Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Carla Gàmez per la sua assistenza tecnica nella generazione di cloni BAC cDNA e Snezhana Dimitrova per aver aiutato con la preparazione video. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del Ministero spagnolo dell'Economia e della Competitività (MINECO, numero di sovvenzione BFU2016-79127-R) alla F.A.T. e dagli Istituti Nazionali di Sanità (NIH, numero di sovvenzione 1R21AI120500) a L.M.S. e F.A.T.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I cloni infettivi di cDNA costituiscono strumenti molecolari essenziali per la ricerca di base dei virus dell'RNA e lo sviluppo di vaccini e/o l'identificazione di strategie antivirali. Tuttavia, per molti virus dell'RNA a filamento positivo, compresi i flavivirus, la generazione di cloni infettivi di cDNA è difficile a causa dell'instabilità dei cDNA clonati quando vengono propagati nei batteri che utilizzano plasmidi standard ad alto numero di copie. Nel caso di iKV e di altri flavivirus, questa instabilità è dovuta principalmente all'espressione che perde le proteine virali tossiche dei promotori batterici criptici presenti nel genoma virale14,15,16,17 . Qui, descriviamo un protocollo alternativo e potente per generare un clone cDNA infettivo stabile di .IKV come un singolo plasmide, basato sull'uso del pBeloBAC1134 (Figura 2A) per superare il problema della tossicità, l'uso del Promotore di CMV per consentire l'espressione del vRNA nel nucleo delle cellule trasfette, e l'HDV R z per generare vRNA con accurate 3'-estremità (Figura 2B). Utilizzando questo metodo, abbiamo generato con successo un clone infettivo completamente stabile del RGN di deformazione di Figura 4).
Un enorme sforzo è stato fatto negli ultimi anni per superare i problemi di instabilità associati ai cloni di cDNA infettivi di IKV, e diversi approcci sono stati implementati con successo18, tra cui la legatura in vitro dei frammenti di cDNA24 ,25, plasmidi a bassa copia19,20, l'inattivazione di promotori batterici criptici con l'introduzione di mutazioni silenziose26,27, inserimento intron21, 22 Milia , 23, il metodo assembly Gibson30, il metodo ISA28,29e l'utilizzo di CPER31. Anche se questi approcci superano il problema della tossicità e sono utili per generare cloni di cDNA infettivi di IKV, alcuni di loro sono laboriosi e presentano diversi svantaggi, tra cui la necessità di passi di ligazione e trascrizione in vitro che riducono il virus l'efficienza di recupero o l'introduzione di un elevato numero di mutazioni silenziose per inattivare il promotore batterico criptico che potrebbe influenzare la forma fisica virale, tra gli altri. L'approccio descritto in questo protocollo presenta i vantaggi seguenti. i) Il plasmide BACpBeloBAC1134 ha una replica rigorosamente controllata, mantenendo una o due copie di plasmide per cellula, che riduce al minimo la tossicità e consente una manutenzione stabile nei batteri di cDNA instabili. ii) La propagazione e la modifica dei plasmidi BAC sono quasi simili a quelle dei plasmidi convenzionali, considerando le lievi modifiche descritte in questo protocollo per manipolare frammenti di DNA di grandi dimensioni e plasmidi a bassa copia. In particolare, il clone BAC cDNA può anche essere modificato in E. coli da ricombinazione omologa utilizzando il sistema di ricombinazione rosso42,43,44. 3) L'uso di promotore CMV consente il l'espressione intracellulare del vRNA di VRNA e il recupero di virus infettivi senza richiedere una fase di trascrizione in vitro. iv) Dopo la trasfezione diretta di cellule sensibili (ad esempio, Vero) viene generato il r-IKV infettivo con il clone BAC cDNA. Poiché la trafezione del DNA nelle cellule dei mammiferi è più efficiente della trasfezione dell'RNA, l'efficienza di recupero del virus con l'approccio BAC è superiore a quella osservata utilizzando le trascrizioni dell'RNA, riducendo il numero di passaggi nelle cellule di coltura per generare uno stock virale e, di conseguenza, limitando l'introduzione di mutazioni indesiderate per adattamento della coltura cellulare.
