Name: rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone at JoVE.com

Los autores quieren agradecer a Carla Gómez por su asistencia técnica en la generación de clones de BAC cDNA y a Snezhana Dimitrova por ayudar con la preparación del video. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO, número de subvención BFU2016-79127-R) a F.A.T. y los Institutos Nacionales de Salud (NIH, número de concesión 1R21AI120500) a L.M.S. y F.A.T.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los clones infecciosos de ADNc constituyen herramientas moleculares esenciales para la investigación básica de los virus del ARN y el desarrollo de vacunas y/o la identificación de estrategias antivirales. Sin embargo, para muchos virus de ARN de cadena positiva, incluidos los flavivirus, la generación de clones infecciosos de ADNc es difícil debido a la inestabilidad de los CDNA clonados cuando se propagan en bacterias utilizando plásmidos estándar de alto número de copia. En el caso de ZIKV y otros flavivirus, esta inestabilidad se debe principalmente a la expresión filtrante de proteínas virales tóxicas de promotores bacterianos crípticos presentes en el genoma viral14,15,16,17 . Aquí, describimos un protocolo alternativo y potente para generar un clon estable de ADNC infeccioso de longitud completa ZIKV como un solo plásmido, basado en el uso del plásmido BAC pBeloBAC1134 (Figura2A) para superar el problema de toxicidad, el uso de la Promotor de CMV para permitir la expresión del arNM en el núcleo de las células transllenadas, y el HDV RZ para generar vRNAs con 3'-end precisos (Figura2B). Usando este método, hemos generado con éxito un clon infeccioso totalmente estable de la cepa ZIKV RGN que permite la recuperación eficiente y confiable de rZIKV infeccioso después de la transfección directa de células Vero susceptibles (Figura3 y Figura 4).
En los últimos años se ha hecho un gran esfuerzo para superar los problemas de inestabilidad asociados con los clones infecciosos de ADNc de ZIKV, y se han implementado con éxito varios enfoques18,incluida la ligadura in vitro de fragmentos de ADNc24 ,25, plásmidos de copia baja19,20, la inactivación de promotores bacterianos crípticos mediante la introducción de mutaciones silenciosas26,27, inserción intrón21, 22 , 23, el método de montaje Gibson30, el método ISA28,29, y el uso de CPER31. Aunque estos enfoques superan el problema de toxicidad y son útiles para generar clones infecciosos de ADNc ZIKV, algunos de ellos son laboriosos y presentan varias desventajas, incluyendo la necesidad de pasos de ligadura y transcripción in vitro que reducen el virus eficiencia de recuperación o la introducción de un alto número de mutaciones silenciosas para inactivar el promotor bacteriano críptico que podría afectar la aptitud viral, entre otros. El enfoque descrito en este protocolo presenta las siguientes ventajas. i) El plásmido BAC pBeloBAC1134 tiene una replicación estrictamente controlada, manteniendo una o dos copias de plásmido por célula, lo que minimiza la toxicidad y permite un mantenimiento estable en bacterias de cDNAs inestables. ii) La propagación y modificación de plásmidos BAC son casi similares a las de los plásmidos convencionales, teniendo en cuenta las ligeras modificaciones descritas en este protocolo para manipular fragmentos de ADN BAC de gran tamaño y plásmidos de copia baja. En particular, el clon BAC cDNA también puede ser modificado en E. coli por recombinación homóloga utilizando el sistema de recombinación roja42,43,44. iii) El uso del promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el expresión intracelular de ARNm ZIKV tapado y la recuperación de virus infecciosos sin necesidad de una etapa de transcripción in vitro. iv) El rZIKV infeccioso se genera después de la transfección directa de células susceptibles (por ejemplo, Vero) con el clon BAC cDNA. Dado que la transfección del ADN en células de mamíferos es más eficiente que la transfección de ARN, la eficiencia de recuperación del virus con el enfoque BAC es mayor que la observada utilizando transcripciones de ARN, reduciendo el número de pasajes en las células de cultivo para generar un stock viral y, consecuentemente, limitando la introducción de mutaciones no deseadas por adaptación al cultivo celular.
