Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

लेखकों को बीएसी cDNA क्लोन पीढ़ी और Snezhana Dimitrova वीडियो तैयार करने के साथ मदद करने के लिए में उसकी तकनीकी सहायता के लिए कार्ला Gemez शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के भाग में स्पेन के अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय (MINCO, अनुदान संख्या BFU2016-79127-आर) F.A.T. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH, अनुदान संख्या 1R21AI120500) से एल.एम.एस.

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

संक्रामक cDNA क्लोन आरएनए वायरस के बुनियादी अनुसंधान और टीकों के विकास के लिए आवश्यक आणविक उपकरण का गठन और / हालांकि, flaviviruses सहित कई सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस के लिए, संक्रामक cDNA क्लोन की पीढ़ी क्लोन सीडीएनए की अस्थिरता के कारण मुश्किल है जब मानक उच्च-कॉपी-संख्या प्लाज्मिड का उपयोग करके बैक्टीरिया में प्रचारित किया जाता है। जेडआईकेवी और अन्य फ्लेवीवायरस के मामले में, यह अस्थिरता मुख्य रूप से वायरल जीनोम14,15,16,17 में मौजूद गुप्त जीवाणु प्रमोटरों से विषाक्त वायरल प्रोटीन की लीक अभिव्यक्ति के कारण है . यहाँ, हम एक स्थिर और शक्तिशाली प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थिर $IKV पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन एक एकल प्लाज्मिड के रूप में उत्पन्न करने के लिए, बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 के उपयोग के आधार पर (चित्र 2A) विषाक्तता समस्या को दूर करने के लिए, का उपयोग CMV प्रमोटर transfected कोशिकाओं के नाभिक में vRNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और HDV आर $ सटीक 3'-ends के साथ vRNAs उत्पन्न करने के लिए (चित्र 2B)। इस विधि का उपयोग करके, हमने सफलतापूर्वक जेडआईकेवी तनाव आरजीएन का एक पूरी तरह से स्थिर संक्रामक क्लोन उत्पन्न किया है जो अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के प्रत्यक्ष ट्रांसफेक्शन के बाद संक्रामक आरजेडआईकेवी के कुशल और विश्वसनीय वसूली की अनुमति देता है (चित्र 3 औरचित्र 3 और चित्र 4) .
पिछले कुछ वर्षों में एक बड़ा प्रयास किया गया है कि $IKV संक्रामक cDNA क्लोन के साथ जुड़े अस्थिरता की समस्याओं को दूर करने के लिए, और कई दृष्टिकोण सफलतापूर्वक18लागू किया गया है , cDNA टुकड़े 24 के इन विट्रो लिगेशन सहित ,25, कम कॉपी प्लाज्मिड19,20, मूक उत्परिवर्तनों की शुरूआत से गुप्त जीवाणु प्रवर्तकों की निष्क्रियता26,27, इनट्रॉन प्रविष्टि21, 22 , 23, गिब्सन विधानसभा विधि30, ISA विधि28,29, और CPER31का उपयोग करें . हालांकि इन दृष्टिकोण विषाक्तता की समस्या को दूर करने और IKV संक्रामक cDNA क्लोन उत्पन्न करने के लिए उपयोगी होते हैं, उनमें से कुछ परिश्रमी हैं और कई नुकसान मौजूद हैं, इन विट्रो लिगेशन और प्रतिलेखन कदम है कि वायरस को कम करने के लिए की आवश्यकता सहित वसूली दक्षता या चुप उत्परिवर्तनों की एक उच्च संख्या की शुरूआत गुप्त जीवाणु प्रमोटर है कि वायरल फिटनेस को प्रभावित कर सकता है निष्क्रिय करने के लिए, दूसरों के बीच. इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण निम्न लाभ प्रस्तुत करता है। i) बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 एक सख्ती से नियंत्रित प्रतिकृति है, सेल प्रति प्लाज्मिड के एक या दो प्रतियां रखते हुए, जो विषाक्तता को कम करता है और अस्थिर सीडीएए के बैक्टीरिया में स्थिर रखरखाव की अनुमति देता है। ii) बीएसी प्लाज्मिड का प्रचार और