Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af hammer laboratoriet for deres kritiske evaluering af manuskriptet og støtte til dette arbejde. Dr. Alex Horswill fra University of Colorado School of Medicine venligt forudsat AH1263. Dr. Chris Waters laboratorium på Michigan State University leverede reagenser. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association Grant 16SDG30170026 og start-up midler fra Michigan State University.

Bemærk: følgende protokol for tilsætning af LDL-partikler fra kyllingægge blomme er afledt af Moussa et al. 200233.
1. fremstilling af hønseæg æggeblomme til berigelse af LDL-partikler
<ol><li>Sanitize to store hønseæg ved at vaske skaller med 70% ethanol opløsning og lad lufttørre.</li>
	<li>Sanitize ægge separatoren ved hjælp af 70% ethanol opløsning og lad lufttørre. Fastgør ægseparatoren på læben på et mellemstort bægerglas.</li>
	<li>Knæk hv...

S. aureus inkorporerer eksogene fedtsyrer i dets membran fosfolipider27,32,43. Fosfolipid syntese ved hjælp af eksogene fedtsyrer omgår fasii hæmning, men også ændrer de biofysiske egenskaber af membranen27,32,44. Mens inkorporering af eksogene fedtsyrer i phospholipider af gram-positive patogener er veldokumenteret, mangl...

Methicillin-resistent S. aureus (MRSA) er den førende årsag til sundhedsrelateret infektion, og den associerede antibiotikaresistens er en betydelig klinisk udfordring1,2,3. Derfor er udviklingen af nye terapeutiske strategier en høj prioritet. En lovende behandlingsstrategi for gram-positive patogener hæmmer fedtsyre syntesen, et krav til membran fosfolipid produktion, der i S. aureus, omfatter phosphatidylglycerol (PG), lysyl-PG, og cardiolipin4. I bakterier, fedtsyre produktion sker via fedtsyre syntese II pathway (fasii)5, som er betydeligt forskellig fra eukaryote modstykke, gør fasii et attraktivt mål for antibiotika udvikling5,6 . FASII-hæmmere primært Target FabI, et enzym, der kræves for fedtsyre kulstofkæde forlængelse7. Fabi-hæmmeren triclosan anvendes i vid udstrækning i forbruger-og medicinalvarer8,9. Yderligere Fabi-hæmmere er ved at blive udviklet af flere farmaceutiske virksomheder til behandling af S. aureus infektion10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Men, mange gram-positive patogener, herunder S. aureus, er i stand til at scavenging eksogene fedtsyrer for phospholipid syntese, omgåelse fasii hæmning27,28,29. Således diskuteres det kliniske potentiale af fasii-hæmmere på grund af betydelige huller i vores viden om kilderne til vært fedtsyrer og de mekanismer, hvormed patogener ekstrakt fedtsyrer fra værten27,28. For at afhjælpe disse mangler, vi udviklet en objektiv lipidomisk analysemetode til at overvåge inkorporering af eksogene fedtsyrer fra lipoprotein partikler i membran fosfolipider af S. aureus.
Under sepsis, vært lipoprotein partikler repræsenterer en potentiel kilde til Host-afledte fedtsyrer i Vaskulaturen, som et flertal af vært fedtsyrer er forbundet med partiklerne30. Lipoproteiner består af en hydrofile Shell sammensat af phospholipider og proteiner, som vedlægger en hydrofobe kerne af triglycerider og kolesterol estere31. Fire store klasser af lipoproteiner--chylomicron, meget lav densitet lipoprotein, high-density lipoprotein, og low-density lipoprotein (LDL)-er produceret af værten og fungere som lipid transport køretøjer, leverer fedtsyrer og kolesterol til og fra Host celler via vasculature. LDLs er rigelige i esterificeret fedtsyre, herunder triglycerider og kolesterol estere31. Vi har tidligere påvist, at højt renset humane LDLs er en levedygtig kilde til eksogene fedtsyrer til PG syntese, hvilket giver en mekanisme for FASII-hæmmer bypass32. Rensning af humane ldl'er kan være teknisk udfordrende og tidskrævende, mens kommercielle kilder til rensede humane ldl'er er uoverkommeligt dyre at bruge rutinemæssigt eller til at udføre store bakterie skærme. For at løse disse begrænsninger, har vi ændret en procedure for berigelse af LDLs fra kylling æggeblomme, en rig kilde til lipoprotein partikler33. Vi har med succes brugt umålrettet, høj opløsning/nøjagtig massespektrometri og tandem massespektrometri til at overvåge inkorporering af humane LDL-afledte fedtsyrer i membranen af S. aureus32. I modsætning til tidligere rapporterede metoder, denne fremgangsmåde kan kvantificere individuelle fedtsyrer isomerer for hver af de tre store stafylokok phospholipid typer. Oliesyre (18:1) er en umættet fedtsyre til stede i alle Host lipoprotein partikler, der let inkorporeres i S. aureus fosfolipids29,30,32. S. aureus er ikke i stand til oliesyre syntese29; Derfor fastsætter mængden af phospholipid-indarbejdet oliesyre tilstedeværelsen af vært lipoprotein-afledte fedtsyrer i stafylokoken membran29. Disse phospholipid arter kan identificeres ved den state-of-the-art massespektrometri metode, der er beskrevet her, tilbyder hidtil uset opløsning af membranens sammensætning af S. aureus dyrket i nærværelse af en fedtsyre kilde det sandsynligt møder under infektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

