Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Carla Gómez for sin tekniske assistanse i BAC cDNA klone generasjon og Snezhana Dimitrova for å hjelpe til med video forberedelse. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne (MINECO, gi nummer BFU2016-79127-R) til fat og National Institutes of Health (NIH, gi nummer 1R21AI120500) til L.M.S. og fat

1. bygging av en ZIKV smittsomme cDNA Clone i en BAC
Merk: Strategien for montering av ZIKV i BACs er beskrevet for RGN-belastningen13 (TILTREDELSE nummer KU527068) (figur 2).
<ol><li>Velge enestående begrensning steder passende avstand inne det viral Genova det er borte inne det plasmider pBeloBAC11 (skikkelsen 2a). Merk: For ZIKV-RGN ble Begrensnings nettstedene PML I, AFE I og BstB I (henholdsvis genomisk stillinger 3 347, 5 969 og 9 127) valgt. I det tilfelle at ingen passende begrensning nettsteder er tilgjengelige i viral Genova, generere nye begrensning nettsteder ved å innføre tause nukleotid mutasjoner i viral Genova under cDNA fragment design.</li>
	<li>Generer ved kjemisk syntese fire cDNA fragmenter spenner over full lengde Genova (Z1 til Z4), flankert av CMV arrangøren på 5 '-end og HDV RZ, BGH oppsigelse, og polyadenylation sekvenser på 3 '-end ( figur 2b). Hvert fragment må være flankert av de valgte Begrensnings områdene (trinn 1,1). Merk: Fragment Z1 brukes som en ryggrad for å klone resten av fragmentene i pBeloBac11. For dette formål, må den inneholde den menneskelige CMV promoter og må være flankert på 5 '-end av ApaL jeg (å klone denne fragment i pBeloBAC11) og ASC i (fraværende i viral Genova), og på 3 '-end av begrensningen nettsteder valgt for montering av smittsomme klone (PML I , AFE jeg, og BstB I) etterfulgt av MLU jeg (fraværende i viral Genova) og BamH i (å klone denne fragment i pBeloBAC11). Fragment Z4 må inneholde genomisk regionen fra den siste begrensningen området valgt (BstB I) til slutten av viral Genova, etterfulgt av HDV RZ, BGH oppsigelse, og polyadenylation sekvenser, og MLU jeg restriksjon området (figur 2b). Alternativt kan cDNA-fragmentene (Z1-Z4) genereres av en kombinasjon av standard omvendte transkriptase polymerase kjedereaksjoner (RT-PCRene) og overlappende PCRene ved hjelp av bestemte oligonukleotider.</li>
	<li>Monter den smittsomme cDNA-klone ved sekvensiell kloning av fragmenter Z1 til Z4 i pBeloBAC11 (figur 2b).
	<ol><li>Fordøye pBeloBAC11 plasmider og Z1 fragment med ApaL jeg og BamH I. Bland 2 mikrogram pBeloBAC11-plasmider eller 1 μg av Z1-fragment med 10 μL 10x reaksjonsbuffer, 20 enheter av hvert enzym og vann for å nå et endelig volum på 100 μL. ruge ved 37 ° c for 2 t.</li>
		<li>Dephosphorylate BAC vektoren ved hjelp av reker alkalisk fosfatase (SAP). For å gjøre dette, tilsett 2,5 μL (2,5 enheter) av SAP til fordøyd BAC og ruge ved 37 ° c for 1 t. Heat-Deaktiver SAP ved å inkubasjons ved 75 ° c i 15 min.</li>
		<li>Rens dephosphorylated BAC vektor og fragment Z1 av agarose gel elektroforese ved hjelp av en kommersiell gel Clean-up Kit optimalisert for rensing av DNA-fragmenter større enn 10 kB (se tabell over materialer).</li>
		<li>Utføre ligation reaksjonen å generere plasmider (p) BAC-Z1. For dette formål, bland 150 ng av renset fordøyd BAC vektor med renset sette inn ved hjelp av en molar ratio av vektor-til-innsats av 1:3, 1,5 μL av 10x T4 DNA ligase buffer som inneholder 10 mM ATP, en enhet av T4 DNA ligase, og vann til et endelig volum på 15 μL.</li>
		<li>Ruge den ligation blandingen for 20 timer ved 16 ° c. Som kontroll av ligation reaksjonen, utføre parallelt en ligation reaksjon uten å sette inn. Heat-Deaktiver ligase ved inkubasjons ved 65 ° c i 15 min. Merk: I tilfelle av stump-endte DNAs, ruge den ligation reaksjonen i 20 timer ved 14 ° c. På grunn av den store størrelsen på BAC vektor (figur 2a), er det viktig å bruke større mengder vektor og sette inn enn ligations bruker konvensjonelle plasmider for å øke ligation effektivitet.</li>
		<li>Transformer 50 μL av E. coli DH10B electrocompetent celler med 2 μL av ligation reaksjonen (trinn 1.3.5) ved electroporation (25 μF kapasitans, 2,5 kv, og 100 Ω motstand), ved hjelp av electroporation kyvetter utstyrt med elektroder fordelt med intervaller på 0,2 cm, etter standardprotokoller.</li>
		<li>Overfør cellene til et polypropylen rør med 1 mL SOC medium (2% tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glukose [pH 7,0]) og ruge dem ved 37 ° c i 1 time med lett risting (200-250 RPM). Plate cellene på Luria buljong (LB) agar plater som inneholder 12,5 μg/mL kloramfenikol og ruge dem ved 37 ° c for 16 h.</li>
		<li>Velg 8 til 12 bakterielle kolonier, lage en kopi på en fersk LB agar plate som inneholder 12,5 μg/mL kloramfenikol, og teste om de inneholder riktig innsats ved direkte PCR-analyse ved hjelp av bestemte oligonukleotider.</li>