Por último, el potencial del enfoque bac está respaldado por el uso exitoso de este método (con ligeras modificaciones) para diseñar clones infecciosos de ADNc de otros flavivirus, incluyendo el virus del dengue36,y varios coronavirus de alto impacto en salud humana y animal, como el coronavirus de la gastroenteritis transmisible37 (TGEV), el virus de peritonitis infecciosa felina38 (FIPV), el coronavirus humano OC4339 (HCoV-OC43), el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus40 (SARS-CoV), y el síndrome respiratorio de Oriente Medio coronavirus41 (MERS-CoV), entre otros.
En el protocolo descrito aquí, hay dos pasos críticos que deben ser considerados. Una consideración importante es la identificación de sitios de restricción únicos apropiados en el genoma viral que están ausentes en el plásmido BAC. Si no hay sitios de restricción adecuados disponibles, se pueden generar nuevos sitios de restricción durante el diseño de clonación mediante la introducción de mutaciones de nucleótidos silenciosos. Otra cuestión importante es que los plásmidos BAC están presentes en sólo una o dos copias por célula, y por lo tanto, los bajos rendimientos de plásmidos BAC con una alta contaminación del ADN genómico bacteriano se obtienen utilizando protocolos estándar diseñados para plásmidos de número medio. Este problema potencial se supera fácilmente utilizando grandes volúmenes de cultivo y purificando el plásmido BAC con un kit comercial desarrollado específicamente para la purificación de BAC.
En resumen, hemos desarrollado un potente enfoque genético inverso ZIKV basado en el uso de un BAC que podría adaptarse para generar clones de ADNc infecciosos infecciosos estables y totalmente funcionales de otros virus de ARN de cadena positiva para facilitar el estudio de la biología de estos virus y el desarrollo de vacunas y/o para facilitar la identificación de medicamentos antivirales.

ZIKV es un mosquito portador del género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae que actualmente constituye una emergencia de salud pública global1. Al igual que otros flavivirus, ZIKV es un virus de ARN envuelto con una estructura similar al icosahedral que contiene un sentido positivo, molécula de ARN de una sola cadena de aproximadamente 10,8 kb (Figura1)2. El genoma viral codifica una gran poliproteína de aproximadamente 3.423 aminoácidos que es procesada por proteasas virales y celulares en tres proteínas estructurales (capsid [C], premembrana/membrana [prM/M], y envolver [E]) que participan en la formación de la partículas virales y siete proteínas no estructurales (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5) que participan en la replicación del genoma, el ensamblaje de virus y la evasión de la respuesta inmune del huésped (Figura1)3.
Históricamente, infección por ZIKV se ha asociado con una enfermedad febril leve4,5. Sin embargo, la pandemia reciente explosiva de infecciones por ZIKV en toda América del Sur y Central, el Pacífico Sur y el Caribe6,7,8, y su asociación con la aparición del síndrome de Guillain-Barré y la microcefalia9,10,11,12,13,han cambiado la percepción histórica y potenciado la relevancia del ZIKV como un importante patógeno humano. En este sentido, el desarrollo de herramientas moleculares, como los clones infecciosos de ADNc, facilitará el estudio de la patogénesis viral y el desarrollo de vacunas definidas genéticamente y la identificación de medicamentos antivirales para el tratamiento de la infección por ZIKV. Como se describe para otros flavivirus, la generación de clones infecciosos ZIKV es difícil debido a la presencia de promotores bacterianos crípticos en el genoma viral14 que permiten la expresión de fugas de proteínas virales tóxicas durante la propagación de la clones de ADNc en bacterias utilizando plásmidos estándar de alto número de copia15,16,17. Para superar este problema de toxicidad, varios enfoques no tradicionales se han implementado con éxito en los últimos dos años18. Estos incluyen el uso de plásmidos de bajo número de copia19,20, la inserción de intrones para interrumpir las regiones tóxicas21,22,23, la ligadura in vitro de fragmentos de ADNc 24 , 25, silenciamiento mutacional de promotores bacterianos crípticos presentes en el genoma viral26,27, amplificadores subgenómicos infecciosos (ISA)28,29, el método de montaje Gibson30 , y el uso de la reacción de extensión de la polimerasa circular (CPER)31.
