Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

המחברים רוצים להודות קארלה Gómez עבור הסיוע הטכני שלה ב-BAC cDNA הדור שיבוט ו Snezhana דימיברובה לעזור עם הכנת וידאו. עבודה זו היתה נתמכת בחלק על ידי מענקים מהמשרד הספרדי של הכלכלה והתחרותיות (MINECO, גרנט מספר BFU2016-79127-R) ל F.A.T. והמכון הלאומי לבריאות (NIH, גרנט מספר 1R21AI120500) ל L.M.S. ו F.A.T.

. למחברים אין מה לגלות

מדבקת cDNA שיבוטים מהווים כלי מולקולרי חיוניים עבור מחקר בסיסי של וירוסים RNA ופיתוח של חיסונים ו/או זיהוי של אסטרטגיות אנטי ויראליות. עם זאת, עבור רבים וירוסים בעלי-RNA שנתקעו הרבה, כולל flaviviruses, הדור של המשובטים מדבקת cDNA הם קשים בשל חוסר היציבות של cDNAs משוכפל כאשר מופץ חיידקים באמצעות תקן גבוהה העתק מספר פלמידים. במקרה של zikv ווירוסים אחרים, אי-יציבות זו היא בעיקר בשל הביטוי הדולף של חלבונים ויראלי רעילים מיזמים בקטריות מסתורית להציג את הגנום הנגיפי14,15,16,17 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול חלופי ורב עוצמה כדי ליצור באורך מלא של ZIKV מדבקת cDNA שיבוט מידבקת כמו פלבאמצע בודד, מבוסס על השימוש של pBeloBAC11 באמצע BAC34 (איור 2a) כדי להתגבר על בעיית רעילות, השימוש של היזם CMV כדי לאפשר את הביטוי של vRNA בגרעין של תאים מזוהמים, ואת HDV RZ לייצר Vrna עם 3 '-קצוות מדויקים (איור 2B). באמצעות שיטה זו, יצרנו בהצלחה שיבוט מדבקת לחלוטין יציבה של הזנים ZIKV המאפשר התאוששות יעילה ואמינה של rZIKV זיהומיות לאחר הגלגול הישיר של תאים ברו רגיש (איור 3 ו איור 4).
מאמץ עצום נעשה בשנים האחרונות כדי להתגבר על בעיות אי-יציבות הקשורים במשובטים ZIKV זיהומיות cDNA, ומספר גישות יושמו בהצלחה18, כולל הארכה מחוץ לבית של שברי cdna24 ,25, נמוך העתק פלמידים19,20, הפעלה של היזמים בקטריות מסתורית על ידי הקדמה של מוטציות שקטות26,27, איון הכניסה21, מיכל בן 22 , 23, שיטת הייצור של הגיבסון30, שיטת ISA28,29, והשימוש cper31. למרות גישות אלה להתגבר על בעיית רעילות והם שימושיים כדי ליצור ZIKV מדבקת cDNA שיבוטים, כמה מהם הם מפרך ולהציג כמה חסרונות, כולל את הצורך בתהליך הפריה חוץ גופית ושעתוק להפחית וירוס יעילות ההחלמה או הקדמה של מספר גבוה של מוטציות שקטות להפעיל יזם בקטריאלי מסתורית שיכול להשפיע על כושר נגיפי, בין היתר. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מציגה את היתרונות הבאים. i) ה-pBeloBAC11 בינוני של BAC34 יש שכפול מבוקרת לחלוטין, שמירה על אחד או שניים עותקים של פלביניים לכל תא, אשר ממזער את הרעילות ומאפשר תחזוקה יציבה חיידקים של מיצב cdnas. ii) ההפצה והשינוי של הפלמידים של BAC הם דומים כמעט לאלה של פלמידים קונבנציונליים, בהתחשב בשינויים הקלים המתוארים בפרוטוקול זה כדי לתמרן שברי בגודל גדול של ה-DNA ו-העתקה מפלסטיק נמוך. במיוחד, שיבוט BAC cdna יכול להיות שונה לתוך E. coli על ידי שילוב הומוולוגי באמצעות מערכת רקומבינציה אדום42,43,44. iii) השימוש ב-cdna יזם מאפשר ל ביטוי תאיים של הכתיר ZIKV vRNA ואת ההתאוששות של וירוסים זיהומיות ללא צורך בתהליך שעתוק מבחנה. iv) rZIKV זיהומיות נוצר לאחר הזיהום הישיר של תאים רגישים (למשל, ברו) עם שיבוט BAC cDNA. מאחר שיצירת דנ א בתאי היונקים יעילה יותר מאשר העברה של RNA, יעילות השחזור של הנגיף עם הגישה BAC גבוהה יותר מאשר נצפתה באמצעות תעתיקים של RNA, הפחתת מספר המעברים בתאי התרבות כדי ליצור מניות ויראליות, כתוצאה מכך, הגבלת המבוא של מוטציות לא רצויות על ידי הסתגלות לתרבות התא.