		<li>Plukk en positiv koloni fra kopi platen, dyrke den i 100 mL LB som inneholder 12,5 μg/mL kloramfenikol, og isolere BAC cDNA ved hjelp av alkalisk lyse Rings metoden med et kommersielt plasmider MIDI-sett, etter anbefaling for rensing av store plasmider med lav kopi (se tabell over materialer). Merk: BAC cDNA utarbeidet av denne metoden kan være forurenset med opptil 30% av bakteriell genomisk DNA, men det er egnet i kvalitet for å utføre Begrensnings analyse, sekvensering, og kloning. Avhengig av BAC størrelse, kan rentene på 4-6 μg av BAC plasmider fås.</li>
		<li>Bekrefte det genetisk integriteten av det klon cDNA av begrensning analyse. Sammendrag 500 ng av pBAC-Z1 plasmider med ASC I og PML jeg ved 37 ° c for 1 time og bekrefter tilstedeværelsen av Z1 fragment av gel elektroforese. For ytterligere å bekrefte at uønskede mutasjoner ikke har blitt innført, sekvens innsatsen med bestemte oligonukleotider.</li>
		<li>Med utgangspunkt i plasmider pBAC-Z1 som inneholder de valgte restriksjons stedene (PML I, AFE I, BstB I og MLU I), kloner i rekkefølge fragmenter Z2 til Z4 for å generere full-length smittsomme cDNA-klone pBAC-ZIKV (figur 2b), etter lignende eksperimentelle tilnærminger som beskrevet ovenfor for fragment Z1 (trinn 1.3.1-1.3.10).</li>
	</ol></li>
</ol>2. utarbeidelse av høy-renhet pBAC-ZIKV for redning av smittsomme rZIKV
Merk: Den store utarbeidelse av en ultrarent pBAC-ZIKV smittsomme klone, egnet for transfeksjoner og redning av smittsomme virus, utføres av alkalisk lyse med et kommersielt Kit spesielt utviklet for BAC rensing (se tabell over Materialer). Settet må inneholde en ATP-avhengige exonuclease fordøyelsen trinn som fjerner bakteriell genomisk DNA-forurensning, slik at isolering av BAC cDNA med en grad av renhet lik som oppnås med cesium klorid metoden.
<ol><li>Grow en enkelt koloni av E. coli DH10B bærer PBAC-ZIKV smittsomme klone i 5 ml lb medium inneholdende 12,5 μg/ml kloramfenikol ved 37 ° c i 8 t med mild risting (200-250 RPM).</li>
	<li>Tilsett 1 mL bakteriell kultur (trinn 2,1) til 500 mL LB med 12,5 μg/mL kloramfenikol i en 2 L kolbe og dyrke cellene ved 37 ° c for 14-16 h (til en OD600 på 0,6-0.8). Merk: Rik kjøttkraft, som for eksempel fantastisk buljong (TB), kan produsere ekstremt høy celle tetthet, noe som resulterer i en lavere avkastning og mindre renhet av BAC cDNA.</li>
	<li>Rense BAC smittsomme cDNA klone av alkalisk lyse ved hjelp av en kommersiell Kit spesielt utviklet for BAC rensing, etter produsentens spesifikasjoner (se tabellen av materialer). Behold renset BAC cDNA ved 4 ° c. Avhengig av BAC størrelse, kan Rentene av 30 μg av ultrarent BAC cDNA klone fås. Merk: Ikke tørk DNA pellet i mer enn 5 min, som uttørring vil gjøre det vanskelig å oppløse BAC cDNA. På grunn av den store størrelsen på BAC cDNA klone, unngå virvlingen eller pipettering for å hindre plasmider klipping.</li>
</ol>3. redning av smittsomme rZIKV fra BAC cDNA Clone av Transfeksjoner av Vero Cells
Merk: Smittsomme rZIKV utvinnes av transfeksjoner av Vero celler med pBAC-ZIKV cDNA klone, ved hjelp av en kommersiell kationiske lipid transfeksjoner reagens (se tabell over materialer; Figur 3).
<ol><li>En dag før transfeksjoner, plate på 6-brønn plater 5 x 105 Vero celler/brønn i vekstmedium (Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium [DMEM] supplert med 5% fosterets storfe serum [FBS], 2 mm L-glutamin, og 1% unødvendige aminosyrer) uten antibiotika å heve 90% confluent celle monolagere ved tidspunktet for transfeksjoner. Merk: Vi anbefaler at du utfører viruset redder i triplicates.</li>
	<li>
Likevekt serum-redusert medium (se tabell over materialer) ved romtemperatur og forberede transfeksjoner blandinger i sterile microfuge rør for hver transfeksjoner prøve som følger.
	<ol>
<li>Tilsett 4 μg av BAC cDNA klone i 250 μL av serum-redusert medium og bland forsiktig, unngå virvlingen for å hindre plasmider klipping.</li>
		<li>I et separat rør, fortynne 12 μL av transfeksjoner reagens (1 mg/mL) (se tabell over materialer) i 250 μL av serum-redusert medium, bland med virvlingen, og ruge ved romtemperatur i 5 min.</li>
		<li>Kombiner den fortynnede BAC cDNA og transfeksjoner reagens (med en 1:3 ratio av DNA: transfeksjoner reagens), bland forsiktig mens du unngår virvlingen, og ruge ved romtemperatur i 20-30 min.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>I løpet av inkubasjonsperioden BAC cDNA/transfeksjoner reagentmixture, vask Vero celler med vekstmedium uten antibiotika og la cellene i 1 mL friskt medium uten antibiotika. Merk: Tilsetning av antibiotika under transfeksjoner prosessen kan redusere transfeksjoner effektivitet.</li>
	<li>Distribuer dråpevis til 500 μL av BAC cDNA/transfeksjoner reagens blanding (av trinn 3.2.3) på Vero-cellene, bland dem ved å gynge platen frem og tilbake, og ruge cellene i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° c i 6 timer.