Aquí, describimos el protocolo detallado para la ingeniería de un clon de ADNc de longitud completa de la cepa ZIKV ZIKV-RGN13, utilizando un BAC para superar el problema de toxicidad, y el rescate de rZIKV infeccioso por transfección directa del clon BAC cDNA en Vero células32, una línea celular aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para el desarrollo de vacunas humanas33. En este sistema, la copia de ADNader de longitud completa del genoma viral se ensambla en el plásmido BAC pBeloBAC1134 (Figura2A),un plásmido de bajo número de copia (de una a dos copias por célula) derivado del factor F35de Escherichia coli, que minimiza la toxicidad de las secuencias de flavivirus durante su propagación en bacterias. El ADNc del genoma ZIKV se ensambla en pBeloBAC11 bajo el control del promotor humano CMV inmediatamente temprano, para permitir la expresión del ARN viral (v)en el núcleo de las células transfectógenas por ARN polimerasa celular II, y flanqueado a las 3'-end por la hepatitis ribozyme del virus delta (HDV) (RZ), seguido de las secuencias de las señales de terminación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y poliadenilación para producir ARN sintéticos que llevan auténticos 5'- y 3'-extremos del genoma viral, respectivamente (Figura2B). Este sistema lanzado por cDNA da como resultado la expresión intracelular del ARN viral tapado, permitiendo la recuperación de ZIKV infeccioso sin necesidad de una etapa de transcripción in vitro. El enfoque BAC proporciona una metodología poderosa aplicable a la construcción de clones de ADNc infecciosos infecciosos estables y totalmente funcionales para otros flavivirus, así como otros virus de ARN de cadena positiva36,37, 38,39,40,41.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1048">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">1. Molecular Biology Reagents</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Afe I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0652S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">AmpliTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>N8080161</td>
			<td>5,000 Units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ApaL I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0507S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Asc I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0558S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BamH I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0136S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">BstB I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0519S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ElectroMAX DH10B Cells&#160;</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">18290015</td>
			<td>Electocompetent DH10B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">165-2086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Ethanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">109634</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Large-Construct Kit (10)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12462</td>
			<td>For high-purity BAC preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB Broth</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">12780029</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">LB with Agar</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">22700041</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Methanol</td>
			<td style="width:309px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">106009</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Mlu I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0198S</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:309px;">IDT</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Plasmid pBeloBAC11</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12143</td>
			<td>For midle-scale preparation of BAC plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pml I</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">R0532S</td>
			<td>20,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Polypropylene tubes (10 mL)</td>
			<td style="width:309px;">DeltaLab</td>
			<td style="width:123px;">175724</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">QIAEX II Gel Extraction Kit (150)</td>
			<td style="width:309px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">20021</td>
			<td>Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td style="width:309px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:123px;">M0371S</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">SOC Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">15544034</td>
			<td>Can be homemade as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Synthesis of cDNA fragments</td>
			<td style="width:309px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td style="width:123px;">10481220001</td>