Staphylococcus aureus og andre gram positive patogener inkorporerer fedtsyrer fra omgivelserne i membran Fosfolipiderne. Under infektion, de fleste af eksogene fedtsyrer er til stede i Host lipoprotein partikler. Der er fortsat usikkerhed med hensyn til reservoirer af værts fedtsyrer og de mekanismer, hvormed bakterier ekstrahere fedtsyrer fra lipoprotein partiklerne. I dette arbejde beskriver vi protokoller for berigelse af low-density lipoprotein (LDL) partikler fra hønseæg æggeblomme og afgøre, om LDLs fungere som fedtsyre reservoirer for S. aureus. Denne metode udnytter upartisk lipidomic analyse og kylling LDLs, en effektiv og økonomisk model for udforskning af interaktioner mellem LDLs og bakterier. Analysen af S. aureus integration af eksogene fedtsyrer fra LDLs udføres ved hjælp af høj opløsning/nøjagtig massespektrometri og tandem massespektrometri, der muliggør karakterisering af fedtsyre sammensætningen af bakterien membran og objektiv identifikation af nye kombinationer af fedtsyrer, som opstår i bakterielle membran lipider ved udsættelse for LDLs. Disse avancerede massespektrometri teknikker tilbyder en uovertruffen perspektiv af fedtsyre inkorporering ved at afsløre de specifikke eksogene fedtsyrer indarbejdet i Fosfolipiderne. De metoder, der er skitseret her, er tilpasningsdygtige til studiet af andre bakterielle patogener og alternative kilder til komplekse fedtsyrer.

Protokollen for tilsætning af LDL fra kyllingægge blomme er illustreret i figur 1. Denne proces begynder ved at fortynde hele æggeblomme med saltvand og adskille æggeblomme tørstof benævnt granulat fra den opløselige eller plasma fraktion indeholdende Ldl'er (figur 1)33. LDL-indholdet i plasma fraktionen er yderligere beriget ved udfældning af ~ 30-40 kDa β-livetiner (figur 2<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Denne metode giver en ramme for at studere inkorporering af eksogene fedtsyrer fra komplekse vært kilder i bakterielle membraner, især Staphylococcus aureus. For at opnå dette, protokoller for tilsætning af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme og efterfølgende fedtsyre profilering af bakterielle fosfolipider udnytter massespektrometri er beskrevet.