</li>
	<li>Fjern transfeksjoner medium, tilsett 2 mL frisk vekstmedium med antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 μg/mL Streptomycin), ruge cellene i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° c, og sjekk hver dag for induksjon av Cytopathic effekt (CPE ). Merk: ZIKV CPE er ganske uttalt i Vero celler og det er preget av tilstedeværelsen av avrundede og birefringent celler som løsner og flyter i vevet kultur supernatanten.</li>
	<li>Samle alikvoter (100 μL) av Vero celle vevs-kultur supernatanter (trinn 3,5) hver 24 h for å fastslå effektiviteten av virus utvinning ved å vurdere tilstedeværelsen av ZIKV ved hjelp av en standard plakk analysen på friske Vero celler (figur 4a).</li>
	<li>Etter fire til seks dager med transfeksjoner, når CPE er rundt 50%-75% (figur 4b), samle vevet kulturen supernatanter i 15 ml koniske rør og sentrifuger ved 2 000 x g i 10 min ved 4 ° c for å fjerne mobilnettet rusk.
</li>
	<li>Høste supernatanter som inneholder rZIKV og forkaste celle pellets. Alikvot supernatanten i cryotubes og lagre dem på-80 ° c for ytterligere å bekrefte tilstedeværelsen av reddet rZIKV.</li>
</ol>4. titrering av gjenopprettede rZIKV
<ol><li>En dag før titrering, frø på 12-brønn plater 2,5 x 105 Vero celler/brønn i vekstmedium for å øke 90% confluent celle monolagere ved tidspunktet for titrering. Merk: Vi anbefaler å gjennomføre titrering av gjenopprettede rZIKV i triplicates.</li>
	<li>Fjern en alikvot av supernatanten fra fryseren (trinn 3,8) og gjør seriell 10-fold fortynninger i vekstmedium uten FBS.</li>
	<li>Vask Vero celler 2x med fosfat-bufret saltvann (PBS) og tilsett 200 μL/brønn av hver virus fortynning i tre eksemplarer. Plasser platene i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° c og rock hver 15 min for en 90 min absorpsjons periode.</li>
	<li>Fjern viral inokulum, overlegg cellene med 2 mL vekstmedium inneholder 2% FBS, 1% DEAE-dextran, og 0,6% agar Noble, og ruge ved 37 ° c under 5% co2 for 3-4 dager. Merk: Det er mulig å bruke agarose, methylcellulose eller andre overleggs medier. Tiden for riktig plakk formasjon vil variere avhengig av overlegg brukes og ZIKV belastning.</li>
	<li>
Fix ZIKV-infiserte celler med 1 mL/brønn av 4% formaldehyd fortynnet i PBS ved romtemperatur for 1 t, fjerne overlegg, og visualisere viral plaketter ved farging dem med 0,1% krystall fiolett i 20% metanol ved romtemperatur i 15 min.
	<ol>
<li>Kast krystall fiolett, vask 3x med vann, la platene tørke, og manuelt telle plakk (figur 4c, venstre panel). Viral titer er beregnet som plakk forming enheter per milliliter (PFU/ml).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alternativt kan viral plaketter bli visualisere ved immunostaining med Pan-Flavivirus E protein mus monoklonale antistoff (mAb) 4G2 (figur 4c, høyre panel).
	<ol>
<li>For å evaluere ZIKV plaketter etter immunostaining, etter fiksering og fjerning av overlegget agar som beskrevet ovenfor (i trinn 4,5), vask cellene 2x med PBS og permeabilize dem ved inkubasjons med 200 μL/brønn på 0,5% Triton-X100 i PBS i 15 min ved romtemperatur.</li>
		<li>Fjern den permeabilization løsningen, vask cellene 3x med PBS, og blokker dem med 200 μL/brønn for blokkerings løsning (10% FBS i PBS) for 1 time ved romtemperatur. Merk: Andre standard blokkerings løsninger (f.eks. 2,5% BSA i PBS) kan brukes i dette trinnet.</li>
		<li>Fjern blokkerings løsningen og ruge cellene med 200 μL/brønn av Pan-Flavivirus E-protein mAb 4G2 fortynnet i blokkerings løsning (1 μg/mL) for 1 time ved 37 ° c. Merk: Andre mAb eller polyklonale antistoffer (pAb) kan brukes i stedet for 4G2 for immunostaining og påvisning av viral plaketter.</li>
		<li>Vask cellene 3x med PBS, og ruge dem med 200 μL av biotinylated sekundær antistoff fortynnet (etter produsentens anbefaling) i blokkerings løsning for 1 time ved 37 ° c.</li>
		<li>Fjern den sekundære antistoff, vask cellene 4X med PBS, og visualisere viral plaketter ved hjelp av en avidin/biotin-baserte peroksidase Kit følge produsentens spesifikasjoner (se tabell over materialer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. bekreftelse på vellykket rZIKV Rescue
Merk: Å fremme anerkjenne identiteten av det hjelpe virus, ZIKV E protein gjengivelsen er analysert av immunofluorescence benytter musa mAb 1176-56 spesifikk for ZIKV E protein (skikkelsen 4d). Denne mAb er spesifikk for ZIKV E protein, i motsetning til situasjonen av det gryte-Flavivirus E protein mAb 4G2 (steg 4.6.3). Alternativt kan virus identiteten bekreftes av sekvensering.