			<td>1,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">6-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">12-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">24-Well Plates</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Agar Noble</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">214230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Cell Culture Dishes (100x21 mm)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Nunc)</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">525-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C6158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DAPI</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9542</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (HyClone))</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F8775</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Pan-flavivirus E protein mAb 4G2</td>
			<td style="width:309px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:123px;">NR-50327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:309px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15710-S</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:123px;">P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vectastain ABC Kit</td>
			<td style="width:309px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:123px;">PK-4010</td>
			<td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vero Cells</td>
			<td style="width:309px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ZIKV E Protein mAb 1176-56</td>
			<td style="width:309px;">BioFront Technologies</td>
			<td style="width:123px;">BF-1176-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1704468</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Class II Biosafety CO2 Cabinet</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Other commercial sources are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Desktop Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">High-Speed Refrigrated Centrifuge</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:309px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:123px;">1652100</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:309px;">ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:123px;">A24811</td>
			<td>Other machines are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Vortexer</td>
			<td style="width:309px;">Varies</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant zika virus from a bacterial artificial chromosome cdna clone

La asociación de la infección por el virus del Zika (ZIKV) con complicaciones neurológicas durante el reciente brote mundial y la falta de vacunas y/o antivirales aprobados han puesto de relieve la urgente necesidad de desarrollar sistemas genéticos inversos del ZIKV para facilitar la estudio de la biología ZIKV y el desarrollo de enfoques terapéuticos y/o profilácticos. Sin embargo, al igual que con otros flavivirus, la generación de clones infecciosos de ADNc infecciosos de longitud completa de ZIKV se ha visto obstaculizada debido a la toxicidad de las secuencias virales durante su amplificación en bacterias. Para superar este problema, hemos desarrollado un enfoque no tradicional basado en el uso de cromosomas artificiales bacterianos (BCC). Con este enfoque, la copia de ADNc de longitud completa de la cepa ZIKV Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) se genera a partir de cuatro fragmentos de ADN sintético y se ensambla en el plásmido pBeloBAC11 de una sola copia bajo el control del citomegalovirus humano (CMV) promotor inmediato-temprano. El clon de ADNC BAC ensamblado es estable durante la propagación en bacterias, y el recombinante infeccioso (r)ZIKV se recupera en las células de Vero después de la transfección del clon de BAC cDNA. El protocolo descrito aquí proporciona una técnica poderosa para la generación de clones infecciosos de flavivirus, incluyendo ZIKV, y otros virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con grandes genomas que tienen problemas de estabilidad durante las bacterias propagación.

El protocolo descrito aquí permite la generación de clones infecciosos estables de ADNc cDNA de longitud completa utilizando un BAC para minimizar los problemas de toxicidad asociados con varias secuencias flavivirales. La recuperación eficiente del rZIKV infeccioso del clon BAC cDNA se puede lograr fácilmente después de la transfección de células Vero susceptibles (Figura2). Usando este protocolo, hemos generado un clon estable de ADNc de longitud completa de la cepa ZIKV RGN32 clonando secuencialmente cuatro fragmentos de ADC superpuestos en el plásmido BAC pBeloBAC1134 utilizando métodos de clonación convencionales y únicos sitios de restricción presentes en el genoma viral (Figura2). El clon de ADNc de longitud completa fue flanqueado en el extremo 5 por el promotor humano del CMV para permitir la expresión de ARNm en el núcleo de las células transfectóntes, y en el extremo 3 por el HDV RZ seguido de las secuencias de poliadenilación y terminación BGH, para producir ARN que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen el extremo exacto de 3' del genoma viral (Figura2). La estabilidad en las bacterias del clon de ADNC BAC generado, junto con su fácil manipulación utilizando tecnologías estándar de ADN recombinante, pone de relieve el potencial del enfoque BAC cDNA para la generación rápida y confiable de clones estables de ADNc de cuerpo entero de ZIKV y otros flavivirus o virus de ARN de cadena positiva con genomas virales inestables.