Infine, il potenziale dell'approccio BAC è supportato dall'uso di questo metodo (con lievi modifiche) per progettare cloni infettivi di cDNA di altri flavivirus, tra cui il virus della dengue36e diversi coronavirus di alto impatto salute umana e animale, come il coronavirus trasmissibile di gastroenterite37 (TGEV), il virus della peritonite infettiva felina38 (FIPV), il coronavirus umano OC4339 (HCoV-OC43), grave sindrome respiratoria acuta40 (SARS-CoV), e sindrome respiratoria del Medio Oriente coronavirus41 (MERS-CoV), tra gli altri.
Nel protocollo qui descritto sono presenti due passaggi critici da considerare. Una considerazione importante è l'identificazione di appositi siti di restrizione unici nel genoma virale che sono assenti nel plasmide BAC. Se non sono disponibili siti di restrizione adeguati, è possibile generare nuovi siti di restrizione durante la progettazione della clonazione mediante l'introduzione di mutazioni mutiadi silenziosi. Un'altra questione importante è che i plasmidi BAC sono presenti in una o due copie per cellula, e quindi, basse rese di plasmidi BAC con un'elevata contaminazione del DNA genomico batterico sono ottenuti utilizzando protocolli standard progettati per plasmidi medio-copia-numero. Questo potenziale problema è facilmente superata utilizzando grandi volumi di coltura e purificando il plasmide BAC con un kit commerciale sviluppato appositamente per la purificazione BAC.
In sintesi, abbiamo sviluppato un potente approccio genetico inverso basato sull'uso di un BAC che potrebbe essere adattato per generare cloni di cDNA infettivi stabili e completamente funzionali di altri virus dell'RNA a filamento positivo per facilitare lo studio della biologia di questi virus e lo sviluppo di vaccini e/o per facilitare l'identificazione dei farmaci antivirali.

Il gene è un membro del genere Flavivirus all'interno della famiglia Flaviviridae che attualmente costituisce un'emergenza sanitaria pubblica globale1. Come altri flavivirus, il virus dell'RNA è avvolto con una struttura icosaedro che contiene un senso positivo, molecola di RNA a filamento singolo di circa 10,8 kb (Figura 1)2. Il genoma virale codifica una grande poliproteina di circa 3.423 aminoacidi trasformati da proteasi virali e cellulari in tre proteine strutturali (capside [C], premembrane/membrana [prM/M]e busta [E]) che sono coinvolte nella formazione del particelle virali e sette proteine non strutturali (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) che partecipano alla replicazione del genoma, all'assemblaggio dei virus e all'evasione della risposta immunitaria dell'ospite (Figura 1)3.
Storicamente, l'infezione da IKV è stata associata a una lieve malattia febbrile4,5. Tuttavia, l'esplosiva recente pandemia di infezioni da IKV insud e Centro America, nel Pacifico meridionale e nei Caraibi 6,7,8e la sua associazione con il verificarsi della sindrome di Guillain-Barré e la microcefalia9,10,11,12,13, hanno cambiato la percezione storica e potenziato la rilevanza di IKV come un importante agente patogeno umano. In questo senso, lo sviluppo di strumenti molecolari, come i cloni infettivi di cDNA, faciliterà lo studio della patogenesi virale e lo sviluppo di vaccini geneticamente definiti e l'identificazione di farmaci antivirali per il trattamento dell'infezione da .IKV. Come descritto per altri flavivirus, la generazione di cloni infettivi di cloni cDNA nei batteri che utilizzano plasmidi standard ad alto numero di copia15,16,17. Per superare questo problema di tossicità, negli ultimi due anni sono stati attuati con successo diversi approcci non tradizionali18. Questi includono l'uso di plasmidi a basso numero di copie19,20, l'inserimento di introni per disturbare le regioni tossiche21,22,23, la legatura in vitro di frammenti di cDNA 24 Mi lasa' di , 25, silenziamento mutazionale dei promotori batterici criptici presenti nel genoma virale26,27, ampli subgenomici infettivi (ISA)28,29, il metodo di assemblaggio Gibson30 e l'uso della reazione circolare di estensione della polimerasi (CPER)31.
