Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
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我们感谢哈默实验室的成员对手稿的批判性评价和对这项工作的支持。科罗拉多大学医学院的亚历克斯·霍斯威尔博士亲切地提供了AH1263。密歇根州立大学的克里斯·沃特斯博士实验室提供了试剂。这项工作得到了美国心脏协会16SDG30170026的资助和密歇根州立大学提供的启动基金的支持。

注:以下从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白颗粒的协议来自穆萨等人2002年33。
1. 制备鸡蛋黄以浓缩低密度脂蛋白颗粒
<ol><li>用70%乙醇溶液清洗壳,使两个大鸡蛋消毒,并晾干。</li>
	<li>使用 70% 乙醇溶液对鸡蛋分离器进行消毒,并允许空气干燥。将鸡蛋分离器连接到中型烧杯的唇上。</li>
	<li>将每个鸡蛋分别裂入鸡蛋分离器中,让白蛋白流入烧杯。完整的蛋黄将由分?...

Aureus将外源脂肪酸加入其膜磷脂27,32,43。使用外源性脂肪酸的磷脂合成绕过了FASII抑制,但也改变了膜27、32、44的生物物理特性。虽然将外源性脂肪酸纳入革兰氏阳性病原体磷脂是有据可查的,但在宿主脂肪酸储存库的身份和三种主要葡萄球菌磷脂类型?...

耐甲氧西林(MRSA)是卫生保健相关感染的主要原因,相关的抗生素耐药性是一个相当大的临床挑战1,2,3。因此,制定新的治疗策略是重中之重。革兰氏阳性病原体的一个有前途的治疗策略是抑制脂肪酸合成,这是膜磷脂生产的要求,在S.aureus中,包括磷脂甘油(PG)、裂解-PG和心肌利平4。在细菌中,脂肪酸的产生通过脂肪酸合成II途径(FASII)5发生,这与真核对应物有很大不同,使得FASII成为抗生素开发5,6个有吸引力的靶点。.FASII抑制剂主要针对FabI,这是脂肪酸碳链伸长化所需的一种酶。FabI抑制剂三氯生被广泛用于消费品和医疗用品8,9。几家制药公司正在开发额外的FabI抑制剂,用于治疗10、11、12、13、14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.然而,许多革兰氏阳性病原体,包括S.aureus,能够清除外源脂肪酸的磷脂合成,绕过FASII抑制27,28,29。因此,FASII抑制剂的临床潜力是辩论的,因为我们对宿主脂肪酸的来源和病原体从宿主27、28中提取脂肪酸的机制的认识存在相当大的差距。为了弥补这些差距,我们开发了一种无偏脂质学分析方法,以监测脂蛋白颗粒中外源脂肪酸与S.aureus膜磷脂的合并情况。
在败血症期间,宿主脂蛋白颗粒是血管内宿主衍生脂肪酸的潜在来源,因为大多数宿主脂肪酸都与颗粒30相关。脂蛋白由亲水外壳组成,由磷脂和蛋白质组成,这些蛋白质包裹着甘油三酯和胆固醇酯的疏水性核心31。四大类脂蛋白 - 奇洛美亚、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白 (LDL) - 由宿主生产,并充当脂质运输工具,提供脂肪酸和胆固醇。通过血管的宿主细胞。低密度脂蛋白富含酯化脂肪酸,包括甘油三酯和胆固醇酯31。我们之前已经证明,高度纯化的人类低密度脂蛋白是PG合成的外源脂肪酸的可行来源,从而为FASII抑制剂旁路32提供了机制。纯化人体低密度脂蛋白在技术上可能具有挑战性且耗时,而纯化人类低密度脂蛋白的商业来源在日常使用或进行大规模细菌筛选时成本高昂。为了解决这些限制,我们修改了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白的程序,鸡蛋蛋黄是脂蛋白颗粒33的丰富来源。我们已经成功地使用非目标,高分辨率/准确的质谱和串联质谱监测将人类LDL衍生脂肪酸结合到S.aureus32膜中。与先前报告的方法不同,这种方法可以量化三种主要葡萄球菌磷脂类型的单个脂肪酸异构体。油酸(18:1)是存在于所有宿主脂蛋白颗粒中的不饱和脂肪酸,很容易并入S.aureus磷脂29,30,32。金黄色葡萄球菌不能合成油酸29;因此,磷脂结合的油酸的数量建立在葡萄球菌膜29中存在宿主脂蛋白衍生脂肪酸。这些磷脂物种可以通过这里描述的最先进的质谱法来识别,在脂肪酸来源存在的情况下,为培养的S.aureus的膜组成提供了前所未有的分辨率。感染期间遭遇。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性病原体将环境中的脂肪酸结合到膜磷脂中。在感染期间,大多数外源脂肪酸存在于宿主脂蛋白颗粒中。宿主脂肪酸的储存库以及细菌从脂蛋白颗粒中提取脂肪酸的机制仍存在不确定性。在这项工作中,我们描述了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白(LDL)颗粒的协议,并确定LD是否作为S.aureus的脂肪酸储存库。该方法利用无偏脂质学分析和鸡低密度脂蛋白,是探索低密度脂蛋白与细菌相互作用的有效经济模型。采用高分辨率/精确质谱法和串联质谱法对低密度脂蛋白中外源脂肪酸的S.氨基酸整合进行分析,从而对细菌的脂肪酸成分进行表征膜和无偏的鉴定在接触低密度脂蛋白时在细菌膜脂质中产生的脂肪酸的新组合。这些先进的质谱技术通过揭示并入磷脂中的特定外源脂肪酸,为脂肪酸的加入提供了无与伦比的视角。此处概述的方法适用于其他细菌病原体和复杂脂肪酸的替代来源的研究。

