaison rouge42,43,44. iii) L'utilisation du promoteur CMV permet au l'expression intracellulaire de l'ARNr de ZIKV plafonné et la récupération des virus infectieux sans exiger une étape in vitro de transcription. iv) Le rZIKV infectieux est généré après la transfection directe des cellules sensibles (p. ex. Vero) avec le clone de l'ADNc BAC. Étant donné que la transfection de l'ADN dans les cellules de mammifères est plus efficace que la transfection de l'ARN, l'efficacité de récupération du virus avec l'approche BAC est plus élevée que celle observée à l'aide de transcriptions d'ARN, ce qui réduit le nombre de passages dans les cellules de culture pour générer un stock viral et, par conséquent, limitant l'introduction de mutations indésirables par l'adaptation de la culture cellulaire.
Enfin, le potentiel de l'approche BAC est soutenu par l'utilisation réussie de cette méthode (avec de légères modifications) pour concevoir des clones infectieux d'adnascisation d'autres flavivirus, y compris le virus de la dengue36, et plusieurs coronavirus à fort impact dans santé humaine et animale, comme le coronavirus transmissible de gastro-entérite37 (TGEV), le virus de péritoite infectieuse féline38 (FIPV), le coronavirus humain OC4339 (HCoV-OC43), le coronavirus aigu grave de syndrome respiratoire40 (SRAS-CoV), et le coronavirus41 du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), entre autres.
Dans le protocole décrit ici, il y a deux étapes critiques qui devraient être prises en considération. Une considération importante est d'identifier les sites de restriction uniques appropriés dans le génome viral qui sont absents dans le plasmide de BAC. Si aucun site de restriction adéquat n'est disponible, de nouveaux sites de restriction peuvent être générés au cours de la conception du clonage par l'introduction de mutations muets nucléotides. Une autre question importante est que les plasmides BAC sont présents dans seulement une ou deux copies par cellule, et donc, de faibles rendements de plasmides BAC avec une forte contamination de l'ADN génomique bactérien sont obtenus en utilisant des protocoles standard conçus pour les plasmides à nombre moyen. Ce problème potentiel est facilement surmonté en utilisant de grands volumes de culture et en purifiant le plasmide BAC avec un kit commercial spécialement développé pour la purification BAC.
En résumé, nous avons développé une puissante approche génétique inverse ZIKV basée sur l'utilisation d'un BAC qui pourrait être adapté pour générer des clones d'ADNc infectieux stables et entièrement fonctionnels d'autres virus d'ARN à brin positif pour faciliter l'étude de la biologie de ces et la mise au point de vaccins et/ou pour faciliter l'identification des médicaments antiviraux.

ZIKV est un membre transmis par les moustiques du genre Flavivirus au sein de la famille Flaviviridae qui constitue actuellement une urgence de santé publique mondiale1. Comme d'autres flavivirus, le ZIKV est un virus à ARN enveloppé avec une structure icosahedral-like qui contient un sens positif, molécule d'ARN à brin unique d'environ 10,8 kb (Figure 1)2. Le génome viral code une grande polyprotéine d'environ 3 423 acides aminés qui est traitée par des protéases virales et cellulaires en trois protéines structurelles (capsid [C], prémembrane/membrane [prM/M] et enveloppe [E]) qui sont impliquées dans la formation de la particules virales et sept protéines non structurelles (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5) qui participent à la réplication du génome, à l'assemblage du virus et à l'évasion de la réponse immunitaire de l'hôte (figure 1)3.
Historiquement, l'infection de ZIKV a été associée à une maladie fébrile douce4,5. Cependant, la pandémie explosive récente d'infections à ZIKV dans toute l'Amérique du Sud et centrale, le Pacifique Sud et les Caraïbes6,7,8, et son association avec l'apparition du syndrome de Guillain-Barré et la microcéphalie9,10,11,12,13, ont changé la perception historique et potentialisé la pertinence de ZIKV comme un agent pathogène humain important. En ce sens, le développement d'outils moléculaires, tels que les clones infectieux d'ADNc, facilitera l'étude de la pathogénie virale et le développement de vaccins génétiquement définis et l'identification de médicaments antiviraux pour le traitement de l'infection à ZIKV. Comme décrit pour d'autres flavivirus, la génération de clones infectieux ZIKV est difficile en raison de la présence de promoteurs bactériens cryptiques dans le génome viral14 qui permettent l'expression de fuite de protéines virales toxiques lors de la propagation de la cDNA clones dans les bactéries en utilisant standard de haute copie-nombre plasmides15,16,17. Pour surmonter ce problème de toxicité, plusieurs approches non traditionnelles ont été mises en œuvre avec succès au cours des deux dernières années18. Il s'agit notamment de l'utilisation de plasmides à faible nombre de copies19,20, l'insertion d'intrones pour perturber les régions toxiques21,22,23, la ligature in vitro des fragments d'ADNc 24 Ans, états-unis , 25, silençage mutationnel des promoteurs bactériens cryptiques présents dans le génome viral26,27, amplicons sous-génomiques infectieux (ISA)28,29, la méthode d'assemblage Gibson30 , et l'utilisation de la réaction circulaire d'extension de polymérase (CPER)31.
