Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Карлу Гомес за техническую помощь в генерации клонов BAC cDNA и Снежану Димитрова за помощь в подготовке видео. Эта работа была частично поддержана грантами от Министерства экономики и конкурентоспособности Испании (MINECO, грантовый номер BFU2016-79127-R) Ф.А.Т. и Национальных институтов здравоохранения (NIH, грант No 1R21AI120500) L.M.S. и F.A.T.

Авторам нечего раскрывать.

Инфекционные клоны кДНК представляют собой важнейшие молекулярные инструменты для фундаментальных исследований РНК-вирусов и разработки вакцин и/или выявления противовирусных стратегий. Однако, для многих положительных-stranded РНК вирусов, в том числе флавивирусов, генерации инфекционных клонов кДНК трудно из-за нестабильности клонированных CDNAs при распространении в бактериях с использованием стандартных высокой копии числа плазмидов. В случае ЗИКВ и других флавивирусов, эта нестабильность в основном из-за вытекающей экспрессии токсичных вирусных белков от загадочных бактериальных промоутеров, присутствующих в вирусном геноме14,15,16,17 . Здесь мы описываем альтернативный и мощный протокол для создания стабильного полнометражного инфекционного клона кДНК ЗИК в виде единой плазмиды, основанной на использовании плазмидной плазмы BACp1134 (Рисунок 2A) для преодоления проблемы токсичности, использования CMV промоутер, чтобы выражение vRNA в ядре транс-инфицированных клеток, и HDV РЗ для генерации vRNAs с точными 3'-концы (Рисунок 2B). Используя этот метод, мы успешно создали полностью стабильный инфекционный клон штамма RGN, который позволяет эффективнои и надежное восстановление инфекционных r'ЗиКВ после прямого трансфекции восприимчивых клеток Веро (Рисунок 3 и Рисунок 4).
За последние несколько лет были предприняты огромные усилия для преодоления нестабильности, связанных с инфекционными клонами кДНК, и несколько подходов были успешно реализованы18,включая перевязку фрагментов кДН24 ,25, низкокопальные плазмиды19,20, инактивация загадочных бактериальных промоутеров путем введения молчаливых мутаций26,27, интрон вставка21, 22 Г. , 23, метод сборки Гибсон30, метод ISA28,29, и использование CPER31. Хотя эти подходы преодолевают проблему токсичности и полезны для генерации инфекционных клонов кДНК, некоторые из них являются трудоемкими и представляют ряд недостатков, включая необходимость перевязки и транскрипции, которые уменьшают вирус эффективность восстановления или введение большого количества молчаливых мутаций для инактивации загадочных бактериальных промоутер, которые могут повлиять на вирусный фитнес, среди других. Подход, описанный в этом протоколе, дает следующие преимущества. i) BAC плазмид pBeBAC1134 имеет строго контролируемую репликацию, сохраняя одну или две копии плазмида на клетку, что сводит к минимуму токсичность и позволяет стабильное обслуживание бактерий нестабильных cDNAs. ii) Распространение и модификация плазмидов BAC почти аналогичны обычным плазмидам, учитывая незначительные изменения, описанные в этом протоколе для манипулирования крупногабаритными фрагментами BAC-ДНК и низкокопированными плазмидов. Примечательно, что клон BAC cDNA также может быть изменен в e. coli с помощью красной рекомбинации системы42,43,44. iii) Использование CMV промоутер позволяет внутриклеточного выражения ограничена IKV vRNA и восстановления инфекционных вирусов, не требуя в пробирке транскрипции шаг. iv) Инфекционная рЗИКВ генерируется после прямого трансфекции восприимчивых клеток (например, Vero) с клоном BAC cDNA. Поскольку трансфекция ДНК в клетках млекопитающих более эффективна, чем трансфекция РНК, эффективность восстановления вируса с помощью подхода BAC выше, чем при использовании РНК-транскриптов, уменьшая количество проходов в клетках культуры для генерации вирусного запаса и, следовательно, ограничение введения нежелательных мутаций путем адаптации клеточной культуры.
Наконец, потенциал подхода BAC поддерживается успешным использованием этого метода (с небольшими изменениями) для разработки инфекционных клонов кДНК других флавивирусов, включая вирус денге36,и несколько коронавирусов с высоким воздействием в здоровье человека и животных, такие как трансмиссивный гастроэнтерит коронавирус37 (TGEV), кошачий инфекционный вирус перитонита38 (FIPV), коронавирус человека OC4339 (HCoV-OC43), тяжелый острый респираторный синдром коронавирус40 (SARS-CoV) и коронавирус ближневосточного респираторного синдрома41 (БВРС-КоВ), среди прочих.
В описанном здесь протоколе есть два важных шага, которые следует рассмотреть. Одним из важных соображений является выявление соответствующих уникальных мест ограничения в вирусном геноме, которые отсутствуют в плазмид BAC. Если отсутствуют адекватные места ограничения, новые места ограничения могут быть сгенерированы во время разработки клонирования путем введения бесшумных нуклеотидных мутаций. Другой важный вопрос заключается в том, что плазмиды BAC присутствуют только в одной или двух копиях на клетку, и, следовательно, низкие урожаи плазмидов BAC с высоким загрязнением бактериальной геномной ДНК получаются с помощью стандартных протоколов, предназначенных для высоко- и плазмиды среднего количества. Эта потенциальная проблема легко преодолена с помощью больших объемов культуры и очистки плазмида BAC с коммерческим комплектом, специально разработанным для очистки BAC.
Таким образом, мы разработали мощный обратный генетический подход ЗИКВ, основанный на использовании BAC, который может быть адаптирован для создания стабильных и полностью функциональных инфекционных клонов кДНК других положительно-stranded РНК-вирусов для облегчения изучения биологии этих вирусов и разработки вакцин и/или для содействия выявлению противовирусных препаратов.