<ol><li>En dag før immunofluorescence analyse, frø coverslips i 24-brønn plater som inneholder 1 x 105 Vero celler/brønn i vekstmedium for å øke 90% confluent celle monolagere av tidspunktet for infeksjonen.</li>
	<li>Vask cellene 2x med PBS og infisere dem med et mangfold av infeksjon (MOI) av 0,5 PFU/Cell av reddet viruset i vekstmedium uten FBS (100 μL/brønn) i tre eksemplarer. Ruge platene ved 37 ° c i 90 min.</li>
	<li>Etter viral absorpsjon, fjerne viral inokulum, tilsett 0,5 mL frisk vekstmedium med 2% FBS, og ruge cellene i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° c for 48 h.</li>
	<li>Fjern vev kulturen supernatanten, fikse cellene med 150 μL/brønn av 4% paraformaldehyde i PBS i 20 min ved romtemperatur, og permeabilize cellene med 150 μL/brønn av 0,5% Triton-X100 i PBS i 15 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Etter å ha fjernet den permeabilization løsningen og vasket cellene 3x med PBS, blokker cellene med 150 μL/brønn for blokkerings løsning under 1 time ved romtemperatur. Merk: Celle skanning blokkeres med alternative blokkerings løsninger (f.eks. 2,5% BSA i PBS).</li>
	<li>Fjern blokkerings løsningen og ruge cellene med 100 μL/brønn av mAb 1176-56, spesifikk for ZIKV E-protein, fortynnet i blokkerings løsning (1 μg/mL) for 1 t ved 37 ° c.</li>
	<li>Vask cellene 3x med PBS, ruge dem ved romtemperatur for 1 time med 100 μL/brønn av Alexa fluor 488-bøyd anti-mus sekundær antistoff fortynnet (etter produsentens anbefaling) i blokkerings løsning, vask cellene mye med PBS, og ruge dem med 150 μL/brønn av 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL) fortynnet 1:200 i PBS ved romtemperatur i 10 min.</li>
	<li>Vask cellene 3x med PBS, Monter coverslips på et Antifade monterings medium (se tabell over materialer), og analyser prøvene under et fluorescens mikroskop. Merk: For langtidsoppbevaring, Oppbevar prøver ved 4 ° c, beskyttet mot lys.</li>
</ol>6. forsterkning og generering av virale aksjer
Merk: Når identiteten til reddet viruset er bekreftet (§ 5), forsterke viruset på Vero celler og generere viral aksjer for videre studier.
<ol><li>Grow Vero celler i 100 mm x 21 mm plater på 90% samløpet og infisere dem med en MOI av 0,1 PFU/Cell som beskrevet før.</li>
	<li>Når CPE er rundt 75% (ca 48-72 h postinfection), samle vevet kulturen supernatanten i en 50 mL konisk rør og sentrifuger på 2 000 x g i 10 min ved 4 ° c for å fjerne mobilnettet rusk.</li>
	<li>Høste supernatanten som inneholder rZIKV og forkaste celle pellet. Alikvot supernatanten i cryotubes og oppbevar dem ved-80 ° c.</li>
	<li>Fjern et virus alikvot fra fryseren og Bestem viral titer ved plakk analysen som beskrevet før (avsnitt 4).</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Smittsomme cDNA kloner utgjør essensielle molekylære verktøy for grunnleggende forskning av RNA-virus og utvikling av vaksiner og/eller identifisering av antivirale strategier. Men for mange positive-strandet RNA virus, inkludert flaviviruses, generering av smittsomme cDNA kloner er vanskelig på grunn av ustabilitet av klonet cDNAs når spres i bakterier ved hjelp av standard High-Copy-nummer plasmider. I tilfelle av ZIKV og andre flaviviruses, er dette ustabilitet hovedsakelig på grunn av Leaky uttrykk for giftige viral proteiner fra kryptiske bakteriell arrangører til stede i viral Genova14,15,16,17 . Her beskriver vi en alternativ og kraftig protokoll for å generere en stabil ZIKV full-lengde smittsomme cDNA klone som en enkelt plasmider, basert på bruk av BAC plasmider pBeloBAC1134 (figur 2a) for å overkomme toksisitet problemet, bruk av CMV promoter å tillate uttrykk for vRNA i kjernen av transfekterte celler, og HDV RZ å generere vRNAs med nøyaktig 3 '-ender (figur 2b). Ved hjelp av denne metoden, har vi lykkes generert en helt stabil smittsomme klone av ZIKV belastningen RGN som gjør at effektiv og pålitelig utvinning av smittsomme rZIKV etter direkte transfeksjoner av mottakelige Vero celler (Figur 3 og Figur 4).
En stor innsats har blitt gjort i de siste årene for å overvinne ustabilitet problemer forbundet med ZIKV smittsomme cDNA kloner, og flere tilnærminger har blitt implementert med hell18, inkludert in vitro ligation av cDNA fragmenter24 ,25, lav kopi plasmider19,20, den inaktive av kryptiske bakterielle arrangører ved innføringen av tause mutasjoner26,27, Intronets opprinnelse innsetting21, 22 av , 23, Gibson forsamlingen metode30, ISA metoden28,29, og bruk av CPER31. Selv om disse tilnærmingene overvinne toksisitet problemet og er nyttige for å generere ZIKV smittsomme cDNA kloner, noen av dem er arbeidskrevende og presentere flere ulemper, inkludert behovet for in vitro ligation og transkripsjon trinn som reduserer virus utvinning effektivitet eller innføring av et høyt antall tause mutasjoner å deaktivere kryptiske bakteriell promoter som kan påvirke viral fitness, blant andre. Tilnærmingen som er beskrevet i denne protokollen, gir følgende fordeler. i) BAC plasmider pBeloBAC1134 har en strengt kontrollert replikering, holde en eller to eksemplarer av plasmider per celle, som minimerer toksisitet og gir stabil vedlikehold i bakterier av ustabil cDNAs. II) forplantning og modifisering av BAC plasmider er nesten lik de konvensjonelle plasmider, vurderer liten modifikasjoner som er beskrevet i denne protokollen til å manipulere store størrelse BAC-DNA fragmenter og lav-kopi plasmider. Spesielt kan BAC cDNA klone også endres til E. coli av homologe rekombinasjon bruker den røde rekombinasjon system42,43,44. III) bruk av CMV promoter tillater intracellulære uttrykk for avkortet ZIKV vRNA og utvinning av smittsomme virus uten å kreve en in vitro transkripsjon trinn. IV) smittsomme rZIKV genereres etter direkte transfeksjoner av mottakelige celler (for eksempel Vero) med BAC cDNA klone. Siden DNA-transfeksjoner i pattedyrceller er mer effektiv enn RNA-transfeksjoner, er virus utvinnings effektiviteten med BAC-tilnærmingen høyere enn det som er observert ved bruk av RNA-transkripsjoner, noe som reduserer antall passasjer i kultur celler for å generere en viral lager og, Følgelig begrense innføringen av uønskede mutasjoner av cellekultur tilpasning.