בסופו של דבר, הפוטנציאל של הגישה BAC הוא נתמך על ידי שימוש מוצלח של שיטה זו (עם שינויים קלים) כדי להנדס מדבקת cdna שיבוטים של מכונות אחרות וירוסים, כולל וירוס דנגה36, ווירוסים מספר של השפעה גבוהה ב בריאות האדם ובעלי חיים, כגון דבקות מערכת העיכול37 (גב), צפקת וירוס זיהומיות38 (fipv), האדם coavirus OC4339 (hcov-OC43), חמור תסמונת הנשימה חמורה וירוס40 (סארס-cov), ותסמונת הנשימה של המזרח התיכוןמ41 (מרס-cov), בין היתר.
בפרוטוקול המתואר כאן, קיימים שני שלבים קריטיים שיש לשקול. אחד השיקול החשוב הוא לזהות אתרי הגבלה ייחודי מתאים הגנום הנגיפי כי נעדרים בתוך הפלביניים BAC. אם לא קיימים אתרי הגבלה מספיקים, ניתן ליצור אתרי הגבלה חדשים במהלך עיצוב השכפול על-ידי הכנסת מוטציות של נוקלאוטיד שקט. עוד בעיה חשובה היא כי הפלמידים BAC מופיע רק אחד או שניים עותקים לכל תא, ולכן, תשואות נמוכות של BAC פלאמידים עם זיהום גבוה של DNA גנומית חיידקי מתקבלים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים המיועדים גבוהה-ו . מספר העתקים בינוניים זו בעיה פוטנציאלית היא להתגבר בקלות באמצעות כרכים התרבות גדול לטהר את הפלמיד BAC עם ערכת מסחרית שפותחה במיוחד עבור הטיהור BAC.
לסיכום, פיתחנו שיטה רבת עוצמה גנטית הפוכה המבוססת על שימוש ב-BAC שיכול להיות מותאם כדי ליצור יציב ופונקציונלי במלואו cDNA שיבוטים של וירוסי RNA אחרים וירוסים חיוביים להקל על המחקר של הביולוגיה של אלה וירוסים ופיתוח חיסונים ו/או כדי להקל על זיהוי תרופות אנטי-ויראליות.

ZIKV הוא חבר של היתוש הנישא של סוג Flavivirus בתוך משפחת פלאוויריתיים המהווה כיום חירום הכללית בריאות הציבור1. כמו וירוסים אחרים, ZIKV הוא וירוס מעטפת RNA עם מבנה מדומה, המכיל תחושה חיובית, יחיד תקוע מולקולה RNA של כ 10.8 kb (איור 1)2. הגנום הנגיפי מקודד polyprotein גדול של כ 3,423 חומצות אמינו כי הוא מעובד על ידי פרוטסים ויראלי הסלולר לתוך שלושה חלבונים מבניים (capsid [C], premembrane/ממברנה [prM/M], ומעטפה [E]) המעורבים היווצרות של חלקיקים ויראליים שבעה (NS) חלבונים (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, ו NS5) כי להשתתף שכפול הגנום, וירוס הרכבה, והתחמקות של התגובה החיסונית מארח (איור 1)3.