ЗИКВ является комарами, передаваемыми в род флавивирусов в семье Flaviviridae, которая в настоящее время представляет собой глобальную чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения1. Как и другие флавивирусы, ЗИКВ является окутанным вирусом РНК с icosahedral-подобной структуры, которая содержит положительный смысл, одноцепочечная молекула РНК около 10,8 кб (Рисунок 1)2. Вирусный геном кодирует большой полипротеин примерно 3423 аминокислот, которые обрабатываются вирусными и клеточными протеазами в три структурных белка (капсида ,C, premembrane/membrane »prM/M», и конверт (E) которые участвуют в формировании вирусных частиц и семи неструктурных (NS) белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), которые участвуют в репликации генома, сборке вируса и уклонении от иммунного ответа хозяина(рисунок 1)3.
Исторически, инфекция ЗИКВ была связана с легкой лихорадочней4,5. Тем не менее, взрывоопасная недавняя пандемия инфекций ЗИКВ по всей южной и центральной Америке, южной части Тихого океана и Карибского бассейна6,7,8, и его связь с возникновением синдрома Гийена-Барре и микроцефалия9,10,11,12,13, изменили историческое восприятие и потенцировал актуальность ЗИКВ как важный человеческий патоген. В этом смысле разработка молекулярных инструментов, таких как инфекционные клоны кДНК, облегчит изучение вирусного патогенеза и разработку генетически определенных вакцин и выявление противовирусных препаратов для лечения инфекции ЗИКВ. Как описано для других флавивирусов, генерации инфекционных клонов ЗИКВ трудно из-за присутствия загадочных бактериальных промоутеров в вирусном геноме14, которые позволяют вытекающее выражение токсичных вирусных белков во время распространения клоны кДНК в бактериях с использованием стандартных плазмидов высокого количества копий15,16,17. Для решения этой проблемы токсичности, несколько нетрадиционных подходов были успешно реализованы в течение последних двух лет18. Они включают в себя использование низкой копии числа плазмиды19,20, вставка интронов нарушить токсичных областей21,22,23, в пробирке перевязки фрагментов кДНК 24 , 25, мутационное глушиние загадочных бактериальных промоутеров, присутствующих в вирусном геноме26,27, инфекционные субгеномные ампликоны (ISA)28,29, метод сборки Гибсона30 , и использование круговой реакции расширения полимеразы (CPER)31.
В этом виде мы описываем подробный протокол для разработки полнометражного клона кДНК штамма ЗИКВ ЗИКВ-RGN13, используя BAC для преодоления проблемы токсичности, и спасение инфекционных r'iKV путем прямого трансфекции клона BAC cDNA в Веро клетки32, клеточная линия, одобренная Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для разработки вакцин для человека33. В этой системе, полнометражный cDNA копия вирусного генома собирается в BAC плазмид pBeBAC1111 34 (Рисунок 2A), с низким числом копий плазмида (от одного до двух копий на клетку), полученных от Escherichia coli F-фактор35, которая сводит к минимуму токсичность флавивирусных последовательностей во время его распространения в бактериях. КДНК генома ЗИКВ собирается в pBeloBAC11 под контролем человека CMV немедленного раннего промоутера, чтобы позволить выражение вирусной (v) РНК в ядре транс-инфицированных клеток клеточной РНК-полимеразы II, и в боком в 3'-конец гепатитом дельта-вирус (HDV) рибоцим (РЗ), а затем последовательности гормона роста крупного рогатого скота (BGH) прекращения и полиаденилационных сигналов для производства синтетических РНК подшипник подлинных 5'- и 3'-концы вирусного генома, соответственно (Рисунок 2B). Эта система, запущенная кДНК, приводит к внутриклеточному выражению закрытой вирусной РНК, что позволяет восстановить инфекционные ЗИКВ без необходимости в шаге транскрипции in vitro. Подход BAC обеспечивает мощную методологию, применимую к построению стабильных и полностью функциональных инфекционных клонов кДНК для других флавивирусов, а также других положительно-stranded РНК-вирусов36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