Una vez ensamblado el clon BAC cDNA (Figura2), el virus infeccioso podría recuperarse fácilmente después de la transfección directa de células Vero susceptibles con el clon BAC cDNA utilizando liposomas catiónicos (Figura3). Este sistema lanzado por el ADNc permitió la expresión intracelular del ARNmtapado, permitiendo la recuperación de virus infecciosos sin necesidad de un paso de transcripción in vitro. Usando este enfoque, pudimos rescatar rZIKV-RGN con titulaciones superiores a 106 PFU/mL a los 5 días posteriores a la transfección (Figura4A). Además, el virus rescatado indujo un CPE claro (Figura4B),generó placas homogéneas de aproximadamente 2 mm de tamaño (Figura4C),y su identidad se confirmó mediante secuenciación (datos no mostrados) y análisis de inmunofluorescencia utilizando el mAb específico para la proteína ZIKV E, 1176-56 (Figura4D). Los datos in vitro indican que el rZIKV-RGN recuperado se replica batutamente en las células de Vero y con los niveles en comparación con un aislado32 natural de ZIKV (datos no mostrados). En general, estos resultados demuestran que el rZIKV infeccioso se puede rescatar de clones de ADNc de longitud completa ensamblados en un BAC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> Figura 1 : Organización del genoma ziKV y estructura virión. (A) Organización del genoma: ZIKV contiene un ARN positivo de una sola cadena que se traduce como una sola poliproteína. La poliproteína traducida fue lasinada por proteasas virales (flechas) y anfitrionas (diamantes) para producir las proteínas estructurales cápside (C, azul), matriz (M, marrón) y envolvente (E, verde), y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5). Las regiones no traducidas de 5' y 3' al final del genoma viral están indicadas con líneas negras. (B) Estructura virión: Los viriones ZIKV fueron decorados con las proteínas E y M, anclados en una bicapa lipídica con una estructura icosahedral. Bajo el enlope viral estaba el nucleópsido viral compuesto por la proteína C asociada con el ARN genómico viral. Esta figura ha sido adaptada de la ciudad de ávila-Pérez ydel 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> Figura 2 : Montaje del clon de ADNc infeccioso ziKV en un BAC. (A) Representación esquemática del BAC pBeloBAC11:Los genes reguladores parA, parB, parCy repE, el origen de replicación delfactor F (OriS), el gen resistente al cloranfenicol (Cmr) y el lac El gen Z está indicado. Se subrayan los sitios de restricción pertinentes utilizados para ensamblar el clon infeccioso de ADNc de ZIKV. (B) Montaje del clon infeccioso de ADNc infeccioso ZIKV en el pBeloBAC11 BAC:Cuatro fragmentos de ADN superpuestos (Z1-Z4), que abarcan todo el genoma de ZIKV (Figura1) y flanqueados por los sitios de restricción indicados, fueron generados por productos químicos síntesis y clonado secuencialmente en pBeloBAC11 para generar el infeccioso clon ZIKV cDNA pBAC-ZIKV. El ADNc infeccioso ZIKV de longitud completa fue ensamblado bajo el control del promotor inmediato del citomegalovirus humano (CMV) y flanqueado en el extremo 3 por las secuencias de terminación y poliadelación de la hormona de crecimiento bovina (RZ) y la hormona de crecimiento bovina (BGH). Las siglas de los genes virales y los elementos reguladores son las descritas en la Figura1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> Figura 3 : Flujo de trabajo para generar rZIKV a partir del clon BAC cDNA. Las células de Vero al 90% de la confluencia se transtrataron en monocapa con el clon infeccioso de ADNc infeccioso de longitud completa de ZIKV pBAC-ZIKV (Figura 2) utilizando liposomas catiónicos. A los 4-6 días posteriores a la transfección, cuando el CPE era evidente, se recogieron y evaluaron los sobrenatores de cultivo de tejido que contenían rZIKV para detectar la presencia de virus (Figura 4) y se utilizaron para la amplificación viral en las células de Vero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> Figura 4 : Recuperación y caracterización in vitro de rZIKV. (A) Rescate del rZIKV infeccioso del clon BAC cDNA: Las células de Vero al 90% de la confluencia (formato de placa de 6 pocillos, triplicados) fueron simuladas de transpiración o transfiguradas con 4 g/pozo de pBAC-ZIKV (Figura3),y en los días indicados después de la transfección, los lanzadores de virus en los sobrenatantes de cultivo de tejidos se determinaron mediante el ensayo de placa (PFU/ml). Las barras de error indican desviaciones estándar de tres experimentos de transfección diferentes. La línea negra