संशोधन लगभग पारंपरिक प्लाज्मिड के समान है, बड़े आकार के बीएसी-डीएनए टुकड़ों और कम प्रतिलिपि प्लाज्मिड में हेरफेर करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित मामूली संशोधनों पर विचार करते हुए। विशेष रूप से, बीएसी cDNA क्लोन भी लाल पुनर्संयोजन प्रणाली42,43,44 का उपयोग कर के समजात पुनर्संयोजन द्वारा ई कोलाई में संशोधित किया जा सकता है ) CMV प्रमोटर के उपयोग की अनुमति देता है छाया हुआ जेडआईकेवी vRNA के intracellular अभिव्यक्ति और एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम की आवश्यकता के बिना संक्रामक वायरस की वसूली. iv) संक्रामक आरजेडआईवीबीएसईवी बीएसी सीडीएनए क्लोन के साथ अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (उदा., वेरो) के प्रत्यक्ष संक्रमण के बाद उत्पन्न होता है। चूंकि स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए transfection आरएनए transfection की तुलना में अधिक कुशल है, बीएसी दृष्टिकोण के साथ वायरस वसूली दक्षता आरएनए प्रतिलिपि का उपयोग कर मनाया है कि अधिक से अधिक है, संस्कृति कोशिकाओं में मार्ग की संख्या को कम करने के लिए एक वायरल स्टॉक उत्पन्न करने के लिए और, फलस्वरूप, सेल संस्कृति अनुकूलन द्वारा अवांछित उत्परिवर्तनों की शुरूआत को सीमित.
अंत में, बीएसी दृष्टिकोण की क्षमता इस विधि के सफल उपयोग द्वारा समर्थित है (थोड़ा संशोधनों के साथ) डेंगू वायरस36सहित अन्य flaviviruses के संक्रामक cDNA क्लोन इंजीनियर करने के लिए, और में उच्च प्रभाव के कई कोरोनावायरस मानव और पशु स्वास्थ्य, जैसे ट्रांसमिसिबल गैस्ट्रोएंटराइटिस कोरोनावायरस37 (TGEV), बिल्ली संक्रामक पेरिटनिटिस वायरस38 (एफआईवी), मानव कोरोनावायरस OC4339 (HCoV-OC43), गंभीर श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस40 (SARS-CoV), और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस41 (MERS-CoV), दूसरों के बीच.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, वहाँ दो महत्वपूर्ण कदम है कि विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. एक महत्वपूर्ण विचार वायरल जीनोम है कि बीएसी प्लाज्मिड में अनुपस्थित रहे हैं में उपयुक्त अद्वितीय प्रतिबंध साइटों की पहचान है. यदि कोई पर्याप्त प्रतिबंध साइटों उपलब्ध हैं, नए प्रतिबंध साइटों मूक न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनों की शुरूआत से क्लोनिंग डिजाइन के दौरान उत्पन्न किया जा सकता है. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि बीएसी प्लाज्मिड प्रति सेल केवल एक या दो प्रतियों में मौजूद हैं, और इसलिए, बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के उच्च संदूषण के साथ बीएसी प्लाज्मिड की कम पैदावार उच्च के लिए डिज़ाइन किए गए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त की जाती है- और मध्यम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड. इस संभावित समस्या को आसानी से बड़ी संस्कृति की मात्रा का उपयोग कर दूर है और एक वाणिज्यिक किट विशेष रूप से बीएसी शुद्धि के लिए विकसित के साथ बीएसी प्लाज्मिड शुद्ध.
संक्षेप में, हम एक बीएसी है कि स्थिर और पूरी तरह कार्यात्मक संक्रामक cDNA क्लोन अन्य सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस के उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के उपयोग के आधार पर एक शक्तिशाली ]iKV रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण विकसित किया है इन के जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा के लिए वायरस और टीकों के विकास और /