Связь инфекции вируса Зика (ЗИКВ) с неврологическими осложнениями во время недавней всемирной вспышки и отсутствие одобренных вакцин и/или противовирусных препаратов подчеркнула настоятельную необходимость разработки обратных генетических систем ЗИКВ для облегчения изучение биологии ЗИКВ и развитие терапевтических и/или профилактических подходов. Однако, как и в других флавивирусов, генерации полнометражных инфекционных клонов кДНК ЗИК было затруднено из-за токсичности вирусных последовательностей во время его усиления в бактериях. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали нетрадиционный подход, основанный на использовании бактериальных искусственных хромосом (БАК). Используя этот подход, полноформатная копия cDNA штамма ЗиКВ Rio Grande do Norte Natal (ЗИКВ-РГН) генерируется из четырех фрагментов синтетической ДНК и собрана в однокопительную плазмиду pBeloBAC11, накоторойреню под контролем цитомегаловируса человека (CMV) немедленного раннего промоутера. Собранный клон BAC cDNA стабилен во время распространения бактерий, а инфекционный рекомбинантный (r) ЗИКВ восстанавливается в клетках Веро после трансфекции клона BAC cDNA. Описанный здесь протокол обеспечивает мощный метод для генерации инфекционных клонов флавивирусов, в том числе ЗИКВ, и других вирусов РНК с положительной нити, особенно с большими геномами, которые имеют проблемы со стабильностью во время бактериальных распространение.