punteada indica el límite de detección (50 PFU/ml). (B) CPE viral:Vero células con 90% de confluencia (formato de placa de 6 pocillos, triplicados) fueron infectadas por imitaciones (superior) o infectadas (MOI de 0,5 PFU/célula) con rZIKV, y a 48 h de postinfección, la presencia de CPE se evaluó mediante microscopía ligera. Barras de escala a 100 m. (C) Ensayo viral de placa e inmunomancha: Las células de Vero con una confluencia del 90% (formato de placa de 12 pocillos) se infectaron con rZIKV, y a 72 h después de la infección, las placas virales se visualizaron por tinción violeta cristalina (izquierda) o mediante inmunostaining ( derecha) utilizando la proteína pan-flavivirus E mAb 4G2. Barras de escala a 5 mm. (D) Inmunofluorescencia: Las células de Vero con una confluencia del 90% (formato de placa de 24 pocillos, triplicados) estaban infectadas (MOI de 0,5 PFU/célula) con rZIKV y, a 48 h de postinfección, analizadas por inmunofluorescencia utilizando el mAb 1176-56, específico para ZIKV Proteína E. Los núcleos celulares se teñieron con DAPI. Se muestra una imagen combinada representativa de las células Vero infectadas por ZIKV. El cuadrado blanco en la parte superior derecha representa una imagen ampliada de las células Vero infectadas por ZIKV. Barras de escala a 100 m. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

La reciente epidemia del virus del Zika pone de relieve la importancia de establecer enfoques genéticos inversos para desarrollar vacunas y/o estrategias terapéuticas. Aquí, describimos el protocolo para rescatar un virus del Zika recombinante infeccioso de un clon de ADNc de longitud completa ensamblado en un cromosoma artificial bacteriano bajo el control del promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano.

Rescate del virus del Zika recombinante de un clon de ADNc cromosómico artificial bacteriano

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es la generación del virus del Zika recombinante infeccioso a partir de un clon de ADNc de longitud completa, ensamblado en un cromosoma artificial bacteriano bajo el control del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano. El desarrollo de un sistema genético inverso para virus de ARN como el virus del Zika permite la manipulación directa del genoma del virus para estudiar múltiples aspectos de la biología viral y la patogénesis y desarrollar la estrategia de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que la construcción de un clon infeccioso del virus del Zika como un cromosoma artificial bacteriano supera la toxicidad asociada con el genoma del flavivirus y permite el rescate del virus infeccioso por transfección directa del clon de BAC cDNA en células susceptibles.Esta metodología podría aplicarse a la construcción de clones de ADNn sobre zonas de servicio infecciosas estables y totalmente funcionales para otros flavivirus, así como otros virus de ARN de cadena positiva. Para comenzar este procedimiento, construya el clon cDNA del virus del Zika como se describe en el protocolo de texto, utilizando sitios de restricción apropiados. Cuatro fragmentos de ADN que abarcan el genoma del virus del Zika flanqueados por el promotor humano del CMV en el extremo cinco-prime y el ribosoma del virus del delta de la hepatitis y la terminación de la hormona de crecimiento bovina y secuencias de poliadenilación en el extremo tres-prime se ensamblan en un plásmido cromosómico artificial bacteriano.En primer lugar, crecer una sola colonia de E.coli DH10B que lleva el clon infeccioso del virus pBAC-Zika en cinco mililitros de medio LB que contiene cloramphenicol durante ocho horas a 37 grados celsius con agitación suave. A continuación, añada 500 mililitros del medio LB que contenga cloranfenicol a un matraz de dos litros. Añadir un mililitro del cultivo bacteriano preparado al matraz y hacer crecer las células a 37 grados centígrados durante 14 a 16 horas hasta que el OD600 sea aproximadamente de 0,6 a 0,8.Después de esto, utilice un kit comercial desarrollado específicamente para la purificación de BAC para purificar el clon de cDNA infección por BAC por lílisis alcalina siguiendo las instrucciones del fabricante. Un día antes de la transfección, placa Vero células en los pocillos de una placa de seis pocillos a una densidad de 500.000 células por pozo en medio de crecimiento. Para preparar la mezcla de transfección, agregue cuatro microgramos del clon de BAC cDNA a 250 microlitros de suero reducido medio y mezcle cuidadosamente.En un tubo separado, diluir 12 