Qui di seguito, descriviamo il protocollo dettagliato per l'ingegneria di un clone cDNAa lunghezza intera del ceppo di IKV, il deformazione di IKV, utilizzando un BAC per superare il problema della tossicità, e il salvataggio di r-IKV infettivo mediante trasfezione diretta del clone BAC cDNA in Vero cellule32, una linea cellulare approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) per lo sviluppo di vaccini umani33. In questo sistema, la copia cDNA completa del genoma virale viene assemblata nel pLasmid bacBeloBAC1134 (Figura2A), un plasmide a basso numero di copie (da una a due copie per cellula) derivato dal fattore F Escherichia coli 35, che riduce al minimo la tossicità delle sequenze di flavivirus durante la sua propagazione nei batteri. Il cDNA del genoma di IKV è assemblato in pBeloBAC11 sotto il controllo del promotore umano CMV immediato-precoce, per consentire l'espressione dell'RNA virale (v)nel nucleo delle cellule transfected da polimerasi iI dell'RNA cellulare, e affiancato all'estremità 3 dall'epatite il ribozyme del virus delta (HDV), seguito dalle sequenze della terminazione dell'ormone della crescita bovina (BGH) e dei segnali di poliadenilazione per produrre RNA sintetici con effetti di autentici 5' e 3'-estremità del genoma virale, rispettivamente (Figura 2B). Questo sistema lanciato da cDNA si traduce nell'espressione intracellulare dell'RNA virale con tappo, permettendo il recupero di un'imposizione infettiva di ziKV senza la necessità di una fase di trascrizione in vitro. L'approccio BAC fornisce una potente metodologia applicabile alla costruzione di cloni cDNA infettivi stabili e completamente funzionali per altri flavivirus, così come altri virus RNA a filamento positivo36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

Durante la recente epidemia in tutto il mondo, l'associazione con complicanze neurologiche e la mancanza di vaccini e/o antivirali approvati hanno sottolineato l'urgente necessità di sviluppare sistemi genetici inversi studio della biologia e dello sviluppo di approcci terapeutici e/o profilattici. Tuttavia, come con altri flavivirus, la generazione di cloni di cDNA infettivi di iKV è stata ostacolata a causa della tossicità delle sequenze virali durante la sua amplificazione nei batteri. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato un approccio non tradizionale basato sull'uso di cromosomi artificiali batterici (BAC). Utilizzando questo approccio, la copia cDNA completa del ceppo Rio Grande do Norte Natal viene generata da quattro frammenti di DNA sintetico e assemblata nel plasmide a copia singola sotto il controllo del citomegalovirus umano (CMV) promotore immediato-rapido. Il clone BAC cDNA assemblato è stabile durante la propagazione nei batteri, e il ricombinante infettivo (r)-IKV viene recuperato nelle cellule Vero dopo la trasfezione del clone BAC cDNA. Il protocollo qui descritto fornisce una potente tecnica per la generazione di cloni infettivi di flavivirus, tra cui la IKV, e altri virus dell'RNA a filamento positivo, in particolare quelli con grandi genomi che hanno problemi di stabilità durante i batteri propagazione.

Il protocollo qui descritto consente la generazione di cloni infettivi cDNA a lunghezza composta da .IKV utilizzando un BAC per ridurre al minimo i problemi di tossicità associati a diverse sequenze flavivirali. Il recupero efficiente di r-IKV infettivo dal clone BAC cDNA può essere facilmente ottenuto dopo la trasfezione di cellule Vero sensibili (Figura 2). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato un clone cDNA stabile a lunghezza intera del ceppo RGN32 di .IKV clonando in sequenza quattro frammenti di cDNA sovrapposti nel pBeloBAC1134 del plascoBAC 11 di BAC utilizzando metodi di clonazione convenzionali e unici siti di restrizione presenti nel genoma virale (Figura 2). Il clone cDNA a tutta lunghezza è stato affiancato all'estremità 5'dall'emittente umano CMV per consentire l'espressione del vRNA nel nucleo delle cellule trasfette, e all'estremità 3'dall'HDV R 'seguito dalle sequenze di poliadenilazione e terminazione del BGH, per produrre RNA contenenti l'esatto 3'-fine del genoma virale (Figura 2). La stabilità nei batteri del clone BAC cDNA generato, insieme alla sua facile manipolazione utilizzando tecnologie standard del DNA ricombinante, evidenzia il potenziale dell'approccio BAC cDNA per la generazione rapida e affidabile di cloni cDNA a lunghezza intera stabili di Altri flavivirus o virus dell'RNA dal filamento positivo con genomi virali instabili.