$iKV Flaviviridae परिवार है कि वर्तमान में एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकालीन1का गठन के भीतर Flavivirus जीनस के एक मच्छर जनित सदस्य है. अन्य फ्लेवीवायरस की तरह, जेडीकेवी एक लिफाफावाला आरएनए वायरस है जिसकी एक मूर्ति-जैसे संरचना होती है जिसमें लगभग 10.8 केबी का एक सकारात्मक अर्थ होता है, एकल-संक्षिप्त आरएनए अणु (चित्र 1)2। वायरल जीनोम लगभग 3,423 एमिनो एसिड का एक बड़ा पॉलीप्रोटीन को एन्कोड करता है जिसे वायरल और सेलुलर प्रोटीज़ द्वारा तीन संरचनात्मक प्रोटीनों में संसाधित किया जाता है (कैप्सिड [सी], प्रीमेम्ब्रेन/मेम्ब्रेन [पीआरएम/एम], और लिफाफा [ई]) जो कि के गठन में शामिल हैं वायरल कणों और सात nonstructural (एनएस) प्रोटीन (NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, और NS5) कि जीनोम प्रतिकृति में भाग लेने, वायरस विधानसभा, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की चोरी (चित्र 1)3.
ऐतिहासिक रूप से, जेडीकेवी संक्रमण एक हल्के febrile बीमारी के साथ जुड़ा हुआ है4,5. हालांकि, दक्षिण और मध्य अमेरिका, दक्षिण प्रशांत, और कैरेबियन 6,7,8, और Guillain-Barr] सिंड्रोम की घटना के साथ अपने सहयोग भर में $iKV संक्रमण के विस्फोटक हाल ही में महामारी और माइक्रोसेफेली9,10,11, 12,13, ऐतिहासिक धारणा को बदल दिया है और एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ के रूप में जेडीकेवी की प्रासंगिकता को शक्तिशाली किया है । इस अर्थ में, संक्रामक सीडीएनए क्लोन जैसे आणविक उपकरणों के विकास से वायरल रोगजनन के अध्ययन और आनुवंशिक रूप से परिभाषित टीकों के विकास और जेडआईकेवी संक्रमण के उपचार के लिए एंटीवायरल दवाओं की पहचान की सुविधा होगी। के रूप में अन्य flaviviruses के लिए वर्णित है, वायरल जीनोम14 में गुप्त जीवाणु प्रमोटरों की उपस्थिति के कारण जीआईकेवी संक्रामक क्लोन की पीढ़ी मुश्किल है कि के प्रचार के दौरान विषाक्त वायरल प्रोटीन की लीक अभिव्यक्ति की अनुमति cDNA बैक्टीरिया में क्लोन मानक उच्च प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड15,16,17का उपयोग कर . इस विषाक्तता की समस्या को दूर करने के लिए पिछलेदो वर्षों में कई गैर-परंपरागत दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है। इनमें कम कॉपी-नंबर प्लाज्मिड19,20, विषाक्त क्षेत्रों को बाधित करने के लिए इनट्रॉन्स की प्रविष्टि21,22,23, सी डीएनए टुकड़ों के इनविट्रो लिगेशन का उपयोग शामिल है। 24 , 25, वायरल जीनोम में मौजूद गुप्त जीवाणु प्रमोटरों के उत्परिवर्तन मौन26,27, संक्रामक subgenomic amplicons (ISA )28,29, गिब्सन विधानसभा विधि30 और गोल बहुलक विस्तार अभिक्रिया (सीईईआर)31का उपयोग।
इसमें, हम एक पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन की इंजीनियरिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ]IKV तनाव ]IKV-RGN13, एक बीएसी का उपयोग करने के लिए विषाक्तता की समस्या पर काबू पाने के लिए, और BAC CDNA क्लोन के प्रत्यक्ष transfection द्वारा संक्रामक r$IKV के बचाव Vero में कोशिकाओं32, मानव टीकों के विकास के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित एक सेल लाइन33. इस प्रणाली में, वायरल जीनोम की पूर्ण लंबाई cDNA प्रतिलिपि बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 में इकट्ठा किया जाता है (चित्र 2A), एक कम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड (एक से दो प्रतियां प्रति सेल) Escherichia कोलाई एफ कारक35से व्युत्पन्न , जो बैक्टीरिया में इसके प्रसार के दौरान flavivirus दृश्यों की विषाक्तता को कम करता है. $IKV जीनोम के cDNA मानव CMV तत्काल-early प्रमोटर के नियंत्रण में pBeloBAC11 में इकट्ठा किया जाता है, सेलुलर आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय द्वारा transfected कोशिकाओं के नाभिक में वायरल (v)RNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और हेपेटाइटिस द्वारा 3'अंत में flanked डेल्टा वायरस (HDV) ribozyme (आरजेड), गोजातीय वृद्धि हार्मोन के दृश्यों के बाद (BGH) समाप्ति और polyadenylation संकेतों के लिए सिंथेटिक RNAs असर प्रामाणिक 5'- और वायरल जीनोम के 3'-ends, क्रमशः (चित्र 2B) . इस cDNA शुरू प्रणाली छाया हुआ वायरल आरएनए के intracellular अभिव्यक्ति में परिणाम है, एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम के लिए आवश्यकता के बिना संक्रामक जेडआईकेवी की वसूली की अनुमति. बीएसी दृष्टिकोण अन्य flaviviruses के लिए स्थिर और पूरी तरह कार्यात्मक संक्रामक cDNA क्लोन के निर्माण के लिए लागू एक शक्तिशाली पद्धति प्रदान करता है, साथ ही अन्य सकारात्मक फंसे आरएनए वायरस36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