היסטורית, זיהום zikv נקשר עם מחלה חום קל4,5. עם זאת, המגפה האחרונה נפץ של זיהומים zikv ברחבי דרום ומרכז אמריקה, דרום האוקיינוס השקט, ואת הקאריביים6,7,8, ואת הקשר שלה עם התרחשות של תסמונת גיליאן בברה ומיקרוצפליה9,10,11,12,13, שינו את התפיסה ההיסטורית ובעלת פוטנציאל לרלוונטיות של zikv כפתוגן אנושי חשוב. במובן זה, התפתחות של כלים מולקולריים, כגון שיבוטים cDNA זיהומיות, יקל על המחקר של פתוגנזה נגיפי ופיתוח של חיסונים מוגדרים גנטית זיהוי של תרופות אנטי לטיפול בזיהום ZIKV. כפי שמתואר עבור וירוסים אחרים, הדור של שיבוטים זיהומיות ZIKV קשה בשל נוכחותם של היזמים בקטריות מסתורית הגנום הנגיפי14 המאפשרים ביטוי דולף של חלבונים נגיפי רעילים במהלך התפשטות של cdna שיבוטים בחיידקים באמצעות תקן גבוה העתק מספר פלמידים15,16,17. כדי להתגבר על בעיית רעילות זו, מספר גישות שאינן מסורתיות יושמו בהצלחה בשנתיים האחרונות של18. אלה כוללים את השימוש של מספר העתק-החלקיקים הנמוכים19,20, החדרת introns כדי לשבש את האזורים הרעילים21,22,23, הארכה מחוץ לחומר של שברי cdna בת 24 , 25, השתקה של היזמים בקטריות מסתורית נוכח הגנום הנגיפי26,27, זיהומיות משנה הגברה (ISA)28,29, שיטת הגיבסון האסיפה30 , והשימוש בתגובת הרחבה מעגלית פולימרואז (CPER)31.
בזאת, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט עבור הנדסה של שיבוט cDNA באורך מלא של מאמץ ZIKV ZIKV-RGN13, באמצעות BAC כדי להתגבר על בעיית רעילות, ואת ההצלה של rZIKV זיהומיות ידי העברה ישירה של שיבוט BAC cdna לתוך ברו תאים32, קו תא מאושר על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) לפיתוח חיסונים אנושיים33. במערכת זו, העתק באורך מלא cDNA של הגנום הנגיפי הוא התאספו ב-34 pBeloBAC11 באמצע בינוני (איור 2a), מספר העתק נמוך-פלמיד (אחד לשני עותקים לכל תא) נגזר Es, האנהנשכיה F-factor35, אשר ממזער את רעילות של רצפים וירוס במהלך התפשטות שלה בחיידקים. CDNA של הגנום ZIKV מורכב ב pBeloBAC11 תחת שליטה של מיזם האדם CDNA האנושי מיידית, כדי לאפשר את הביטוי של ויראלי (v) RNA בגרעין של תאים מזוהמים על ידי הסלולר RNA פולימראז II, ומקיפים את 3 '-end על ידי צהבת דלתא וירוס (HDV) ריבוזים (rz), ואחריו רצפים של הורמון גדילה השור (bgh) הפסקת ואותות פוליאדלציה כדי לייצר rz סינתטי נושא אותנטי 5 '-ו 3 '-קצות הגנום הנגיפי, בהתאמה (איור 2b). זה cDNA-השיקה מערכת התוצאות ביטוי תאיים של RNA ויראלי הכתיר, המאפשר התאוששות של ZIKV זיהומיות ללא צורך לשלב שעתוק מבחנה. הגישה באק מספק מתודולוגיה רבת עוצמה הישימה כדי לבנות יציב ופונקציונלי מדבקת cdna שיבוטים עבור flaviviruses אחרים, כמו גם אחרים וירוסים חיובי-RNA36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

האגודה של וירוס zika (zika) זיהום עם סיבוכים נוירולוגיים במהלך ההתפרצות העולמית האחרונה ואת חוסר חיסונים מאושרים ו/או נוגדנים יש הבקיע את הצורך הדחוף לפתח מערכות גנטיות הפוכה zika כדי להקל על ה חקר ביולוגיה של ZIKV ופיתוח גישות טיפוליות ו/או מניעתי. עם זאת, כמו עם וירוסים אחרים, הדור של ZIKV באורך מלא מדבקת cDNA שיבוטים כבר החלה בשל רעילות של רצפים ויראלי במהלך הגברה שלה חיידקים. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו גישה לא מסורתית המבוססת על השימוש של כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים (BACs). באמצעות גישה זו, באורך מלא cDNA עותק של זן ZIKV ריו גרנדה do Norte נטאל (ZIKV-RGN) נוצר מארבעה שברי דנ א סינתטי והתאספו לתוך עותק יחיד pBeloBAC11 באמצע תחת השליטה של cytomegalovirus האנושי (CDNA) יזם מוקדם מיידית התאספו שיבוט BAC cDNA הוא יציב במהלך התפשטות חיידקים, ו זיהומיות רקומביננטי (r) ZIKV הוא התאושש בתאי ברו לאחר התפשטות של שיבוט BAC cDNA. הפרוטוקול המתואר כאן מספק טכניקה רבת עוצמה עבור הדור של שיבוטים מדבקים של וירוסים וירוסים, כולל zikv, ו אחרים חיובי-הגדיל וירוסי RNA, במיוחד אלה עם גנום גדול שיש להם בעיות יציבות במהלך חיידקים הפצת ההפצה.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור של מלאה ZIKV באורך מלא cDNA שיבוטים זיהומיות באמצעות BAC כדי למזער את בעיות רעילות הקשורים ברצפים מספר flaviviral. התאוששות יעילה של rZIKV זיהומיות מ-BAC cDNA שיבוט ניתן להשיג בקלות לאחר הזיהום של תאים ברו הרגיש (איור 2). באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו יציבה באורך מלא cDNA שיבוט של הזנים ZIKV RGN32 על ידי שיבוט ברציפות ארבעה שברי ה-dna חופפים לתוך הפלpBeloBAC11 BAC באמצע ה34 באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונלי ייחודי אתרי הגבלה נוכח הגנום הנגיפי (איור 2). שיבוט cDNA באורך מלא היה מוקף 5 '-end על ידי היזם CDNA האדם כדי לאפשר את הביטוי של vRNA בגרעין של תאים מזוהמים, ו ב 3 '-end על-ידי HDV RZ ואחריו BGH הפוליצילציה ורצפי הפסקת, כדי לייצר Rz המכיל המדויק 3 '-סוף של הגנום הנגיפי (איור 2). היציבות של חיידקים של שיבוט BAC cDNA שנוצר, יחד עם מניפולציה קלה שלה באמצעות תקן רקומביננטי DNA טכנולוגיות, מדגיש את הפוטנציאל של הגישה לcdna BAC עבור הדור המהיר והאמין של יציבה באורך מלא cDNA שיבוטים של ZIKV ווירוסים אחרים או שנתקע חיובי RNA וירוסים עם genomes ויראלי יציב.
לאחר BAC cdna שיבוט הורכב (איור 2), וירוס זיהומיות יכול להיות התאושש בקלות לאחר מעבר ישיר של התאים הרגישים ברו עם שיבוט BAC cdna באמצעות ליפוזומים משקל(איור 3). זה cDNA-השיקה מערכת אפשרה את הביטוי התאיים של הכתיר Vrna, המאפשר התאוששות של וירוסים זיהומיות ללא צורך בצעד שעתוק מבחנה. באמצעות גישה זו, הצלחנו להציל את rzikv-rgn עם מגדל גבוה יותר 106 pfu/mL ב 5 ימים מעבר לזיהום (איור 4a). בנוסף, וירוס שחולצו המושרה CPE ברור (איור 4B), שנוצר לוחיות הומוגנית של כ 2 מ"מ בגודל (איור 4b), והזהות שלה אושרה על ידי רצף (נתונים לא מוצגים) ו מimmunofluorescence ניתוח באמצעות ספציפי mab לחלבון ZIKV E, 1176-56 (איור 4D). בנתונים חוץ גופית עולה כי rZIKV התאושש-RGN משוכפל ביעילות בתאי ברו ולרמות לעומת ZIKV בידוד טבעי32 (נתונים לא מוצגים). בסך הכל, תוצאות אלה מוכיחים כי rZIKV זיהומיות ניתן להציל מן באורך מלא cDNA שיבוטים התאספו ב BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> איור 1 : ארגון הגנום Zikv ומבנה הויריאון. (א) הגנום הארגון: zikv מכיל חיובי אחד תקוע-RNA כי הוא מתורגם כמו פוליפרוטאין יחיד. פוליפרוטאין מתורגם היה ביקע על ידי נגיפי (חיצים) ומארח (יהלומים) הפרוטסים לייצר חלבונים מבניים capsid (C, כחול), מטריצה (M, חום), ו לעטוף (E, ירוק), ושבעה חלבונים לא מבניים (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, ו NS5). The 5 ' ו 3 ' אזורים לא מתורגם (UTRs) בסוף הגנום הנגיפי מסומנים קווים שחורים. (ב) מבנה הוירימטר: zikv הרימונים היו מעוטרים עם חלבונים E ו-M, מעוגן ביליפיד עם מבנה דומה של איסאודרהישור. תחת לעטוף ויראלי היה נוקלאואוקאפסיד ויראלי מורכב חלבון C