Описанный здесь протокол позволяет создать стабильные полноразмерные кДНК-инфекционные клоны С помощью BAC, чтобы свести к минимуму проблемы токсичности, связанные с несколькими флавивирными последовательностями. Эффективное восстановление инфекционного r'IKV от клона BAC cDNA может быть легко достигнуто после трансфекции восприимчивых клеток Веро(рисунок 2). Используя этот протокол, мы создали стабильный полноформатный клон кДНК штамма RGN32, последовательно клонируя четыре перекрывающихся фрагмента кДН в bac plasmid pBeloBAC1134 с использованием обычных методов клонирования и уникальных места ограничения, присутствующие в вирусном геноме(рисунок 2). Полнометражный клон cDNA был фланговым на 5'end человеческим промоутером CMV, чтобы позволить выражение vRNA в ядре трансинфицированных клеток, и в 3'-конце HDV РЗ, а затем BGH полиаденилации и прекращения последовательностей, для производства РНК, содержащих точный 3'-конец вирусного генома(рисунок 2). Стабильность бактерий генерируемого клона BAC cDNA, а также его легкая манипуляция с использованием стандартных рекомбинантных технологий ДНК, подчеркивает потенциал подхода BAC cDNA для быстрого и надежного поколения стабильных полноформатных клонов кДНК ЗИКВ и другие флавивирусы или положительно-мельные РНК-вирусы с нестабильными вирусными геномами.
После того, как клон BAC cDNA был собран(Рисунок 2), инфекционный вирус может быть легко восстановлен после прямого трансфекции восприимчивых клеток Веро с клоном BAC cDNA с использованием катионных липосом(Рисунок 3). Эта кДНК-запущенная система позволила внутриклеточное выражение ограниченv vRNA, что позволяет восстановление инфекционных вирусов без необходимости в пробирке транскрипции шаг. Используя этот подход, мы смогли спасти рЗИКВ-RGN с титрами выше, чем 106 PFU/mL на 5 дней послетрансфекции (Рисунок 4A). Кроме того, спасенный вирус индуцировал четкий CPE(Рисунок 4B),генерируемые однородные бляшки размером около 2 мм (рисунок4C),и его идентичность была подтверждена секвенированием (данные не показаны) и иммунофлюоресценции анализа с использованием mAb конкретных для белка ЗИКВ E, 1176-56(рисунок 4D). Данные In vitro показывают, что восстановленный рЗИКВ-РГН эффективно реплицируется в клетках Веро и до уровней, сравнимых с естественным изолятом ЗИКВ32 (данные не показаны). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что инфекционные r'IKV могут быть спасены из полнометражных клонов кДНК, собранных в BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> Рисунок 1 : Организация генома ЗИКВ и структура вириона. (A) Организация генома: ЗИКВ содержит положительную одноцепочечную РНК, которая переводится как единый полипротеин. Переведенный полипротеин был расщепляется вирусными (стрелками) и протеазами-хозяевами (алмазами) для производства структурных белков капсида (C, синий), матрицы (M, коричневый) и окуна (E, green) и семи неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5). 5' и 3' непереведенных регионов (UTRs) в конце вирусного генома указаны с черными линиями. (B) Вирион структуры: ЗиКВ virions были украшены E и M белков, закрепленных в липидный двуслойный с icosahedral-как структура. Под вирусной окуной находился вирусный нуклеокапсид, состоящий из белка С, связанного с вирусной геномной РНК. Эта цифра была адаптирована из Авила-Перес и др.