图1说明了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白的协议。这个过程首先用盐水稀释整个蛋黄,并将蛋黄固体从含有LDL的可溶性或血浆部分中分离出,称为颗粒(图1)33。血浆馏分的LDL含量通过+30-40 kDaβ-活蛋白的沉淀进一步丰富(图2)33。蛋白质带在140、80、65、60和15 kDa的存在与低密?...

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Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

从鸡蛋黄中分离脂蛋白颗粒,研究细菌病原体脂肪酸并入膜磷脂

该方法为研究将来自复杂宿主来源的外源脂肪酸结合到细菌膜中提供了一个框架,特别是金黄色葡萄球菌。为此,介绍了从鸡蛋蛋黄中浓缩脂蛋白颗粒的方案,以及利用质谱法对细菌磷脂进行随后脂肪酸分析的介绍。

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

该协议为研究将复杂宿主源的外源脂肪酸纳入细菌膜，特别是金黄色葡萄球菌提供了一个框架。该协议利用无偏见的脂质分析和从蛋黄中分离的脂蛋白颗粒作为复杂脂肪酸的经济来源，以量化脂肪酸在细菌脂质中的结合。此处描述的质谱技术为金黄色葡萄球菌脂质的脂肪酸剖面提供了无与伦比的视角，但可以适应其他细菌膜的研究。执行此协议时，应注意每个分馏步骤，以识别和保留包含 LDL 的分数。从血浆分数中去除硫酸氨对低密度脂蛋白的下游应用至关重要。首先，用30毫升无菌磷酸盐缓冲盐水洗两次蛋黄，以去除残留的白素。用无菌移液器尖端刺穿葡萄干膜，将膜内装物排入无菌的 50 毫升锥形离心管中。在pH7下加入约24至30毫升或17摩尔氯化钠溶液，加入蛋黄并大力混合。然后将管子放在摇摇器上，在4摄氏度下混合60分钟。将蛋黄稀释在10摄氏度，在10，000倍g下，45分钟。将上流液液分转移到无菌的 50 毫升圆锥管中，留下颗粒颗粒分数。和离心机再次。首先，在4摄氏度的摇床或类似装置上，将等离子体分数与40质量体积百分比硫酸铵混合60分钟。调整pH值后，在4摄氏度和10，000次g下将等离子体部分离心，持续45分钟。将上半固体黄色部分去除为七千多孔大小的透析管。在油管中提供至少 25% 的额外空间，以便其膨胀。将透析管放在三升超纯水中，在三摄氏度下通宵透析，以去除硫酸铵。透析后，将溶液在四摄氏度下离心，如前所述。小心地将上半固体黄色部分取出到无菌管中，并在四摄氏度下储存。经过隔夜孵育的培养，将500微升转移到两个无菌的250毫升的困惑烧瓶中，其中含有49.5毫升的1%的尝试酮汤。在37摄氏度下孵育约4小时，摇晃至中长相。以25毫升的增量将100毫升培养器转移到4个无菌的50毫升离心管中，并在10，000倍g下离心四管，使细胞产生颗粒。去除上一提液，并在 750 微升 1% trypton 肉汤中重新悬浮每个细胞颗粒。将四个 750 微升电池悬浮液组合到一个 15 毫升管中。和等分350微升的细胞悬浮成6个无菌的1.5毫升离心管。使用移液器将30微升LDL加入1.5毫升离心管，达到5%的最终浓度，并在37摄氏度下孵育，摇晃4小时。在4摄氏度下以16，000倍g将培养物离心，持续两分钟。并在330微升无菌磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮细胞颗粒进行清洗。再重复一次。通过减去空管的重量记录六个湿细胞颗粒的重量。