Til slutt, potensialet i BAC tilnærmingen er støttet av vellykket bruk av denne metoden (med liten modifikasjoner) til ingeniør smittsomme cDNA kloner av andre flaviviruses, inkludert Dengue virus36, og flere coronaviruses av høy effekt i mennesker og dyr helse, for eksempel smittsomme gastroenteritt coronavirus37 (TGEV), feline smittsomme peritonitt virus38 (FIPV), menneskelige coronavirus OC4339 (HCoV-OC43), alvorlig akutt åndedretts syndrom coronavirus40 (Sars-og Midtøsten-coronavirus41 (MERS-pakter), blant andre.
I protokollen som er beskrevet her, er det to viktige trinn som bør vurderes. Ettall betydelig betraktning er identifisering passende enestående begrensning steder inne det viral Genova det er fraværende inne det BAC plasmider. Hvis ingen tilstrekkelig begrensning nettsteder er tilgjengelige, ny begrensning nettsteder kan genereres under kloning design ved innføringen av tause nukleotid mutasjoner. En annen viktig sak er at BAC plasmider er til stede i bare ett eller to eksemplarer per celle, og derfor lav avkastning på BAC plasmider med høy forurensning av bakteriell genomisk DNA er innhentet ved hjelp av standardprotokoller utformet for høy-og medium-Copy-nummer plasmider. Dette potensielle problemet er lett overvinnes ved hjelp av store kultur volumer og rensing av BAC plasmider med et kommersielt Kit spesielt utviklet for BAC rensing.
Oppsummert har vi utviklet en kraftig ZIKV omvendt genetisk tilnærming basert på bruk av en BAC som kan tilpasses til å generere stabile og fullt funksjonell smittsomme cDNA kloner av andre positive-strandet RNA virus for å lette studiet av biologi av disse virus og utvikling av vaksiner og/eller for å lette identifisering av antivirale legemidler.

ZIKV er en mygg-borne medlem av Flavivirus slekten i hvilken familien som i dag utgjør en global folkehelsen beredskap1. I likhet med andre flaviviruses er ZIKV et innhyllet RNA-virus med en icosahedral struktur som inneholder en positiv følelse, enkelt-strandet RNA-molekyl på ca 10,8 KB (figur 1)2. Den virale Genova koder en stor polyprotein på ca 3 423 aminosyrer som er behandlet av viral og mobilnettet proteaser i tre strukturelle proteiner (kapsid [C], premembrane/membran [prM/M] og konvolutt [E]) som er involvert i dannelsen av viral partikler og syv nonstructural (NS) proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, og NS5) som deltar i Genova replikering, virus montering, og Evasion av verten immunrespons (figur 1)3.
Historisk har ZIKV infeksjon vært forbundet med en mild febersykdom4,5. Men den eksplosive nylige pandemi av ZIKV infeksjoner i hele Sør-og mellom-Amerika, Sør-Stillehavet, og Karibia6,7,8, og dens tilknytning til forekomsten av Guillain-Barré syndrom og microcephaly9,10,11,12,13, har endret den historiske oppfatningen og forsterket relevansen av ZIKV som en viktig menneskelig patogen. I denne forstand, utvikling av molekylære verktøy, slik som smittsomme cDNA kloner, vil lette studiet av viral patogenesen og utvikling av genetisk definerte vaksiner og identifisering av antivirale legemidler for behandling av ZIKV infeksjon. Som beskrevet for andre flaviviruses, generering av ZIKV smittsomme kloner er vanskelig på grunn av tilstedeværelsen av kryptiske bakterielle arrangører i viral Genova14 som gjør at Leaky uttrykk for giftige virus proteiner under utbredelsen av cDNA kloner i bakterier ved hjelp av standard High-Copy-nummer plasmider15,16,17. For å overkomme dette toksisitet problemet har flere utradisjonell tilnærminger blitt gjennomført i de siste to årene18. Disse inkluderer bruk av lav-kopi-nummer plasmider19,20, innsetting av introns å forstyrre de giftige regionene21,22,23, in vitro ligation av cDNA fragmenter 24 priser og , 25, mutational deaktivering av kryptiske bakterielle arrangører til stede i viral Genova26,27, smittsomme subgenomic amplicons (ISA)28,29, Gibson forsamlingen metode30 , og bruk av sirkulær polymerase forlengelse reaksjon (CPER)31.