Ici, nous décrivons le protocole détaillé pour l'ingénierie d'un clone d'ADNc pleine longueur de la souche ZIKV ZIKV-RGN13, en utilisant un BAC pour surmonter le problème de toxicité, et le sauvetage de rZIKV infectieux par transfection directe du clone d'ADNc BAC en Vero cellules32, une lignée cellulaire approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) pour le développement de vaccins humains33. Dans ce système, la copie intégrale de l'ADNc du génome viral est assemblée dans le plasmide BAC pBeloBAC1134 (Figure 2A), un plasmide à faible copie (une à deux copies par cellule) dérivé du facteur F35d'Escherichia coli , qui minimise la toxicité des séquences de flavivirus lors de sa propagation dans les bactéries. L'ADNc du génome zikV est assemblé en pBeloBAC11 sous le contrôle du promoteur humain CMV immédiatement-tôt, pour permettre l'expression de l'ARN viral (v) dans le noyau des cellules transfectées par la polymérase d'ARN cellulaire II, et flanqué à la 3'-extrémité par l'hépatite virus du delta (HDV) ribozyme (RZ), suivi par les séquences de l'hormone de croissance bovine (BGH) de terminaison et les signaux de polyadenylation pour produire des ARN synthétiques portant authentique5'- et 3'-extrémités du génome viral, respectivement (Figure 2B). Ce système cDNA-lancé a comme conséquence l'expression intracellulaire de l'ARN viral plafonné, permettant le rétablissement du ZIKV infectieux sans avoir besoin d'une étape de transcription in vitro. L'approche BAC fournit une méthodologie puissante applicable à la construction de clones d'ADNc infectieux stables et entièrement fonctionnels pour d'autres flavivirus, ainsi que d'autres virus de l'ARN à brin positif36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

L'association de l'infection par le virus Zika (ZIKV) par des complications neurologiques lors de la récente flambée mondiale et l'absence de vaccins et/ou d'antiviraux approuvés ont souligné la nécessité urgente de développer des systèmes génétiques inversés ZIKV pour faciliter l'étude de la biologie de ZIKV et le développement des approches thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cependant, comme avec d'autres flavivirus, la génération de clones d'ADNc infectieux de ZIKV a été entravée en raison de la toxicité des séquences virales pendant son amplification dans les bactéries. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une approche non traditionnelle basée sur l'utilisation de chromosomes artificiels bactériens (BAC). Grâce à cette approche, la copie intégrale de la souche DE l'ADNc de la souche ZIKV Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) est générée à partir de quatre fragments d'ADN synthétiques et assemblée dans le plasmide pBeloBAC11 à une seule copie sous le contrôle du cytomégalovirus humain (CMV) promoteur immédiat-précoce. Le clone d'ADNc BAC assemblé est stable pendant la propagation chez les bactéries, et le recombinant infectieux (r)ZIKV est récupéré dans les cellules Vero après transfection du clone de l'ADNc BAC. Le protocole décrit ici fournit une technique puissante pour la génération de clones infectieux de flavivirus, y compris ZIKV, et d'autres virus de l'ARN à brin positif, en particulier ceux avec de grands génomes qui ont des problèmes de stabilité pendant les bactéries propagation.

Le protocole décrit ici permet la génération de clones infectieux cDNA complets ZIKV stables à l'aide d'un BAC pour minimiser les problèmes de toxicité associés à plusieurs séquences flavivirales. La récupération efficace du rZIKV infectieux du clone d'ADNc BAC peut être facilement réalisée après la transfection des cellules Vero sensibles (Figure 2). En utilisant ce protocole, nous avons généré un clone stable de cDNA pleine longueur de la souche ZIKV RGN32 en clonant séquentiellement quatre fragments de cDNA qui se chevauchent dans le plasmique BAC pBeloBAC1134 en utilisant des méthodes de clonage conventionnelles et uniques sites de restriction présents dans le génome viral (Figure 2). Le clone d'ADNc pleine longueur a été flanqué à l'extrémité 5'-extrémité par le promoteur humain de CMV pour permettre l'expression de vRNA dans le noyau des cellules transfectées, et à l'extrémité 3'-par le RZ de HDV suivi par les séquences de polyadenylation et de terminaison de BGH, pour produire des ARN contenant l'exact 3'-fin du génome viral (Figure 2). La stabilité des bactéries du clone d'ADNc BAC généré, ainsi que sa manipulation facile à l'aide de technologies d'ADN recombinant standard, met en évidence le potentiel de l'approche BAC cDNA pour la génération rapide et fiable de clones d'ADNc complet sédentaires de ZIKV et d'autres flavivirus ou virus à ARN à brin positif avec des génomes viraux instables.