हाल ही में दुनिया भर में फैलने के दौरान स्नायविक जटिलताओं के साथ जिका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमण के सहयोग और अनुमोदित टीकों की कमी और / जेडआईकेवी जीव विज्ञान का अध्ययन और चिकित्सीय और/या रोगनिरोधी दृष्टिकोणों का विकास। हालांकि, अन्य flaviviruses के साथ की तरह, बैक्टीरिया में इसके प्रवर्धन के दौरान वायरल दृश्यों की विषाक्तता के कारण जेडआईकेवी पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन की पीढ़ी बाधित किया गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) के उपयोग के आधार पर एक गैर-पारंपरिक दृष्टिकोण विकसित किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, IKV तनाव रियो ग्रांडे Norte नेटाल (ज़िकेवी-RGN) की पूर्ण लंबाई cDNA प्रतिलिपि चार सिंथेटिक डीएनए टुकड़े से उत्पन्न होता है और मानव साइटोमेगागोवायरस (CMV) के नियंत्रण में एकल प्रतिलिपि pBeloBAC11 प्लाज्मिड में इकट्ठे तत्काल-पूर्व प्रमोटर. इकट्ठे BAC cDNA क्लोन बैक्टीरिया में संचरण के दौरान स्थिर है, और संक्रामक पुनः संयोजक (आर) जेडआईकेवी बीएसी cDNA क्लोन के transfection के बाद वेरो कोशिकाओं में बरामद किया जाता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल flaviviruses के संक्रामक क्लोन की पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है, सहित ]IKV, और अन्य सकारात्मक खिंचाव आरएनए वायरस, विशेष रूप से बड़े जीनोम के साथ उन है कि जीवाणु के दौरान स्थिरता की समस्या है संचरण|