המשויך RNA גנומית ויראלי. דמות זו הותאמה מ Ávila-פרז et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> איור 2 : הרכבה של ZIKV באורך מלא מדבקת cDNA שיבוט ב-BAC. (א) ייצוג סכמטי של pBeloBAC11 BAC: הגנים הרגולטורים פארה, parb, פארק, ו repe,מקור שכפול F-factor (וריס), הגנים ככלורמפניקול עמידים (Cmr), ו- lac גן Z מצוין. אתרי ההגבלה הרלוונטיים ששימשו להרכבת השכפול הזיהומיות של ZIKV cDNA מסומנים בקו תחתון. (ב) הרכבה של zikv באורך מלא מדבקת cdna שיבוט לתוך pBeloBAC11 BAC: ארבעה שברי ה-dna חופפים (Z1-Z4), כיסוי הגנום zikv כולו (איור 1) ומוקף באתרי ההגבלה המצוין, נוצרו על ידי כימיים סינתזה ברצף שוכפל לתוך pBeloBAC11 כדי ליצור את מדבקת ZIKV cDNA שיבוט pBAC-ZIKV. באורך מלא zikv זיהומיות cdna היה מורכב תחת השליטה של cytomegalovirus ירוס האדם מיידית מוקדם היזם (cdna) ומקיפים את 3 '-end על ידי ה-HDV ריבוזים (rz) ואת הורמון גדילה הפרה (bgh) סיום ורצפים פוליאדלציה. ראשי התיבות של הגנים הנגיליים ורכיבי הרגולציה הם כמתואר באיור 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> איור 3 : זרימת עבודה כדי ליצור rZIKV מ שיבוט BAC cDNA. התאים של ברו ב 90% של המפגש היו מצוידים במונאולייר עם ZIKV באורך מלא מדבקת cDNA שיבוט pBAC-ZIKV (איור 2) באמצעות ליפוזומים מזיקים. בשנת 4-6 ימים, כאשר CPE היה ברור, רקמות העור סופר המכילים rZIKV נאספו והוערך עבור נוכחות של וירוס (איור 4) ומשמש הגברה ויראלי בתאי ברו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> איור 4 : שחזור ואפיון מבחנה של rZIKV. (א) הצלה של rZIKV זיהומיות מ-BAC cdna שיבוט: התאים ברו ב 90% של המפגש (6-ובכן תבנית צלחת, טריליטים) היו מבוים או מנוכר עם 4 μg/טוב של pbac-zikv (איור 3), ועל הימים המצוין החוצה הזיהום, מגדל וירוס ברקמת התרבות הסופר נקבע על ידי שיטת הפלאק (pfu/mL). קווי השגיאה מצביעים על סטיות סטנדרטיות מתוך שלושה ניסיונות שונים של מעבר החצייה. הקו השחור המנוקד מציין את מגבלת הזיהוי (50 PFU/mL). (ב) ויראלי cpe: התאים ברו ב 90% זרימה (6-הצלחת בפורמט, מטריליטים) היו מבוים נגועים (למעלה) או נגוע (המשרד הראשי של 0.5 pfu/תא) עם rZIKV, ו ב 48 h הזיהום, נוכחות של cpe הוערך על ידי מיקרוסקופ אור. קנה מידה ברים = 100 μm. (ג) רובד נגיפי שיטת ההדבקה: התאים הורו בשעה 90% זרימה (12-הצלחת בפורמט) נדבקו rZIKV, ו ב 72 h לאחר מכן, שלטים ויראלי היו דמיינו על ידי כתמים גביש סגול (משמאל) או על ידי כתמים חיסוני ( ימין) באמצעות הפאן-פליווירוס E-החלבון האלקטרוני mAb 4G2. קנה מידה ברים = 5 מ"מ. (ד) immunofluorescence: התאים הורו ב 90% המפגש (24-הצלחת בפורמט, מטריליטים) נדבקו (ממוי של 0.5 pfu/תא) עם rZIKV ו, בשנת 48 h הזיהום, שנותחו על ידי immunofluorescence באמצעות mab 1176-56, ספציפי . חלבון אי גרעיני התא היו מוכתמים באמצעות DAPI. התמונה הממוזגת מייצגת של תאים של הנגועים ZIKV מוצג. הריבוע הלבן בחלק העליון של הימנית מייצג תמונה מוגדלת של תאים של הנגועים ZIKV. קנה מידה ברים = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

המגיפה האחרונה של וירוס Zika מדגיש את החשיבות של הקמת גישות גנטיות הפוכה לפתח חיסונים ו/או אסטרטגיות טיפוליות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי להציל וירוס מדבק רקומביננטי Zika מתוך שיבוט באורך מלא cDNA התאספו בכרומוזום מלאכותי חיידקי תחת השליטה של cytomegalovirus ירוס האדם המוקדם מיידית היזם.