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> Рисунок 2 : Сборка полноразмерного инфекционного клона кДНК В БАК. (A) Схематическое представление pBeloBAC11 BAC: Регулятивные гены parA, parB, parC, и repE,происхождение репликации F-фактора (OriS),устойчивый ген хлорамфеникол (Cmr),и лак Указано ген. Подчеркиваются соответствующие места ограничения, используемые для сборки инфекционного клона кДНК ЗИКВ. (B) Сборка полноразмерного инфекционного клона кДНК в pBeBAC11 BAC: Четыре перекрывающихся фрагментов ДНК (No1-No4), охватывающих весь геном ЗИКВ (рисунок1) и в окружении указанных мест ограничения, были созданы химическими синтез и последовательно клонированы в pBeloBAC11 для создания инфекционного клона qIN CDNA pBAC-IKV. Полнометражный инфекционная кДНК ЗИКВ была собрана под контролем человека цитомегаловируса немедленного раннего промоутера (CMV) и в окружении 3'end HDV рибозим (РЗ) и гормона роста крупного рогатого скота (BGH) прекращения и полиаденилаации последовательностей. Акронимы вирусных генов и регуляторных элементов описаны на рисунке 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> Рисунок 3 : Рабочий процесс для генерации r'iKV из клона BAC cDNA. Веро-клетки на 90% слияния были трансинфицированы в монослой с полнометражным инфекционным клоном кДНК pBAC-ЗИКВ (Рисунок 2) с использованием катионных липосом. В 4-6 дней посттрансфекции, когда CPE было очевидно, ткани культуры супернатанантов, содержащих r'ЗИКВ были собраны и оценены на наличие вируса(Рисунок 4) и используется для вирусного усиления в клетках Веро. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> Рисунок 4 : Восстановление и экстракорпора характеристика РЗИКВ. (A) Спасение инфекционных r'ЗИКВ от клона BAC cDNA: Vero клетки на 90% слияния (6-ну хорошо пластины формата, трипликаты) были макет-трансинфицированы или трансфицированы с 4 мкг / хорошо пБАК-ЗИКВ (Рисунок 3), и в указанные дни посттрансфекции, вирус титры в ткани культуры супернациантов были определены доска анализ (PFU/mL). Бары ошибок указывают на стандартные отклонения от трех различных экспериментов трансфекции. Пунктирная черная линия указывает на предел обнаружения (50 PFU/mL). (B) Вирусные CPE: Веро клетки на 90% слияния (6-ну хорошо пластины формат, трипликатиты) были макет-инфицированных (вверху) или инфицированных (MOI 0,5 ПфУ / клетки) с r'iKV, и на 48 h послеинфекции, наличие CPE была оценена световой микроскопией. Шкала баров No 100 мкм. (C) Вирусный налет анализ и иммуно-пятно: Веро клетки на 90% слияния (12-ну хорошо пластины формате) были инфицированы r'IKV, и на 72 h после инфекции, вирусные бляшки были визуализированы кристаллно-фиолетовый окрашивания (слева) или иммунопятна ( справа) с помощью панфлавивируса E белка mAb 4G2. Шкала баров 5 мм. (D) Иммунофлуоресценция: Веро клетки на 90% слияния (24-ну хорошо пластины формата, трипликаты) были инфицированы (MOI 0,5 ПФУ / клетка) с r'iKV и, на 48 h послеинфекции, проанализированы иммунофлуоресценции с помощью mAb 1176-56, специфические для ЗИКВ E белок. Ядра клеток были окрашены DAPI. Отображается репрезентативное объединенное изображение инфицированных ЗИКВ клеток Веро. Белый квадрат в правом верхнем цвете представляет собой увеличенное изображение инфицированных ЗИКВ клеток Веро. Шкала баров 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Недавняя эпидемия вируса Зика подчеркивает важность разработки обратных генетических подходов к разработке вакцин и/или терапевтических стратегий. Здесь мы описываем протокол по спасению инфекционного рекомбинантного вируса Зика от полнометражного клона кДНК, собранного в бактериальной искусственной хромосоме под контролем человека цитомегаловируса немедленного раннего промоутера.