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल कई flaviviral दृश्यों के साथ जुड़े विषाक्तता समस्याओं को कम करने के लिए एक बीएसी का उपयोग कर स्थिर ]IKV पूर्ण लंबाई cDNA संक्रामक क्लोन की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. बीएसी सीडीएनए क्लोन से संक्रामक आरजेडआईकेवी की कुशल वसूली अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन के बाद आसानी से प्राप्त की जा सकती है (चित्र2)। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम क्रमिक रूप से बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 पारंपरिक क्लोनिंग तरीकों और अद्वितीय का उपयोग कर चार ओवरलैपिंग cDNA टुकड़े क्लोनिंग द्वारा एक स्थिर पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन उत्पन्न किया है वायरल जीनोम में मौजूद प्रतिबंध स्थल (चित्र 2)। पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन 5'अंत में मानव CMV प्रमोटर द्वारा flanked था transfected कोशिकाओं के नाभिक में vRNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और 3'-अंत में HDV आरजेड द्वारा पीछा BGH polyadenylation और समाप्ति दृश्यों द्वारा, आरएनए युक्त उत्पादन करने के लिए वायरल जीनोम का सटीक 3'-अंत (चित्र 2)। उत्पन्न बीएसी cDNA क्लोन के बैक्टीरिया में स्थिरता, मानक पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर अपने आसान हेरफेर के साथ, स्थिर पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन के तेजी से और विश्वसनीय पीढ़ी के लिए बीएसी cDNA दृष्टिकोण की क्षमता पर प्रकाश डाला गया अस्थिर वायरल जीनोम के साथ अन्य flaviviruses या सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस।
एक बार BAC cDNA क्लोन इकट्ठा किया गया था (चित्र 2), संक्रामक वायरस आसानी से बीएसी cDNA क्लोन के साथ अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के प्रत्यक्ष transfection के बाद ठीक किया जा सकता है cationic liposomesकाउपयोग (चित्र 3) . इस cDNA शुरू प्रणाली छाया हुआ vRNAके intracellular अभिव्यक्ति की अनुमति दी, एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम के लिए आवश्यकता के बिना संक्रामक वायरस की वसूली की अनुमति. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम 5 दिनों के बाद (चित्र4क) पर 106 PFU/mL से अधिक titers के साथ r$IKV-RGN बचाव करने में सक्षम थे। इसके अलावा, बचाया वायरस एक स्पष्ट सीपीई प्रेरित (चित्र 4B),आकार में लगभग 2 मिमी के सजातीय प्लेक उत्पन्न (चित्र 4C), और इसकी पहचान अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई थी (डेटा नहीं दिखाया) और इम्यूनोफ्लूरेंसी विश्लेषण mAb विशिष्ट का उपयोग कर के लिए $iKV ई प्रोटीन, 1176-56 (चित्र 4D)। इन विट्रो डेटा से संकेत मिलता है कि बरामद r$IKV-RGN कुशलतापूर्वक Vero कोशिकाओं में और स्तर के लिए एक प्राकृतिक ]IKV अलग32 (डेटा नहीं दिखाया) की तुलना में दोहराया. कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि संक्रामक r$IKV पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन एक बीएसी में इकट्ठे से बचाया जा सकता है.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> चित्र 1 : $IKV जीनोम संगठन और virion संरचना. (ए) जीनोम संगठन: जेडीकेवी में एक सकारात्मक एकल-स्लेडेड आरएनए होता है जिसका एकल पॉलीप्रोटीन के रूप में अनुवाद किया जाता है। अनुवादित पॉलीप्रोटीन को संरचनात्मक प्रोटीन कैप्सिड (सी, ब्लू), मैट्रिक्स (एम, ब्राउन) और एनवेलप (ई, हरे) और सात गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (एनएस2बी, एनएस 2 ए, एनएस 2 बी, एनएस 4ए, एनएस4बी, और एनएस 5) का उत्पादन करने के लिए वायरल (तीर) और मेजबान (डायमंड) प्रोटीज़ द्वारा छोड़ दिया गया था। वायरल जीनोम के अंत में 5' और 3' untranslated क्षेत्रों (UTRs) काली लाइनों के साथ संकेत दिया जाता है. (बी) विरियन संरचना: $iKV virions ई और एम प्रोटीन के साथ सजाया गया था, एक icosahedral की तरह संरचना के साथ एक लिपिड bilayer में लंगर डाले. वायरल एनवेलोप के नीचे वायरल न्यूक्लिओकैप्सिड वायरल जीनोमिक आरएनए से जुड़े सी प्रोटीन से बना था। यह आंकड़ा से अनुकूलित किया गया है [विला-P]rez एट अल.