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא הדור של וירוס זיקה רקומביננטי זיהומיות מ שיבוט cDNA באורך מלא, התאספו כרומוזום מלאכותי חיידקי תחת שליטתו של האמרגן האנושי cytomegalovirus מיידית מוקדם. הפיתוח של מערכת גנטית הפוכה עבור וירוסי RNA כגון וירוס זיקה מאפשרים מניפולציה ישירה של הגנום של הנגיף ללמוד היבטים מרובים של הביולוגיה הנגיפית ופתוגנזה ולפתח אסטרטגיית חיסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הבנייה של שיבוט זיהומיות וירוס זיקה כרומוזום מלאכותי חיידקי מתגבר על הרעילות הקשורה הגנום flavivirus ומאפשר הצלה של וירוס זיהומיות על ידי transfection ישיר של שיבוט CDNA BAC לתאים רגישים.מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על בניית שיבוטים cDNA זיהומיות יציבה ומתפקדת באופן מלא עבור flaviviruses אחרים, כמו גם וירוסי RNA אחרים תקע חיובי. כדי להתחיל בהליך זה, לבנות את שיבוט cDNA וירוס זיקה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, באמצעות אתרי הגבלה מתאימים. ארבעה שברי דנ"א המשתרעים על פני הגנום של נגיף זיקה, כשלצדם מקדם ה-CMV האנושי בקצה ה-5 פריים, וריבוזום נגיף הדלתא של הפטיטיס והפסקת הורמון הגדילה והרצפים הפוליאדניליים בקצה השלישי, מורכבים בפלסמיד כרומוזום מלאכותי חיידקי.ראשית, לגדל מושבה אחת של E.coli DH10B נושאת את שיבוט זיהומיות וירוס pBAC-זיקה בחמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל כלוראמפניקול במשך שמונה שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות. לאחר מכן, מוסיפים 500 מיליליטר של מדיום LB המכיל כלוראמפניקול לבקבוקון שני ליטר. מוסיפים מיליליטר מתרבות החיידקים המוכנה לבקבוק ומגדלים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 14 עד 16 שעות עד שה-OD600 הוא בערך 0.6 עד 0.8.לאחר מכן, השתמש בערכה מסחרית שפותחה במיוחד עבור טיהור BAC כדי לטהר את שיבוט cDNA זיהום BAC על ידי תזה אלקליין על ידי ביצוע הוראות היצרן. יום אחד לפני transfection, צלחת תאי Vero לתוך בארות של צלחת שש באר בצפיפות של 500, 000 תאים לתוך גם בינוני צמיחה. כדי להכין את תערובת ההמרה, הוסיפו ארבעה מיקרוגרם של שיבוט ה-CDNA BAC ל-250 מיקרוליטרים של סרום בגודל בינוני ומערבבים היטב.בצינור נפרד, לדלל 12 microliters של סוכן transfection ב 250 microliters של סרום מופחת בינוני. מערבולת לערבב ותדרגר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, שלב את CDNA BAC מדולל עם סוכן transfection.מערבבים בזהירות ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות. במהלך תקופת הדגירה הזו, השתמש במדיום צמיחה ללא אנטיביוטיקה כדי לשטוף את תאי Vero ולהשאיר את התאים במיליליטר אחד של מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, להפיץ את 500 microliters של cDNA ותערובת reagent transfection על תאי Vero dropwise.רוק את הצלחת קדימה ואחורה כדי לערבב לדגר את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. לאחר מכן, להסיר את מדיום transfection ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי עם אנטיביוטיקה. הדגירה את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני, הקפד לבדוק כל יום עבור אינדוקציה של אפקט ציטופתי.