Une fois le clone d'ADNc BAC assemblé (Figure 2), le virus infectieux a pu être facilement récupéré après la transfection directe des cellules Vero sensibles avec le clone d'ADNc BAC à l'aide de liposomes cationiques(Figure 3). Ce système lancé par l'ADNc a permis l'expression intracellulaire de l'ARNrplafonné, permettant la récupération des virus infectieux sans avoir besoin d'une étape de transcription in vitro. Grâce à cette approche, nous avons pu sauver rZIKV-RGN avec des titers supérieurs à 106 PFU/mL à 5 jours après la transfection (figure 4A). De plus, le virus sauvé a induit un CPE clair (figure4B),a généré des plaques homogènes d'environ 2 mm de taille (figure4C),et son identité a été confirmée par le séquençage (données non indiquées) et l'analyse d'immunofluorescence à l'aide de l'analyse spécifique au mAb pour la protéine ZIKV E, 1176-56 (figure 4D). Les données in vitro indiquent que le rZIKV-RGN récupéré a été répliqué efficacement dans les cellules Vero et aux niveaux comparés à un isolat zikV naturel32 (données non montrées). Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que le rZIKV infectieux peut être sauvé des clones d'ADNc completassemblés dans un BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> Figure 1 : Organisation du génome ZIKV et structure virion. (A) Organisation du génome : LE ZIKV contient un ARN positif à brin unique qui se traduit par une seule polyprotéine. La polyprotéine traduite a été clivée par des protéases virales (flèches) et hôtes (diamants) pour produire les protéines structurelles capsid (C, bleu), matrice (M, brun), et enveloppe (E, vert), et sept protéines non structurelles (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, et NS5). Les régions non traduites (UTR) de 5' et 3' à la fin du génome viral sont indiquées avec des lignes noires. (B) Structure Virion : Les virions ZIKV ont été décorées avec les protéines E et M, ancrées dans une couche lipidique avec une structure icosahedral-like. Sous l'enveloppe virale était le nucléocapside viral composé de la protéine C liée à l'ARN génomique viral. Ce chiffre a été adapté à partir d'Ivila-Pérez et coll.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> Figure 2 : Assemblage du clone d'ADNc infectieux ZIKV dans un BAC. (A) Représentation schématique du bac pBeloBAC11:Les gènes régulateurs parA, parB, parC, et repE, l'origine dela réplication f-facteur (OriS), le gène résistant au chloramphenicol (Cmr), et le lac Le gène Z sont indiqués. Les sites de restriction pertinents utilisés pour assembler le clone infectieux de l'ADNc ZIKV sont soulignés. (B) Assemblage du clone d'ADNc infectieux de ZIKV dans le BAC pBeloBAC11 : Quatre fragments d'ADN qui se chevauchent (Z1-Z4), couvrant l'ensemble du génome de ZIKV (figure 1) et flanqués des sites de restriction indiqués, ont été générés par des produits chimiques synthèse et cloné séquentiellement en pBeloBAC11 pour générer le clone infectieux ZIKV cDNA pBAC-ZIKV. L'ADNc infectieux ZIKV intégral a été assemblé sous le contrôle du promoteur humain cytomégalovirus immédiatement précoce (CMV) et flanqué à l'extrémité 3'-extrémité par le Ribozyme HDV (RZ) et l'hormone de croissance bovine (BGH) terminaison et les séquences de polyadenylation. Les acronymes des gènes viraux et des éléments régulateurs sont décrits à la figure 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> Figure 3 : Flux de travail pour générer du rZIKV à partir du clone d'ADNc BAC. Les cellules vero à 90% de la confluence ont été transfectées en monocouche avec le clone cDNA infectieux ZIKV pBAC-ZIKV (Figure 2) utilisant des liposomes cationiques. À 4-6 jours de posttransfection, quand CPE était évident, les supernatants de culture de tissu contenant le rZIKV ont été rassemblés et évalués pour la présence du virus (figure 4) et utilisés pour l'amplification virale dans les cellules de Vero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> Figure 4 : Récupération et caractérisation in vitro de rZIKV. (A) Sauvetage du rZIKV infectieux du clone de l'ADNc BAC : les cellules Vero à 90 % de la confluence (format de plaque 6 puits, triplicats) ont été simulées ou transfectées avec 4 g/puits de pBAC-ZIKV (figure 3), et aux jours indiqués posttransfection, Les titres de virus dans les supernatants de culture de tissu ont été déterminés par l'analyse de plaque (PFU/mL). Les barres d'erreur indiquent les écarts types de trois expériences de transfection différentes. La