Heri beskriver vi den detaljerte protokollen for prosjektering av en full-lengde cDNA klone av ZIKV belastningen ZIKV-RGN13, ved hjelp av en BAC å overvinne toksisitet problemet, og redning av smittsomme rZIKV ved direkte TRANSFEKSJONER av BAC cDNA klone i Vero celler32, en cellelinje godkjent av Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) for utvikling av menneskelige vaksiner33. I dette systemet, full lengde cDNA kopi av viral Genova er samlet i BAC plasmider pBeloBAC1134 (figur 2a), en lav-kopi-nummer plasmider (en til to eksemplarer per celle) avledet fra Escherichia coli F-Factor35, som minimerer toksisitet av Flavivirus sekvenser i løpet av sin forplantning i bakterier. Den cDNA av ZIKV Genova er samlet i pBeloBAC11 under kontroll av den menneskelige CMV umiddelbare-tidlig promoter, for å tillate uttrykk for viral (v) RNA i kjernen av transfekterte celler av mobilnettet RNA polymerase II, og flankert på 3 '-end av hepatitt delta virus (HDV) ribozyme (RZ), etterfulgt av sekvenser av storfe veksthormon (BGH) oppsigelse og polyadenylation signaler til å produsere syntetiske RNAs peiling autentiske 5 '-og 3 '-endene av viral Genova, henholdsvis (figur 2b). Dette cDNA-lanserte systemet resulterer i intracellulære uttrykk for avkortet viral RNA, slik at utvinning av smittsomme ZIKV uten behov for en in vitro transkripsjon trinn. BAC tilnærmingen gir en kraftig metodikk som gjelder for å konstruere stabile og fullt funksjonell smittsomme cDNA kloner for andre flaviviruses, samt andre positive-strandet RNA virus36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

Foreningen av Zika virus (ZIKV) infeksjon med nevrologiske komplikasjoner i løpet av de siste verdensomspennende utbrudd og mangelen på godkjente vaksiner og/eller antivirale midler har understreket det presserende behovet for å utvikle ZIKV reversere genetiske systemer for å lette studie av ZIKV biologi og utvikling av terapeutiske og/eller forebyggende tilnærminger. Men som med andre flaviviruses, har generasjonen av ZIKV full-lengde smittsomme cDNA kloner blitt hemmet på grunn av toksisitet av viral sekvenser under sin forsterkning i bakterier. For å overkomme dette problemet, har vi utviklet en utradisjonell tilnærming basert på bruk av bakteriell kunstig kromosomer (BACs). Ved hjelp av denne tilnærmingen, full-lengde cDNA kopi av ZIKV belastningen Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) er generert fra fire syntetiske DNA fragmenter og samlet inn i single-kopi pBeloBAC11 plasmider under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus (CMV) umiddelbar-tidlig promoter. Den sammensatte BAC cDNA klone er stabil under forplantning i bakterier, og smittsomme rekombinant (r) ZIKV utvinnes i Vero celler etter transfeksjoner av BAC cDNA klone. Protokollen som beskrives her, gir en kraftig teknikk for generering av smittsomme kloner av flaviviruses, inkludert ZIKV, og andre positive-tråd RNA-virus, særlig de med store genomer som har stabilitetsproblemer under bakteriell og forplantning.

Protokollen beskrevet her gir mulighet for generering av stabile ZIKV full-length cDNA smittsomme kloner bruker en BAC å minimere toksisitet problemer knyttet til flere flaviviral sekvenser. Effektiv utvinning av smittsomme rZIKV fra BAC cDNA klone kan enkelt oppnås etter transfeksjoner av mottakelige Vero celler (figur 2). Ved hjelp av denne protokollen, har vi generert en stabil full-length cDNA klone av ZIKV belastningen RGN32 ved sekvensielt kloning fire overlappende cDNA fragmenter i BAC plasmider pBeloBAC1134 bruke konvensjonelle kloning metoder og unike restriksjons nettsteder som finnes i viral Genova (figur 2). The full-length cDNA klone var flankert på 5 '-end av den menneskelige CMV promoter å tillate uttrykk for vRNA i kjernen av transfekterte celler, og på 3 '-end av HDV RZ etterfulgt av BGH polyadenylation og oppsigelse sekvenser, å produsere RNAs inneholder det pressepenger av 3 '-end av det viral Genova (skikkelsen 2). Stabiliteten i bakterier av den genererte BAC cDNA klone, sammen med sin enkle manipulasjon ved hjelp av standard rekombinant DNA-teknologi, fremhever potensialet i BAC cDNA tilnærming for den raske og pålitelige generasjonen av stabile full-length cDNA kloner av ZIKV og andre flaviviruses eller positive-strandet RNA virus med ustabil viral genomer.