לאחר ארבעה עד שישה ימים של חילוף, כאשר CPE הוא סביב 50 עד 75% לאסוף את תרבות הרקמה supernatants ב 15 מיליליטר צינורות חרוט צנטריפוגה במשך 10 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר. לאחר מכן, לקצור את supernatants המכיל וירוס זיקה רקומביננטי להשליך את כדורי התא. אלקוט העל-טבעי בקריפטובות ואחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי להתחיל, לגדל תאי Vero ל 90%confluence. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהדביק אותם עם הנגיף שחולץ עם ריבוי של זיהום של 0.1 במדיום הצמיחה המכיל 2%FBS. מניחים את לוחות התאים באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני וסלעים כל 15 דקות לתקופת ההסגף של 90 דקות.לאחר סחתוע ויראלי, להסיר את inoculum ויראלי ולהוסיף מדיום צמיחה טרי עם 2%FBS. דגירה שלושה או ארבעה ימים באותם תנאים בשימוש בעבר. כאשר CPE הוא כ 75% לאסוף את תרבות הרקמה על טבעי צנטריפוגה כדי להסיר פסולת הסלולר.לאחר מכן, לקצור את העל-טבעי המכיל וירוס זיקה רקומביננטי ולהשליך את גלולה. אל תהפוך את העל-טבעי לקריפטובות. מניחים את הצינורות בקופסת הקפאה ומאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.כאשר מוכן, להסיר aliquot וירוס מהמקפיא ולקבוע את הטיטר ויראלי על ידי פלאק תדא כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, שיבוט cDNA יציב באורך מלא של זן וירוס זיקה ריו גרנדה דו נורטה נטאל נוצר על ידי שיבוט ברצף ארבעה שברי cDNA חופפים לתוך כרומוזום מלאכותי חיידקי pBeloBAC11 באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות ואתרי הגבלה ייחודיים נוכח בגנום ויראלי. שיבוט cDNA באורך מלא זה היה מוקף בקצה חמשת הפריים על ידי מקדם cytomegalovirus האנושי כדי לאפשר את הביטוי של RNA ויראלי בגרעין של תאים מפוספסים בקצה שלוש פריים על ידי ריבוזום וירוס דלתא הפטיטיס ואחריו סיום הורמון גדילה bovine ורצף polyadenylation לייצר RNAs המכיל את הקצה המדויק שלוש פריים של הגנום ויראלי.לאחר CDNA BAC מורכב, וירוס זיהומיות ניתן לשחזר בקלות לאחר transfection ישיר של תאי ורו רגישים עם שיבוט CDNA BAC באמצעות ליפוזומים cationic. באמצעות גישה זו, R זיקה וירוס RGN ניתן להציל עם titers גבוה יותר ממיליון יחידות לוח להרכיב למיליליטר. בנוסף, הנגיף שחולץ גורם לאפקט ציטופתי ברור ומייצר לוחות הומוגניים בגודל של כשני מילימטרים.זהות הנגיף שניצלה מאושרת באמצעות ניתוח שפעת חיסונית באמצעות נוגדן חד שבטי ספציפי לחלבון E של נגיף זיקה. בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי וירוס זיקה רקומביננטי זיהומיות ניתן להציל שיבוטים cDNA באורך מלא התאספו BAC. לסיכום, פיתחנו גישה גנטית הפוכה של וירוס זיקה רב עוצמה המבוססת על שימוש כרומוזום מלאכותי חיידקי שניתן להתאים כדי ליצור זיהומים יציבים ופונקציונליים עם שיבוט cDNA של וירוסי RNA אחרים בעלי גדיל חיובי כדי להקל על חקר הפתולוגיה, לפתח חיסון, או להקל על זיהוי של תרופה עם פעילות אנטי ויראלית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...