Una volta assemblato il clone BAC cDNA (Figura 2), il virus infettivo potrebbe essere facilmente recuperato dopo la trasfezione diretta di cellule Vero sensibili con il clone BAC cDNA utilizzando liposomi cationici(Figura 3). Questo sistema lanciato da cDNA ha permesso l'espressione intracellulare del vRNAcon tappo, consentendo il recupero di virus infettivi senza la necessità di una fase di trascrizione in vitro. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di salvare r-IKV-RGN con titers superiore a 106 PFU/mL a 5 giorni posttrasfezione (Figura 4A). Inoltre, il virus salvato ha indotto un CPE chiaro (Figura 4B), generato placche omogenee di circa 2 mm (Figura4C),e la sua identità è stata confermata dal sequenziamento (dati non mostrati) e dall'analisi dell'immunofluorescenza utilizzando l'analisi per la proteina IKV E, 1176-56 (Figura 4D). I dati in vitro indicano che il r-IKV-RGN recuperato è stato replicato in modo efficiente nelle cellule Vero e a livelli rispetto a un isolare32 (dati non mostrati). Nel complesso, questi risultati dimostrano che il r-IKV infettivo può essere salvato da cloni cDNA a lunghezza intera assemblati in un BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> Figura 1 : Organizzazione del genoma di IKV e struttura virione. (A) Organizzazione del genoma: IKV contiene un RNA positivo a filamento singolo che viene tradotto come un singolo poliproteina. La poliproteina tradotta è stata scissa da proteasi virali (frecce) e ospite (diamanti) per produrre le proteine strutturali capsid (C, blu), matrice (M, marrone), e envelop (E, verde), e sette proteine non strutturali (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5). Le regioni non tradotte a 5' e 3' (UTR) alla fine del genoma virale sono indicate con linee nere. (B) Struttura Virion: i virioni di IKV erano decorati con le proteine E e M, ancorati in un bistrato lipidico con una struttura icosaedrale. Sotto l'involucro virale c'era il nucleocapside virale composto dalla proteina C associata all'RNA genomico virale. Questa cifra è stata adattata da . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> Figura 2 : Assemblaggio del clone infettivo cDNA di .IKV in un BAC. (A) Rappresentazione schematica del pBeloBAC11 BAC:I geni regolatori parA, parB, parCe repE, l'origine della replicazione delfattore F (OriS), il gene resistente al cloramenico (Cmr) e il lac Sono indicati il gene . I relativi siti di restrizione utilizzati per assemblare il clone infettivo del cDNA di IKV sono sottolineati. (B) Assemblaggio del clone di cDNA infettivo a lunghezza intera di IKV nel pBeloBAC11 BAC:Quattroframmenti di DNA sovrapposti (n. 1 -4), che coprono l'intero genoma di sintesi e clonato in sequenza in pBeloBAC11 per generare il clone infettivo del cDNA di iKV pBAC-IKV. Il cDNA infettivo di iKV a piena lunghezza è stato assemblato sotto il controllo del promotore immediato-precoce del citomegalovirus umano (CMV) e affiancato all'estremità 3'dall'HDV ribozyme (R) e le sequenze di ormone della crescita bovina (BGH) e sequenze di poliambonazione. Gli acronimi per i geni virali e gli elementi regolatori sono come descritto nella Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> Figura 3 : flusso di lavoro per la generazione di r-IKV dal clone BAC cDNA. Le cellule di vero al 90% della confluenza sono state trascate nel monostrato con il clone infettivo cDNA pBAC-IKV (Figura 2) utilizzando liposomi cationici. A 4-6 giorni dopo la trasfezione, quando la CPE era evidente, i supernatanti della coltura tissutale contenenti r-IKV sono stati raccolti e valutati per la presenza di virus (Figura 4) e utilizzati per l'amplificazione virale nelle cellule Vero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> Figura 4 : Recupero e caratterizzazione in vitro di r-IKV. (A) Salvataggio di r-IKV infettivo dal clone BAC cDNA: le cellule Vero al 90% della confluenza (formato piastra 6-po, triplicati) sono state trascate in modo fittizio o trascate con 4 i feticidell di virus nei supernatanti della coltura tissutale sono stati determinati dal saggio di placca (PFU/mL). Le barre di errore indicano deviazioni standard da tre diversi esperimenti di trasfezione. La linea nera tratteggiata indica il limite di rilevazione (50 PFU/mL). (B) Le cellule CPE:Vero virali al 90% di confluenza (formato piastra 