在干冰上捕捉细胞颗粒。首先在每个细胞颗粒上加入一勺5毫米氧化硅珠。将 740 微升 75%HPLC 级甲醇直接加入到零下 80 摄氏度的管中。然后添加两个微升的50微摩尔二甲基磷脂酰胆碱作为内部标准。将含有 1.5 毫升离心管的样品放入子弹搅拌机组织均质器上的可用端口中。在低速时使样品均质化。设置 2 到 3 三分钟。目视检查样品的均匀性。如果细胞团可见，则以两分钟为增量在子弹搅拌机中继续均质化。接下来，在化学烟罩的每个样品中加入270微升氯仿。用力旋转样品30分钟。将样品在台式离心机中离心长达30分钟，至少2000次。在化学烟气罩中，收集单相上清液并转移到新的试管中，同时小心地避免提取管底部的蛋白质颗粒。将先前准备的稀释脂质提取物转移到适当的自动采样器小瓶中。对于基于流量喷射的分析，将自动采样器小瓶放入 HPLC 系统的温度控制自动采样器中，该系统能够进行毛细管流应用。根据手稿设置 HPLC 系统。通过装有低流量 34 仪表金属针的电喷电离源，从 HPLC 传输线引入质谱仪。在热调 Plus 仪器控制软件中，将电离电压设置为 4，000 伏特，将护套气体设置为 5。同样，将毛细管温度设置为 150 摄氏度，将 S 镜头设置为 50% 单击定义扫描按钮，并在分析仪菜单中选择 FTMS。将质量范围字段设置为正常，在分辨率字段中，选择 100，000。确保扫描类型设置为已满。在扫描范围菜单下，在第一个质量字段中输入 200，在最后一个质量字段中输入 2，000。在进一步定义观测质量精度后，在总离子色谱图中对宽峰的信号进行平均。右键单击大容量频谱查看窗口中的拇指标记图标，然后选择视图频谱列表。从同一菜单中，选择显示选项，然后在显示菜单中选择所有峰值切换框。单击"正常"按钮以关闭查看窗口。右键单击大容量查看窗口中的拇指标记图标，然后选择导出剪贴板的精确质量。将第一个工作表的导出数据单元格 A1 粘贴到新的 Excel 电子表格中，然后根据手稿继续操作。要执行准确的质量脂质识别，请打开 LIMSA 软件。从主菜单中，在频谱类型菜单下选择峰值列表。选择正模式或负模式，以与获取质谱数据中的极性相对应。在峰值全宽（最大值一半）和超过 z 窗口时，输入所需的质量搜索窗口以查找峰值。在该协议中，30至40千达吨β悬浮素的沉淀进一步丰富了等离子体分数的LDL含量。140、80、65、60和15千元以下的蛋白带的存在与低密度脂蛋白的蛋白相关。 三氯生治疗抑制无脂肪酸介质中金黄色葡萄球菌的生长。同时补充蛋黄血浆作为外源脂肪酸来源的培养物，克服了三氯生引起的生长抑制。同样，用丰富的蛋黄LDL补充三氯生处理的培养物可以恢复生长。此外，蛋黄LDL的添加支持以前特征的S.aureus脂肪酸，奥索特罗菲的生长。通过采用流量注入高分辨率的精确质谱法，以1%的尝试性汤或蛋黄LDL测量脂肪前酸含量。发现少量自由脂肪酸。正交部分最平方鉴别分析丰富的金黄色葡萄球菌膜磷脂证明分明分类分离，具有未经处理的脂肪酸成分和蛋黄LDL处理条件。从蛋黄中富集低密度脂蛋白为研究细菌病原体和宿主脂蛋白之间的相互作用提供了廉价的复杂脂肪酸来源。用于制备脂质提取物的氯仿和甲醇是危险的。请务必在化学烟罩中使用这些试剂，并包含所有废物流。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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科研

生物化学

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