Når BAC cDNA klone ble montert (figur 2), smittsomme virus kan lett utvinnes etter direkte transfeksjoner av mottakelige Vero celler med BAC cDNA klone med kationiske liposomer(Figur 3). Dette cDNA-lansert systemet tillot intracellulære uttrykk for avkortet vRNA, slik at utvinning av smittsomme virus uten behov for en in vitro transkripsjon trinn. Ved hjelp av denne tilnærmingen var vi i stand til å redde rZIKV-RGN med titers høyere enn 106 PFU/ml ved 5 dager Posttransfection (figur 4a). I tillegg, det reddet viruset indusert en klar CPE (figur 4b), genererte homogene plaketter på ca 2 mm i størrelse (figur 4c), og identiteten ble bekreftet av sekvensering (data ikke vises) og immunofluorescence analyse ved hjelp av mAb spesifikke for ZIKV E protein, 1176-56 (figur 4d). In vitro-data indikerer at den gjenopprettede rZIKV-RGN replikeres effektivt i Vero-celler og til nivåer sammenlignet med en naturlig ZIKV-isolere32 (data ikke vist). Samlet disse resultatene viser at smittsomme rZIKV kan reddes fra full lengde cDNA kloner samlet i BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> Figur 1 : ZIKV Genova organisasjon og virionet struktur. (A) Genova organisasjon: ZIKV inneholder en positiv enkelt-strandet RNA som er oversatt som en enkelt polyprotein. Den oversatte polyprotein ble kløyvde av viral (piler) og vert (diamanter) proteaser å produsere de strukturelle proteiner kapsid (C, blå), matrise (M, brun), og innhylle (E, grønn), og syv nonstructural proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, og NS5). De 5 ' og 3 ' uoversatt regioner (UTRs) på slutten av viral Genova er indikert med svarte linjer. (B) virionet struktur: ZIKV virions ble dekorert med E og M proteiner, forankret i en lipid bilayer med en icosahedral-lignende struktur. Under viral innhylle var viral nucleocapsid sammensatt av C-proteinet knyttet til viral genomisk RNA. Dette tallet er tilpasset fra Ávila-Pérez et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> Figur 2 : Montering av ZIKV full-lengde smittsomme cDNA klone i en BAC. (A) skjematisk representasjon av pBeloBAC11 BAC: de regulatoriske gener parA, parB, ParC, og repE,F-Factor replikering opprinnelse (OriS), kloramfenikol motstandsdyktig genet (cmr), og Lac Z-genet er indisert. Den relevante begrensningen nettsteder som brukes til å montere den smittsomme ZIKV cDNA klone er understreket. (B) montering av ZIKV i full lengde smittsomme cDNA-klone i pBeloBAC11 BAC: fire overlappende DNA-fragmenter (Z1-Z4), som dekker hele ZIKV-Genova (figur 1) og flankert av angitte Begrensnings områder, ble generert av kjemiske syntese og sekvensielt klonet i pBeloBAC11 å generere smittsomme ZIKV cDNA klone pBAC-ZIKV. The full-length ZIKV smittsomme cDNA ble samlet under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus umiddelbare-tidlig promoter (CMV) og flankert på 3 '-end av HDV ribozyme (RZ) og storfe veksthormon (BGH) oppsigelse og polyadenylation sekvenser. Forkortelsene for viral gener og regulatoriske elementer er som beskrevet i figur 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> Figur 3 : Arbeidsflyt for å generere rZIKV fra BAC cDNA klone. Vero celler på 90% av samløpet ble transfekterte i monolag med ZIKV full-lengde smittsomme cDNA klone pBAC-ZIKV (figur 2) ved hjelp av kationiske liposomer. På 4-6 dager posttransfection, da CPE var tydelig, vev kultur supernatanter inneholder rZIKV ble samlet og evaluert for tilstedeværelsen av virus (Figur 4) og brukes for viral forsterkning i Vero celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> Figur 4 : Gjenvinning og in vitro karakterisering av rZIKV. (A) redning av smittsomme RZIKV fra BAC cDNA Clone: Vero celler på 90% av samløpet (6-brønn plateformat, triplicates) var mock-transfekterte eller transfekterte med 4 μg/brønn av PBAC-ZIKV (Figur 3), og på de angitte dagene posttransfection, virus titers i vev kultur supernatanter ble bestemt av plakk analysen (PFU/mL). Feilfeltene angir standardavvik fra tre ulike transfeksjoner eksperimenter. Den stiplede svarte linjen indikerer grensen for påvisning (50 PFU/mL). (B) viral CPE: Vero celler på 90% samløpet (6-brønn plateformat, triplicates) var mock-smittet (øverst) eller SMITTET (MOI av 0,5 PFU/Cell) med rZIKV, og på 48 h postinfection, tilstedeværelsen av CPE ble evaluert av lys mikroskopi. Scale barer = 100 μm. (C) viral plakk analysen og Immunostaining: Vero celler på 90% samløpet (12-brønn plateformat) ble smittet med rZIKV, og på 72 h postinfection, viral plaketter ble visualisere av krystall fiolett farging (venstre) eller ved immunostaining ( høyre) ved hjelp av Pan-Flavivirus E protein mAb 4G2. Skala bars = 5 mm. (D) Immunofluorescence: Vero celler på 90% samløpet (24-brønn plateformat, triplicates) var SMITTET (MOI av 0,5 PFU/Cell) med rZIKV og, på 48 h postinfection, analysert av Immunofluorescence ved hjelp av mAb 1176-56, spesifikk for ZIKV E protein. Cellekjerner ble farget med DAPI. En representativ flettet bilde av ZIKV-infiserte Vero celler vises. Den hvite firkanten øverst til høyre representerer et forstørret bilde av ZIKV-infiserte Vero-celler. Skala bars = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Den nylige epidemien av Zika virus fremhever viktigheten av å etablere omvendt genetiske tilnærminger til å utvikle vaksiner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen for å redde en smittsom rekombinant Zika virus fra en full-lengde cDNA klone samlet i en bakteriell kunstig kromosom under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promoter.