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> चित्र 2 : एक बीएसी में जेडआईकेवी पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन की विधानसभा। (ए ) pBeloBAC11 BAC: नियामक जीन पैराए, parB, parC, और repE,एफ कारक प्रतिकृति मूल (OriS), chloramphenicol प्रतिरोधी जीन (सीएमआर) के Schematic प्रतिनिधित्व , और लाख - जीन संकेत कर रहे हैं. संक्रामक जेडआईकेवी सीडीएनए क्लोन को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक प्रतिबंध स्थलों को रेखांकित किया गया है। (ख ) जिकेवी पूर्ण लंबाई के संक्रामक सीडीएनए क्लोन की विधानसभा pBeloBAC11 BAC: चार ओवरलैपिंग डीएनए टुकड़े ($1-$4), पूरे ]IKV जीनोम को कवर (चित्र 1) और संकेत प्रतिबंध साइटों द्वारा flanked, रासायनिक द्वारा उत्पन्न किए गए थे संश्लेषण और क्रमिक रूप से pBeloBAC11 में क्लोन संक्रामक ]IKV cDNA क्लोन PBAC-ज़िकेवी उत्पन्न करने के लिए। पूर्ण लंबाई ]IKV संक्रामक cDNA मानव cytomegagovirus तत्काल-early प्रमोटर (CMV) के नियंत्रण में इकट्ठा किया गया था और HDV ribozyme (आरजेड) और गोजातीय विकास हार्मोन (BGH) समाप्ति और polyadeny अनुक्रम द्वारा 3'अंत में flanked. वायरल जीनों और नियामक तत्वों के परिवर्णी शब्द चित्र 1में वर्णित हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> चित्र 3 : BAC cDNA क्लोन से r$IKV उत्पन्न करने के लिए कार्यप्रवाह. संगम के 90% पर वेरो कोशिकाओं को एक परत में स्थानांतरित कर दिया गया था जिसमें आईसीवी पूर्ण लंबाई संक्रामक सीडीएनए क्लोन पीबीएसी-जेडआईकेवी (चित्र 2) को कायनिक लिपोसोम का उपयोग करते हुए किया गया था. 4-6 दिनों के बाद, जब सीपीई स्पष्ट था, ऊतक संस्कृति supernatants युक्त r$IKV एकत्र किया गया और वायरस की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया (चित्र 4) और वेरो कोशिकाओं में वायरल प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> चित्र 4 : वसूली और इन विट्रो में r$IKV की विशेषता. (क) बीएसी सीडीएनए क्लोन से संक्रामक आरजेडआईकेवी का बचाव: संगम के 90% पर वेरो कोशिकाओं (6-वेल प्लेट प्रारूप, ट्रिपीलेट) कोनकली-ट्रांसफेक्टेड या 4 डिग्री/ ऊतक संस्कृति supernatants में वायरस titers पट्टिका परख (PFU/ त्रुटि पट्टियाँ तीन भिन्न transfection प्रयोगों से मानक विचलन इंगित करती हैं. डॉटेड काली रेखा का पता लगाने की सीमा (50 PFU/mL) इंगित करता है। (बी) वायरल सीपीई: 90% संगम (6-वेल प्लेट प्रारूप, ट्रिप्लिकेट्स) पर वेरो कोशिकाओं को नकली संक्रमित (ऊपर) या संक्रमित (एमओआई 0.5 PFU/सेल) के साथ आरजेडआईकेवी के साथ, और 48 एच पोस्टइंफ़ेस्ट पर, सीपीई की उपस्थिति का मूल्यांकन प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। स्केल बार ] 100 डिग्री सेल्सियस. (सी) वायरल पट्टिका परख और इम्यूनोस्टेनिंग: 90% संगम पर वेरो कोशिकाएं (12-वेल प्लेट प्रारूप) आरजेडीकेवी से संक्रमित थीं, और 72 एच postinfection पर, वायरल प्लेक क्रिस्टल बैंगनी धुंधला (बाएं) या इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा विज़ुअलाइज़ किए गए थे () दाएँ) पैन-फ्लाविवायरस ई प्रोटीन mAb 4G2 का उपयोग कर. स्केल बार ] 5 मिमी (डी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस: 90% संगम पर वेरो कोशिकाओं (24-वेल प्लेट प्रारूप, triplicates) संक्रमित थे (MOI 0.5 PFU/सेल) के साथ r$IKV और, 48 एच postinfection पर, mAb 1176-56 का उपयोग कर इम्यूनोफ्लुओरेंस द्वारा विश्लेषण किया गया, $IKV के लिए विशिष्ट ई प्रोटीन. सेल नाभिक DAPI के साथ दाग रहे थे. $IKV-संक्रमित वेरो कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि मर्ज की गई छवि दिखाया गया है। ऊपर दाईं ओर सफेद वर्ग ]iKV संक्रमित वेरो कोशिकाओं की एक विस्तारित छवि का प्रतिनिधित्व करता है. स्केल बार्स ] 100 $m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