ligne noire pointillée indique la limite de détection (50 PFU/mL). (B) Les cellules virales cPE:Vero à 90% de confluence (format de plaque de 6 puits, triplicates) ont été simulées (en haut) ou infectées (MOI de 0,5 PFU/cellule) avec rZIKV, et à 48 h postinfection, la présence de CPE a été évaluée par microscopie légère. Barres d'échelle de 100 m. (C) Analyse de la plaque virale et immunostaining : Les cellules Vero à 90 % de confluence (format de 12 puits) ont été infectées par le rZIKV, et à 72 h après l'infection, les plaques virales ont été visualisées par coloration violette cristalline (à gauche) ou par immunostaining ( à droite) à l'aide du pan-flavivirus E protéine mAb 4G2. Barres d'échelle de 5 mm(D) Immunofluorescence : Les cellules vero à 90 % de confluence (format de plaque de 24 puits, tripliciates) ont été infectées (MOI de 0,5 PFU/cellule) avec rZIKV et, à 48 h postinfection, analysées par immunofluorescence à l'aide du mAb 1176-56, spécifique pour ZIKV E protéine. Les noyaux de cellules ont été souillés avec DAPI. Une image fusionnée représentative des cellules Vero zikV-infectées est montrée. Le carré blanc en haut à droite représente une image agrandie des cellules Vero infectées par le ZIKV. Barres d'échelle de 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

La récente épidémie de virus Zika souligne l'importance d'établir des approches génétiques inversées pour mettre au point des vaccins et/ou des stratégies thérapeutiques. Ici, nous décrivons le protocole pour sauver un virus Zika recombinant infectieux d'un clone d'ADNc pleine longueur assemblé dans un chromosome artificiel bactérien sous le contrôle du promoteur humain de cytomégalovirus immédiatement-tôt.

Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

L’objectif global de cette procédure expérimentale est la génération du virus Zika recombinant infectieux à partir d’un clone de l’ADNC pleine longueur, assemblé dans un chromosome artificiel bactérien sous le contrôle du promoteur humain du cytomégalovirus immédiat et précoce. Le développement d’un système génétique inverse pour les virus ARN tels que le virus Zika permet la manipulation directe du génome du virus pour étudier plusieurs aspects de la biologie virale et de la pathogénie et développer une stratégie vaccinale. Le principal avantage de cette technique est que la construction du clone infectieux du virus Zika en tant que chromosome artificiel bactérien surmonte la toxicité associée au génome du flavivirus et permet le sauvetage du virus infectieux par transfection directe du clone bac cDNA en cellules sensibles.Cette méthodologie pourrait être appliquée à la construction de clones infectieux stables et entièrement fonctionnels de l’ADND pour d’autres flavivirus ainsi que d’autres virus arn à brin positif. Pour commencer cette procédure, construisez le clone cDNA du virus Zika tel qu’il est décrit dans le protocole textuel, à l’aide de sites de restriction appropriés. Quatre fragments d’ADN couvrant le génome du virus Zika flanqués du promoteur humain du CMV à l’extrémité à cinq premiers et du virus de l’hépatite delta ribosome et des séquences d’arrêt et de polyadenylation de l’hormone de croissance bovine à l’extrémité à trois premiers sont assemblés dans un plasmide chromosomique artificiel bactérien.Tout d’abord, cultiver une seule colonie d’E.coli DH10B transportant le clone infectieux du virus pBAC-Zika en cinq millilitres de milieu LB contenant du chloramphéniphénol pendant huit heures à 37 degrés Celsius avec des secousses douces. Ensuite, ajouter 500 millilitres du milieu LB contenant du chloramphénicol à un flacon de deux litres. Ajouter un millilitre de la culture bactérienne préparée au flacon et faire croître les cellules à 37 degrés Celsius pendant 14 à 16 heures jusqu’à ce que l’OD600 soit d’environ 0,6 à 0,8.Après cela, utilisez un kit commercial spécialement développé pour la purification bac pour purifier l’infection BAC clone cDNA par lyse alcaline en suivant les instructions du fabricant. Un jour avant la transfection, plaquez les cellules vero dans les puits d’une plaque de six puits à une densité de 500 000 cellules par puits en milieu de croissance. Pour préparer le mélange de transfection, ajouter quatre microgrammes du clone bac cDNA à 250 microlitres de sérum réduit moyen et mélanger soigneusement.Dans un tube séparé, diluer 12 microlitres d’agent transfection dans 250 microlitres de sérum réduit