microlitros del agente de transfección en 250 microlitros de suero reducido medio. Vórtice para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, combine el cDNA de BAC diluido con el agente de transfección.Mezclar cuidadosamente e incubar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Durante este período de incubación, utilice un medio de crecimiento sin antibióticos para lavar las células del Vero y dejar las células en un mililitro de medio fresco sin antibióticos. A continuación, distribuya los 500 microlitros del ADNc y la mezcla de reactivos de transfección en las células de Vero por gota.Mece la placa de ida y vuelta para mezclar e incubar las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después de esto, retire el medio de transfección y agregue dos mililitros de medio de crecimiento fresco con antibióticos. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, asegurándose de comprobar cada día la inducción del efecto citopático.Después de cuatro a seis días de transfección, cuando el CPE es alrededor de 50 a 75%recoger los sobrenadantes de cultivo de tejido en tubos cónicos de 15 mililitros y centrífuga durante 10 minutos para eliminar los desechos celulares. Luego, cosecha los sobrenadantes que contienen el virus del Zika recombinante y desecha los gránulos celulares. Aliquot el sobrenadante en criotubos y guárdelos a menos 80 grados Celsius.Para empezar, haga crecer las células de Vero al 90%de la confluencia. Lavar las células dos veces con PBS e infectarlas con el virus rescatado con la multiplicidad de infección de 0,1 en medio de crecimiento que contiene 2%FBS. Coloque las placas de las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y roca cada 15 minutos durante el período de adsorción de 90 minutos.Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo viral y añadir medio de crecimiento fresco con 2%FBS. Incubar tres o cuatro días en las mismas condiciones utilizadas anteriormente. Cuando el CPE es aproximadamente 75%recoger el sobrenadante de cultivo de tejido y centrífuga para eliminar los desechos celulares.Luego, cosecha el sobrenadante que contiene el virus del Zika recombinante y desecha el pellet. Aliquot el sobrenadante en criotubos. Coloque los tubos en una caja de congelación y guárdelos a menos 80 grados centígrados.Cuando esté listo, retire una alícuota de virus del congelador y determine el título viral por ensayo de placa como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se genera un clon estable y de longitud completa de la cepa del virus del Zika Rio Grande do Norte Natal mediante la clonación secuencial de cuatro fragmentos de ADNr superpuestos en el cromosoma artificial bacteriano pBeloBAC11 utilizando métodos de clonación convencionales y sitios de restricción únicos presentes en el genoma viral. Este clon de ADNc de longitud completa fue flanqueado en el extremo cinco-prime por el promotor humano del citomegalovirus para permitir la expresión de ARN viral en el núcleo de las células trans infectadas y en el extremo de tres primos por el ribosoma del virus del delta de la hepatitis seguido por la terminación de la hormona de crecimiento bovino y la secuencia de poliadenilación para producir ARN que contiene el extremo tres-prime exacto del genoma viral.Una vez que se monta el cDNA de BAC, el virus infeccioso se puede recuperar fácilmente después de la transfección directa de células susceptibles de Vero con el clon de BAC cDNA utilizando liposomas catiónicos. Con este enfoque, el virus R zika RGN puede ser rescatado con títulos superiores a un millón de unidades formadoras de placas por mililitro. Además, el virus rescatado induce un claro efecto citopático y genera placas homogéneas de aproximadamente dos milímetros de tamaño.La identidad del virus rescatado se confirma mediante un análisis de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la proteína E del virus del Zika. En general, estos resultados demuestran que el virus del Zika recombinante infeccioso puede ser rescatado de clones de ADNc de longitud completa ensamblados en un BAC. En resumen, hemos desarrollado un potente enfoque genético inverso del virus del Zika basado en el uso de un cromosoma artificial bacteriano que podría adaptarse para generar las infecciones estables y funcionales con clon de ADNc de otros virus de ARN de cadena positiva para facilitar el estudio de la patología, desarrollar una vacuna, y facilitar la identificación de fármacos con actividad antiviral.

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