Спасение рекомбинантного вируса Зика от бактериальной искусственной хромосомы клона

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Общей целью этой экспериментальной процедуры является генерация инфекционного рекомбинантного вируса Зика из полномедательного клона кДНА, собранного в бактериальной искусственной хромосоме под контролем цитомегаловируса человека. Разработка обратной генетической системы рнк-вирусов, таких как вирус Зика, позволяет непосредственно манипулировать геномом вируса для изучения нескольких аспектов вирусной биологии и патогенеза и разработки стратегии вакцинации. Основным преимуществом этого метода является то, что строительство инфекционного клона вируса Зика как бактериальной искусственной хромосомы преодолевает токсичность, связанную с геномом флавивируса, и позволяет спасти инфекционный вирус путем прямой трансфекции клона BAC cDNA в восприимчивые клетки.Эта методология может быть применена для построения стабильных и полностью функциональных инфекционных клонов кДНК для других флавивирусов, а также других положительно-застрявших РНК-вирусов. Чтобы начать эту процедуру, создайте клон вируса Зика cDNA, как указано в текстовом протоколе, используя соответствующие сайты ограничения. Четыре фрагмента ДНК, охватывающих геном вируса Зика в окружении человека CMV промоутер на пяти-премьер конце и вирус дельты гепатита рибосомы и бычьего гормона роста прекращения и полиаденилирования последовательности на трех-премьер конце собраны в бактериальной искусственной хромосомы плазмиды.Во-первых, вырастить одну колонию E.coli DH10B проведения pBAC-Зика вирус инфекционного клона в пять миллилитров LB среды, содержащей хлорамфеникол в течение восьми часов при 37 градусов по Цельсию с нежной тряски. Затем добавьте 500 миллилитров среды LB, содержащей хлорамфеникол, в двухлитровую колбу. Добавить один миллилитр подготовленной бактериальной культуры в колбу и расти клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 14 до 16 часов, пока OD600 составляет примерно 0,6 до 0,8.После этого используйте коммерческий комплект, специально разработанный для очистки BAC, чтобы очистить клон BAC infection cDNA щелочным лизом, следуя инструкциям производителя. За день до трансфекции, пластины Vero клеток в скважины из шести скважин пластины при плотности 500000 клеток на скважину в среде роста. Чтобы подготовить смесь трансфекции, добавьте четыре микрограмма клона BAC cDNA до 250 микролитров сыворотки, уменьшенной средой, и тщательно перемешайте.В отдельной трубке разбавляют 12 микролитров трансфектного агента в 250 микролитров сыворотки уменьшенной среды. Вихрь смешивать и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем объединить разбавленный BAC cDNA с трансфектным агентом.Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20-30 минут. В течение этого инкубационный период, использовать средний рост без антибиотиков, чтобы мыть клетки Веро и оставить клетки в один миллилитр свежей среды без антибиотиков. Затем распределите 500 микролитров смеси кДНА и трансфекции реагентов на клетки Веро.Рок пластины туда и обратно, чтобы смешать и инкубировать клетки во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение шести часов. После этого удалите трансфекцию среды и добавьте два миллилитров свежей среды роста с антибиотиками. Инкубировать клетки во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом, убедившись, чтобы проверить каждый день для индукции цитопатический эффект.После четырех-шести дней трансфекции, когда CPE составляет около 50 до 75% собирать супернатанты культуры тканей в 15-миллилитровых конических труб и центрифуг в течение 10 минут, чтобы удалить клеточный мусор. Затем собрать супернатанты, содержащие рекомбинантный вирус Зика и отказаться от клеточных гранул. Aliquot супернатант в криотрубах и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Для начала вырастите клетки Веро до 90% слияния. Вымойте клетки два раза с PBS и заразить их спасенным вирусом с множественностью инфекции 0,1 в среде роста, содержащей 2%FBS. Поместите пластины клеток во влажный инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом и рок каждые 15 минут в течение 90-минутного периода adorption.После вирусной адсорбции, удалить вирусный инокулум и добавить свежий рост среды с 2%FBS. Инкубировать три или четыре дня на тех же условиях, используемых ранее. Когда CPE составляет около 75%собирать ткани культуры supernatant и центрифуги для удаления клеточного мусора.Затем собрать супернатант, содержащий рекомбинантный вирус Зика, и выбросить гранулы. Aliquot супернатант в криотрубы. Поместите трубки в коробку для замораживания и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Когда вы будете готовы, удалите вирус aliquot из морозильной камеры и определить вирусный titer по налету анализ, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании, стабильный, полнометражный клон кДНК штамма вируса Зика Rio Grande do Norte Natal генерируется путем последовательного клонирования четырех перекрывающихся фрагментов кДНК в бактериальную искусственную хромосому pBeloBAC11 с использованием обычных методов клонирования и уникальных сайтов ограничения, присутствующих в вирусном геноме. Этот полнометражный клон cDNA был в окружении на пять премьер конце человека цитомегаловирус промоутер, чтобы выражение вирусной РНК в ядре трансфицированных клеток и на три премьер-конец рибосомы вируса дельты гепатита следуют прекращения гормона роста крупного рогатого скота и полиаденилирования последовательности для производства РНК, содержащих точные три премьер конца вирусного генома.После того, как cDNA BAC собран, инфекционный вирус может быть легко восстановлен после прямой трансфекции восприимчивых клеток Веро с клоном BAC cDNA с помощью катионных липосом. Используя этот подход, R вирус Зика RGN можно спасти с титлерами выше, чем один миллион бляшек формирования единиц на миллилитр. Кроме того, спасенный вирус вызывает явный цитопатический эффект и генерирует однородные бляшки размером около двух миллиметров.Спасенная идентичность вируса подтверждается с помощью иммунофлуоресценции анализа с использованием специфических моноклональных антител для белка вируса Зика Е. В целом, эти результаты показывают, что инфекционный рекомбинантный вирус Зика может быть спасен от полнометражных клонов кДНА, собранных в BAC. Таким образом, мы разработали мощный вирус Зика обратного генетического подхода, основанного на использовании бактериальной искусственной хромосомы, которые могут быть адаптированы для создания стабильных и функциональных инфекций с клоном кДНК других положительно-стрестовых РНК вирусов для облегчения изучения патологии, разработки вакцины, а также для облегчения идентификации препарата с противовирусной активностью.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em&gt; In Vitro</em&gt; Профилактический эффект интерферонов

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Простой проточной цитометрии на основе анализа для определения в Vitro антитела зависит повышение вируса денге, с помощью вируса Зика выздоравливающих сыворотки

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Оценка ответов Зика вирус специфических Т-клеток в Immunoprivileged органах зараженных Ifnar1- / - мышей

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Количественное определение антител зависимых повышение Зика вируса в первичных клеток человека

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...