moyen. Vortex pour mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, combinez le BAC dilué cDNA avec l’agent transfection.Mélanger soigneusement et incuber à température ambiante de 20 à 30 minutes. Pendant cette période d’incubation, utiliser un milieu de croissance sans antibiotiques pour laver les cellules Vero et laisser les cellules dans un millilitre de milieu frais sans antibiotiques. Ensuite, distribuez les 500 microlitres du mélange de réaccène et de réaccfection transfection sur les cellules vero dropwise.Rock la plaque d’avant en arrière pour mélanger et incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Après cela, retirer le milieu de transfection et ajouter deux millilitres de milieu de croissance frais avec des antibiotiques. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de vérifier chaque jour pour l’induction de l’effet cytopathique.Après quatre à six jours de transfection, lorsque le CPE est d’environ 50 à 75% recueillir les supernatants de culture tissulaire dans des tubes coniques de 15 millilitres et centrifugeuse pendant 10 minutes pour enlever les débris cellulaires. Ensuite, récoltez les supernatants contenant le virus Zika recombinant et jetez les granulés cellulaires. Aliquot le supernatant en cryotubes et les stocker à moins 80 degrés Celsius.Pour commencer, faire croître les cellules vero à 90% de confluence. Lavez les cellules deux fois avec PBS et infectez-les avec le virus sauvé avec la multiplicité de l’infection de 0,1 dans le milieu de croissance contenant 2%FBS. Placez les plaques des cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et de roche toutes les 15 minutes pendant la période d’adsorption de 90 minutes.Après l’adsorption virale, enlever l’inoculum viral et ajouter un milieu de croissance frais avec 2%FBS. Incuber trois ou quatre jours aux mêmes conditions utilisées précédemment. Lorsque le CPE est d’environ 75%recueillir la culture tissulaire supernatant et centrifugeuse pour enlever les débris cellulaires.Ensuite, récoltez le supernatant contenant le virus Zika recombinant et jetez la pastille. Aliquot le supernatant en cryotubes. Placez les tubes dans une boîte de congélation et rangez-les à moins 80 degrés Celsius.Une fois prêt, retirez un virus aliquot du congélateur et déterminez le titer viral par analyse de plaque tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette étude, un clone stable et complet de l’ADNC de la souche du virus Zika Rio Grande do Norte Natal est généré par le clonage séquentiel de quatre fragments d’ADNC qui se chevauchent dans le chromosome artificiel bactérien pBeloBAC11 à l’aide de méthodes de clonage conventionnelles et de sites de restriction uniques présents dans le génome viral. Ce clone cDNA pleine longueur a été flanqué à l’extrémité à cinq premiers par le promoteur humain de cytomégalovirus pour permettre l’expression de l’ARN viral dans le noyau des cellules transfected et à l’extrémité de trois-prime par le ribosome de virus de delta d’hépatite suivi de l’arrêt d’hormone de croissance bovine et de la séquence de polyadenylation pour produire des ARN contenant l’extrémité trois-prime exacte du génome viral.Une fois l’ADNC BAC assemblé, le virus infectieux peut être facilement récupéré après la transfection directe des cellules Vero sensibles avec le clone bac cDNA à l’aide de liposomes cationiques. Grâce à cette approche, le R Zika virus RGN peut être sauvé avec des titres supérieurs à un million d’unités de formation de plaques par millilitre. En outre, le virus sauvé induit un effet cytopathique clair et génère des plaques homogènes d’environ deux millimètres de taille.L’identité du virus sauvé est confirmée par l’analyse de l’immunofluorescence à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique pour la protéine E du virus Zika. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le virus Zika recombinant infectieux peut être sauvé des clones cDNA pleine longueur assemblés dans un BAC. En résumé, nous avons mis au point une puissante approche génétique inverse du virus Zika basée sur l’utilisation d’un chromosome artificiel bactérien qui pourrait être adapté pour générer les infections stables et fonctionnelles avec clone de l’ADND d’autres virus arn à brin positif afin de faciliter l’étude de la pathologie, de mettre au point un vaccin et de faciliter l’identification des médicaments ayant une activité antivirale.

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