जिका वायरस की हाल ही में महामारी टीकों और/या चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण स्थापित करने के महत्व पर प्रकाश डाला गया। यहाँ, हम एक पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन मानव साइटोमेगागोवायरस तत्काल-early प्रमोटर के नियंत्रण में एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र में इकट्ठे से एक संक्रामक रिकॉमबिनेंट जिका वायरस को बचाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.

एक जीवाणु कृत्रिम क्रोमोसोम CDNA क्लोन से रिकॉमबिनेंट जिका वायरस का बचाव

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

इस प्रायोगिक प्रक्रिया का समग्र लक्ष्य एक पूर्ण लंबाई सीडीएनए क्लोन से संक्रामक पुनर्संयोजन ज़िका वायरस की पीढ़ी है, जो मानव साइटोमेगालोवायरस के नियंत्रण में एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र में इकट्ठा होता है। जीका वायरस जैसे आरएनए वायरस के लिए रिवर्स जेनेटिक सिस्टम का विकास वायरस जीनोम के सीधे हेरफेर को वायरल जीव विज्ञान और रोगजनन के कई पहलू का अध्ययन करने और वैक्सीन रणनीति विकसित करने की अनुमति देता है । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र के रूप में जीका वायरस संक्रामक क्लोन का निर्माण फ्लेविवायरस जीनोम से जुड़ी विषाक्तता पर काबू पा लेता है और बीएसी सीडीएनए क्लोन के प्रत्यक्ष ट्रांसफेक्शन द्वारा संक्रामक वायरस के बचाव की अनुमति देता है अतिसंवेदनशील कोशिकाओं में ।इस पद्धति को अन्य फ्लैविवायरस के साथ-साथ अन्य सकारात्मक-फंसे आरएनए वायरस के लिए स्थिर और पूरी तरह से कार्यात्मक संक्रामक सीडीएनए क्लोन के निर्माण के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, विनियोजित प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित ज़िका वायरस सीडीएनए क्लोन का निर्माण करें। जीका वायरस जीनोम में फैले चार डीएनए टुकड़े पांच-प्राइम एंड पर मानव सीएमवी प्रमोटर और हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस राइबोसोम और गोजातीय विकास हार्मोन टर्मिनेशन और तीन-प्राइम एंड पर पॉलीएडेनिलेशन सीक्वेंस एक बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम प्लाज्मिड में इकट्ठे होते हैं ।सबसे पहले, ई. कोलाई DH10B की एक कॉलोनी विकसित करने के लिए पौंड माध्यम के पांच मिलीलीटर में pBAC-Zika वायरस संक्रामक क्लोन ले जाने के कोमल मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर आठ घंटे के लिए क्लोरम्फेनिकोल युक्त । फिर, दो लीटर फ्लास्क में क्लोरम्फेनिकोल युक्त पौंड माध्यम के 500 मिलीलीटर जोड़ें। फ्लास्क में तैयार बैक्टीरियल कल्चर का एक मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को 14 से 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाएं जब तक कि OD600 लगभग 0.6 से 0.8 न हो जाए।इसके बाद, निर्माता के निर्देशों का पालन करके क्षारीय लाइसिस द्वारा बीएसी संक्रमण सीडीएनए क्लोन को शुद्ध करने के लिए बीएसी शुद्धि के लिए विशेष रूप से विकसित एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करें। ट्रांसफैक्शन से एक दिन पहले, प्लेट वेरो कोशिकाओं को विकास माध्यम में ५००, 000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से घनत्व पर छह-अच्छी थाली के कुओं में । ट्रांसफेक्शन मिक्स तैयार करने के लिए बीएसी सीडीएनए क्लोन के चार माइक्रोग्राम को सीरम कम मीडियम के 250 माइक्रोलीटर में डालकर सावधानी से मिलाएं।एक अलग ट्यूब में सीरम कम माध्यम के 250 माइक्रोलीटर में ट्रांसफेक्शन एजेंट के 12 माइक्रोलीटर को पतला करें। भंवर मिश्रण और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए । इसके बाद, पतला बीएसी सीडीएनए को ट्रांसफैक्शन एजेंट के साथ मिलाएं।20 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ध्यान से और इनक्यूबेट मिलाएं। इस इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, वेरो कोशिकाओं को धोने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना विकास माध्यम का उपयोग करें और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा माध्यम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को छोड़ दें। फिर, सीडीएनए के 500 माइक्रोलीटर वितरित करें और वेरो कोशिकाओं ड्रॉपवाइज पर ट्रांसफैक्शन रीएजेंट मिश्रण वितरित करें।छह घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को मिलाने और इनक्यूबेट करने के लिए प्लेट को आगे और पीछे रॉक करें । इसके बाद ट्रांसफेक्शन मीडियम को हटा दें और एंटीबायोटिक्स के साथ फ्रेश ग्रोथ मीडियम के दो मिलीलीटर डालें। कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें, जिससे साइटोपैथिक प्रभाव को शामिल करने के लिए हर दिन जांच करना सुनिश्चित किया जा सके।ट्रांसफैक्शन के चार से छह दिनों के बाद, जब सीपीई लगभग 50 से 75% है, सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 15 मिलीलीटर शंकु नलियों और अपकेंद्रित्र में ऊतक संस्कृति सुपरनेटेंट को 10 मिनट तक इकट्ठा करता है। फिर, पुनर्संयोजन ज़िका वायरस युक्त सुपरनेटेंट को फसल करें और सेल छर्रों को त्यागें। क्रायोट्यूब में सुपरनेट को अलीकोट करें और उन्हें शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।