Redning av rekombinant Zika virus fra en bakteriell kunstig kromosom cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Det overordnede målet med denne eksperimentelle prosedyren er genereringen av smittsomt rekombinant Zika-virus fra en full-lengde cDNA klone, montert i et bakteriell kunstig kromosom under kontroll av det menneskelige cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promotor. Utviklingen av omvendt genetisk system for RNA-virus som Zika-virus gjør det mulig å studere flere aspekter av virusbiologien og patogenesen og utvikle vaksinestrategi. Den største fordelen med denne teknikken er at byggingen av Zika-virusinfeksiøs klone som et bakteriell kunstig kromosom overvinner toksisiteten forbundet med flavivirusgenomet og tillater redning av smittsomt virus ved direkte transfeksjon av BAC cDNA-klonen til mottakelige celler.Denne metodikken kan brukes til å konstruere stabile og fullt funksjonelle smittsomme cDNA-kloner for andre flavivirus samt andre positive RNA-virus. For å begynne denne prosedyren, konstruere Zika virus cDNA klone som beskrevet i tekstprotokollen, ved hjelp av passende begrensning nettsteder. Fire DNA-fragmenter som spenner over Zika-virusgenomet flankert av den menneskelige CMV-promotoren på den fem-prime enden og hepatitt delta-viruset ribosomet og bovinveksthormonterminering og polyadenyleringssekvenser i tre-prime enden er montert i en bakteriell kunstig kromosomplasmid.Først vokser en enkelt koloni av E.coli DH10B bærer pBAC-Zika virus smittsom klone i fem milliliter lb medium som inneholder kloramfenikol i åtte timer ved 37 grader Celsius med mild risting. Deretter legger du til 500 milliliter av LB-mediet som inneholder kloramfenikol til en to-liters kolbe. Tilsett en milliliter av den tilberedte bakterielle kulturen til kolben og vokse cellene ved 37 grader Celsius i 14 til 16 timer til OD600 er ca. 0,6 til 0,8.Etter dette, bruk et kommersielt sett spesielt utviklet for BAC rensing for å rense BAC infeksjon cDNA klone av alkalisk lysis ved å følge produsentens instruksjoner. En dag før transfection, plate Vero celler inn i brønnene av en seks-brønns plate med en tetthet på 500,000 celler per brønn i vekst medium. For å forberede transfeksjonsblandingen, tilsett fire mikrogram bac cDNA klone til 250 mikroliter serum redusert medium og bland forsiktig.I et separat rør, fortynne 12 mikroliter transfeksjonsmiddel i 250 mikroliter serum redusert medium. Vortex å blande og inkubere ved romtemperatur i fem minutter. Deretter kombinerer du den fortynnede BAC cDNA med transinfeksjonsmiddelet.Bland forsiktig og inkuber ved romtemperatur i 20 til 30 minutter. I løpet av denne inkubasjonsperioden, bruk vekstmedium uten antibiotika for å vaske Vero-cellene og la cellene stå i en milliliter friskt medium uten antibiotika. Deretter distribuerer du 500 mikroliter av cDNA og transfection reagensblanding på Vero-cellene dropwise.Rock platen frem og tilbake for å blande og inkubere cellene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i seks timer. Etter dette fjerner du transfection-mediet og legger til to milliliter med frisk vekstmedium med antibiotika. Inkuber cellene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, og sørg for å sjekke hver dag for induksjon av cytopatisk effekt.Etter fire til seks dager med transfeksjon, når CPE er rundt 50 til 75% samle vevkultur supernatanter i 15-milliliter koniske rør og sentrifuge i 10 minutter for å fjerne cellulære rusk. Deretter høster du supernativa som inneholder rekombinant Zika-virus og kaster cellepellets. Aliquot supernatant i kryorør og lagre dem på minus 80 grader Celsius.For å begynne, vokse Vero celler til 90% samløpet. Vask cellene to ganger med PBS og infisere dem med det reddet viruset med mangfoldet av infeksjon på 0,1 i vekstmedium som inneholder 2% FBS. Plasser platene av celler i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og stein hvert 15.Etter viral adsorpsjon, fjerne viral inoculum og legge til frisk vekst medium med 2% FBS. Inkuber tre eller fire dager på de samme forholdene som ble brukt tidligere. Når CPE er ca 75% samle vev kultur supernatant og sentrifuge for å fjerne cellulære rusk.Deretter høster du det overnaturlige som inneholder rekombinant Zika-virus og kaster pelleten. Aliquot den overnaturlige i cryotubes. Plasser rørene i en fryseboks og lagre dem på minus 80 grader Celsius.Når du er klar, fjern et virus aliquot fra fryseren og bestemme viral titer av plakk analyse som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien genereres en stabil, full-lengde cDNA klone av Zika-virusstammen Rio Grande do Norte Natal ved sekvensielt kloning av fire overlappende cDNA-fragmenter i bakterie kunstig kromosom pBeloBAC11 ved hjelp av konvensjonelle kloningsmetoder og unike restriksjonssteder tilstede i det virale genomet. Denne full-lengde cDNA klone ble flankert på fem-prime slutten av den menneskelige cytomegalovirus arrangør for å tillate uttrykk for viral RNA i kjernen av trans infiserte celler og på tre-prime slutten av hepatitt delta virus ribosome etterfulgt av storfe veksthormon opphør og polyadenylering sekvens for å produsere RNAs som inneholder den nøyaktige tre-prime slutten av viral genom.Når BAC cDNA er montert, kan smittsomt virus lett gjenopprettes etter direkte transfection av mottakelige Vero-celler med BAC cDNA-klone ved hjelp av kationiske liposomer. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan R Zika-virus RGN reddes med titers høyere enn en million plakkdannende enheter per milliliter. I tillegg induserer det reddet viruset en klar cytopatisk effekt og genererer homogene plakk på omtrent to millimeter i størrelse.Den reddet virusidentiteten bekreftes via immunofluorescence-analyse ved hjelp av et bestemt monoklonalt antistoff for Zika-viruset E-proteinet. Samlet sett viser disse resultatene at smittsomt rekombinant Zika-virus kan reddes fra full lengde cDNA kloner montert i en BAC. Oppsummert har vi utviklet et kraftig Zika-virus omvendt genetisk tilnærming basert på bruk av et bakteriell kunstig kromosom som kan tilpasses for å generere stabile og funksjonelle infeksjoner med cDNA klone av andre positive RNA-virus for å lette studiet av patologien, for å utvikle en vaksine, og eller for å lette identifiseringen av stoffet med antiviral aktivitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Bakteriell kunstige kromosomer: En funksjonell genom Tool for studier av Positive-strand RNA virus

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktisk Effekt av Interferon

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redning og karakterisering av rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus smittsom klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Oppdagelse og fjerning av Nuclease forurensning under rensing av rekombinant Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus spesifikke diagnostiske Epitope oppdagelsen

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flowcytometri basert analyse for å fastslå In Vitro antistoff avhengige forbedring av Dengue Virus benytter Zika Virus rekonvalesent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluering av Zika Virus-spesifikke T-celle svar i Immunoprivileged organer av infiserte Ifnar1- / - mus

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifisering av antistoff avhengige forsterkning av Zika viruset i primære menneskelige celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...