6-po, triplicati) sono state infettate in modo mock (top) o infettate (MOI di 0,5 PFU/cellula) con r'IKV, e a 48 h di post-infezione, la presenza di CPE è stata valutata dalla microscopia. Le barre di scala ( 100 m. (C) L'analto della placca virale e l'immunostaining: le cellule nere al 90% della confluenza (formato 12-beh piastra) sono state infettate con r-IKV, e a 72 h di post-infezione, le placche virali sono state visualizzate da colorazione viola cristallina (a sinistra) o immunostaining ( a destra) utilizzando la proteina pan-flavivirus E mAb 4G2. Barre di scala - 5 mm. (D) Immunofluorescenza:Le cellule veroali al 90% di confluenza (formato piastra 24-po, triplicati) sono state infettate (MOI di 0,5 PFU/cellula) con r-IKV e, a 48 h di post-infezione, analizzate dall'immunofluorescenza utilizzando il mAb 1176-56, specifico per E proteina. I nuclei cellulari sono stati macchiati con DAPI. Viene visualizzata un'immagine rappresentativa delle cellule Vero infettate da SIMLV. Il quadrato bianco in alto a destra rappresenta un'immagine ingrandita delle cellule Vero infettate da SIMLV. Barre di scala : 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

La recente epidemia del virus zika sottolinea l'importanza di stabilire approcci genetici inversi per sviluppare vaccini e/o strategie terapeutiche. Qui, descriviamo il protocollo per salvare un virus infettivo ricombinante zika da un clone cDNA a lunghezza intera assemblato in un cromosoma artificiale batterico sotto il controllo del promotore riciclo-precoce umano.

Salvataggio del virus zoka ricombinante da un clone cDNA cromosoma artificiale batterico

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è la generazione di virus Zika ricombinante infettivo da un clone di cDNA a figura intera, assemblato in un cromosoma artificiale batterico sotto il controllo del promotore immediato-precoce del citomegalovirus umano. Lo sviluppo di un sistema genetico inverso per virus RNA come il virus Zika consente la manipolazione diretta del genoma del virus per studiare molteplici aspetti della biologia virale e della patogenesi e sviluppare una strategia vaccinale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la costruzione del clone infettivo del virus Zika come cromosoma artificiale batterico supera la tossicità associata al genoma del flavivirus e consente il salvataggio del virus infettivo mediante trasfezione diretta del clone cDNA BAC in cellule sensibili.Questa metodologia potrebbe essere applicata alla costruzione di cloni cDNA infettivi stabili e completamente funzionali per altri flavivirus e altri virus dell'RNA a filamento positivo. Per iniziare questa procedura, costruire il clone cDNA del virus Zika come descritto nel protocollo di testo, utilizzando siti di restrizione appropriati. Quattro frammenti di DNA che attraversano il genoma del virus Zika affiancati dal promotore umano della CMV all'estremità dei cinque primi e il ribosoma del virus del delta dell'epatite e la terminazione dell'ormone della crescita bovino e le sequenze di poliadenilazione all'estremità dei tre primi sono assemblati in un plasmide cromosomico artificiale batterico.In primo luogo, far crescere una singola colonia di E.coli DH10B portando il clone infettivo del virus pBAC-Zika in cinque millilitri di mezzo LB contenente cloramfenicolo per otto ore a 37 gradi Celsius con tremori delicati. Quindi, aggiungere 500 millilitri del mezzo LB contenente cloramfenicolo a un pallone da due litri. Aggiungere un millilitro della coltura batterica preparata al pallone e far crescere le cellule a 37 gradi Celsius per 14-16 ore fino a quando l'OD600 è approssimativamente da 0,6 a 0,8.Successivamente, utilizzare un kit commerciale appositamente sviluppato per la purificazione BAC per purificare il clone cDNA dell'infezione BAC per lisi alcalina seguendo le istruzioni del produttore. Un giorno prima della trasfezione, placcare le cellule di Vero nei pozzi di una piastra di sei pozza ad una densità di 500.000 cellule per pozzo nel mezzo di crescita. Per preparare la miscela di trasfezione, aggiungere quattro microgrammi del clone bac cDNA a 250 microlitri di siero ridotto medio e mescolare con attenzione.In un tubo separato, diluire 12 microlitri di agente di trasfezione in 250 microlitri di siero medio ridotto. Vortice da mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il BAC cDNA diluito con l'agente di trasfezione.Mescolare con cura e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante questo periodo di incubazione, utilizzare il mezzo di crescita senza antibiotici per lavare le cellule Vero e lasciare le cellule in un millilitro di mezzo fresco senza antibiotici. Quindi, distribuire i 500 microlitri della miscela cDNA e reagente di trasfezione sulle cellule Vero dropwise.Scuotere la piastra avanti e indietro per mescolare e incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per sei ore. Dopo questo, rimuovere il mezzo di trasfezione e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita fresco con antibiotici. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, assicurandosi di controllare ogni giorno l'induzione dell'effetto citopatico.Dopo quattro o sei giorni di trasfezione, quando il CPE è intorno al 50-75%, raccogliere i supernanti di coltura tissutale in tubi conici da 15 millilitri e centrifugare per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Quindi, raccogliere i supernatanti contenenti virus Zika ricombinante e scartare i pellet cellulari. Aliquota il supernatante in criotubi e conservali a meno 80 gradi Celsius.Per iniziare, far crescere le cellule vero al 90% di confluenza. Lavare le cellule due volte con PBS e infettarle con il virus salvato con la molteplicità di infezione di 0,1 nel mezzo di crescita contenente il 2%FBS. Posizionare le piastre delle cellule in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e roccia ogni 15 minuti per il periodo di adsorbimento di 90 minuti.Dopo l'adsorbimento virale, rimuovere l'inoculo virale e aggiungere un mezzo di crescita fresco con 2%FBS. Incubare tre o quattro giorni alle stesse condizioni utilizzate in precedenza. Quando il CPE è di circa il 75% raccogliere la coltura tissutale supernatante e centrifuga per rimuovere i detriti cellulari.Quindi, raccogliere il supernatante contenente il virus Zika ricombinante e scartare il pellet. Aliquota il supernatante in criotubi. Posizionare i tubi in una scatola di congelamento e conservarli a meno 80 gradi Celsius.Quando è pronto, rimuovere un'aliquota virale dal congelatore e determinare il ttarettare virale per test della placca come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, un clone cDNA stabile e a figura intera del ceppo del virus Zika Rio Grande do Norte Natal è generato dalla clonazione sequenziale di quattro frammenti di cDNA sovrapposti nel cromosoma artificiale batterico pBeloBAC11 utilizzando metodi di clonazione convenzionali e siti di restrizione unici presenti nel genoma virale. Questo clone di cDNA a figura intera è stato affiancato all'estremità a cinque stelle dal promotore umano del citomegalovirus per consentire l'espressione dell'RNA virale nel nucleo delle cellule trasfette e all'estremità tre prime dal ribosoma del virus del delta dell'epatite seguito dalla terminazione dell'ormone della crescita bovino e dalla sequenza di poliadenilazione per produrre RNA contenenti l'estremità esatti del genoma virale.Una volta assemblato il BAC cDNA, il virus infettivo può essere facilmente recuperato dopo la trasfezione diretta di cellule Vero sensibili con il clone bac cDNA usando liposomi cationici. Utilizzando questo approccio, R Zika virus RGN può essere salvato con formicolio superiore a un milione di unità di formatura della placca per millilitro. Inoltre, il virus salvato induce un chiaro effetto citopatico e genera placche omogenee di circa due millimetri di dimensione.L'identità del virus salvato è confermata tramite l'analisi dell'immunofluorescenza utilizzando uno specifico anticorpo monoclonale per la proteina E del virus Zika. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il virus Zika ricombinante infettivo può essere salvato da cloni cDNA a figura intera assemblati in un BAC. In sintesi, abbiamo sviluppato un potente approccio genetico inverso del virus Zika basato sull'uso di un cromosoma artificiale batterico che potrebbe essere adattato per generare le infezioni stabili e funzionali con clone cDNA di altri virus RNA a filamento positivo per facilitare lo studio della patologia, sviluppare un vaccino e o facilitare l'identificazione del farmaco con attività antivirale.

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