शुरू करने के लिए, 90% संगम के लिए वेरो कोशिकाओं को विकसित करें। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं और उन्हें 2% एफबीएस युक्त विकास माध्यम में 0.1 के संक्रमण की बहुलता के साथ बचाया वायरस से संक्रमित करें। कोशिकाओं की प्लेटों को 90 मिनट की सोखने की अवधि के लिए हर 15 मिनट में 5% कार्बन डाइऑक्साइड और रॉक के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें।वायरल सोखने के बाद, वायरल इनोकुलम को हटा दें और 2% एफबीएस के साथ नए विकास माध्यम जोड़ें। पहले इस्तेमाल की गई एक ही शर्तों पर तीन या चार दिन इनक्यूबेट करें । जब सीपीई लगभग 75% है ऊतक संस्कृति सुपरनाट और अपकेंद्रित्र सेलुलर मलबे को हटाने के लिए इकट्ठा।फिर, पुनर्संयोजन ज़िका वायरस युक्त सुपरनेटेंट को फसल करें और गोली को त्याग दें। सुपरनेट को क्रायोट्यूब में डालें। ट्यूबों को फ्रीजिंग बॉक्स में रखें और उन्हें माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।जब तैयार हो, फ्रीजर से एक वायरस aliquot निकालें और पट्टिका परख द्वारा वायरल टाइटर निर्धारित के रूप में पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित । इस अध्ययन में, जीका वायरस तनाव रियो ग्रांडे डो नोर्टे नेटाल का एक स्थिर, पूर्ण लंबाई का सीडीएनए क्लोन पारंपरिक क्लोनिंग विधियों और वायरल जीनोम में मौजूद अद्वितीय प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र pBeloBAC11 में चार ओवरलैपिंग सीडीएनए टुकड़ों को क्रमिक रूप से क्लोन करके उत्पन्न होता है । इस पूर्ण लंबाई सीडीएनए क्लोन मानव साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर द्वारा पांच प्रधानमंत्री के अंत में घिरा हुआ था ताकि संक्रमित कोशिकाओं के नाभिक में वायरल आरएनए की अभिव्यक्ति की अनुमति दी जा सके और हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस राइबोसोम द्वारा तीन-प्राइम एंड पर गोजातीय विकास हार्मोन समाप्ति और पॉलीएडेनिलेशन अनुक्रम के बाद आरएनए का उत्पादन किया जा सके जिसमें जीनोम के सटीक तीन-प्राइम एंड होते हैं ।एक बार बीएसी सीडीएनए इकट्ठा हो जाने के बाद, संक्रामक वायरस को आसानी से बीएसी सीडीएनए क्लोन के साथ अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के प्रत्यक्ष ट्रांसफैक्शन के बाद प्राप्तैस लिपोसोम का उपयोग करके बरामद किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, आर ज़िका वायरस आरजीएन को प्रति मिलीलीटर १,०,० पट्टिका बनाने वाली इकाइयों से अधिक के साथ बचाया जा सकता है । इसके अलावा, बचाए गए वायरस एक स्पष्ट साइटोपैथिक प्रभाव को प्रेरित करता है और आकार में लगभग दो मिलीमीटर के समरूप सजीले टुकड़े उत्पन्न करता है।बचाया वायरस पहचान Zika वायरस ई प्रोटीन के लिए एक विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि की है । कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि संक्रामक recombinant Zika वायरस पूर्ण लंबाई सीडीएनए क्लोन एक बीएसी में इकट्ठे से बचाया जा सकता है । संक्षेप में, हमने एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र के उपयोग के आधार पर एक शक्तिशाली ज़िका वायरस रिवर्स जेनेटिक दृष्टिकोण विकसित किया है जिसे पैथोलॉजी के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने, और एंटीवायरल गतिविधि के साथ दवा की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए अन्य सकारात्मक-स्ट्रैंड आरएनए वायरस के सीडीएनए क्लोन के साथ स्थिर और कार्यात्मक संक्रमण उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

पुनः संयोजक इन्फ्लुएंजा वायरस के डीएनए प्लाज्मिड से पीढ़ी

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

सीडीएनए से संयोजक न्यूकासल रोग वायरस का बचाव

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों: आरएनए वायरस सकारात्मक-कतरा के अध्ययन के लिए एक कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; इंटरफेरॉन की रोगनिरोधी प्रभाव

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

एक नई दुनिया Zika वायरस संक्रमित क्लोन से पुनः संयोजक वायरस के बचाव और विशेषता

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

पता लगाने और संयोजक प्रोटोटाइप फोम वायरस Integrase के शोधन के दौरान Nuclease संदूषण को हटाने

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक Epitope डिस्कवरी

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

एक सरल प्रवाह Cytometry आधारित परख में निर्धारित करने के लिए इन विट्रो एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू के वायरस का उपयोग Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

संक्रमित Ifnar1 के Immunoprivileged अंगों में Zika वायरस-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन-चूहों/

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

प्राथमिक मानव कोशिकाओं में Zika विषाणु के एंटीबॉडी-आश्रित संवर्धन की ठहराव

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...