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Denne protokol giver en ramme for at studere inkorporering af udefrakommende fedtsyrer fra komplekse værtskilder i bakterielle membraner, især stafylokokker aureus. Protokollen anvender upartisk lipodonmic analyse og lipoprotein partikler isoleret fra kylling æggeblommer som en økonomisk kilde til komplekse fedtsyrer til at kvantificere fedtsyre inkorporering i bakterielle lipider. Massespektrometriteknikker beskriver her giver et enestående perspektiv af fedtsyreprofilen af staphylococcus aureus lipider, men kan tilpasses til at studere andre bakteriemembraner.Når du udfører denne protokol, skal det sikres, at hver fraktionering trin til at identificere og bevare LDL-holdige fraktion. Fjernelse af ammoniaksulfat fra plasmafraktionen er afgørende for downstream-anvendelser af LDR. Giv rigelig plads i slangen og skift vandet efter behov for at muliggøre effektiv dialyse.Til at begynde, vaske to æggeblommer to gange med 30 milliliter sterile fosfat buffered saltvand for at fjerne resterende albumin. Punktere vitellinemembranen med en steril pipettespids og tøm indholdet af membranen i et sterilt 50 milliliter konisk centrifugerør. Der tilsættes ca. 24 til 30 milliliter eller 17 molarnatriumchloridopløsning ved pH-7 til æggeblommen og blandes kraftigt.Derefter placere røret på en vuggende shaker at blande ved fire grader Celsius i 60 minutter. Centrifuge æggeblomme fortynding ved 10 grader Celsius ved 10, 000 gange g i 45 minutter. Supernatantplasmafraktionen overføres til et sterilt konisk rør på 50 milliliter, som efterlader den pelleterede granulære fraktion.Og centrifuge igen. Bland først plasmafraktionen med 40 massevolumen procent ammoniumsulfat på en gyngende shaker eller lignende enhed ved fire grader Celsius i 60 minutter. Efter justering af pH-30 centrifuger plasmafraktionen ved fire grader Celsius og 10.000 tid g i en varighed på 45 minutter.Fjern den øverste halvsolidgule fraktion i syv kilodalton pore størrelse dialyserør. Giv mindst 25% ekstra plads i slangen for at give mulighed for at svulme op. Placer dialyse slanger i tre liter ultrarent vand til dialyze natten over på tre grader Celsius at fjerne ammonium sulfat.Efter dialyse centrifugeres opløsningen ved fire grader Celsius som tidligere beskrevet. Fjern forsigtigt den øvre, halvsolidegule fraktion til et sterilt rør og opbevares ved fire grader Celsius. Efter natten inkubation af kulturen overføres 500 mikroliter til to sterile 250 milliliter-forvirrede kolber indeholdende 49,5 milliliter 1 % tryptonbouillon.Inkubere i cirka fire timer ved 37 grader Celsius med omrystning for at nå midten af den lange fase. 100 milliliter kultur i intervaller på 25 milliliter overføres til fire sterile 50 millilitercentrifugerør, og de fire rør centrifugeres ved 10.000 gange g for at pelletere cellerne. Fjern supernatant og re-suspendere hver celle pellet i 750 mikroliter af 1% tryptone bouillon.Kombiner de fire 750 mikrolitercellesuspensioner i et enkelt 15 milliliterrør. Og aliquot 350 mikroliter af celle suspension i seks sterile 1,5 milliliter centrifuge rør. Brug en pipette til at tilføje 30 mikroliter LDL'er i 1,5 milliliter centrifugerøret for at opnå en ønsket endelig koncentration på 5% Og inkubere ved 37 grader Celsius med omrystning i fire timer.Centrifuge kulturerne ved fire grader Celsius ved 16, 000 gange g i en varighed på to minutter. Og re-suspendere celle pellets i 330 mikroliter af sterile fosfat-buffered saltvand til at vaske. Gentag denne vask en gang til.Vægten af de seks våde cellepellets registreres ved at trække vægten af det tomme rør fra. Snap fryse celle pellets på tøris. Først tilsættes en scoop af 5 millimeter zirkoniumoxid perler på toppen af hver celle pellet.Tilsæt 740 mikroliter af 75% HPLC grade methanol kølet til minus 80 grader Celsius direkte ind i hvert rør. Derefter tilsættes to mikroliter af 50 mikromolar dimyristoyl phosphatidylcholin som en intern standard. Prøven, der indeholder 1,5 milliliter centrifugerør, anbringes i en tilgængelig port på en blandingss homogenisator til kugleblendervæv.Homogeniser prøverne ved lav hastighed. Indstilling to til tre i tre minutter. Synsprøverne for homogenitet.Hvis klumper af celler er synlige, skal du fortsætte homogeniseringen i punktblenderen i to minutters intervaller. Dernæst tilsættes 270 mikroklitter chloroform til hver prøve i en kemisk røghætte. Vortex prøverne kraftigt i 30 minutter.Centrifuge prøverne i en bænk-top centrifuge i op til 30 minutter på mindst 2,000 gange g. I den kemiske røghætte opsamler den monophasiske supernatant og overfør det til et nyt reagensglas, samtidig med at proteinpellen i bunden af ekstraktionsrøret undgås omhyggeligt. Overfør de fortyndede lipidekstrakter, der tidligere er forberedt, til et passende autosamplerhætteglas.Til flowindsprøjtningsbaseret analyse skal autosamplerhætteglassene sættes i en temperaturstyret autosampler af et HPLC-system, som er i stand til kapillær flowapplikationer. Konfigurer HPLC-systemet i henhold til manuskriptet. Elueringskilden introduceres fra HPLC-overførselslinjen til massespektrometeret gennem en elektrosprayioniseringskilde udstyret med en lav-flow 34 gauge metalnål.I Thermo Tune Plus instrument kontrol software, indstille ionisering spænding til 4, 000 volt og kappe gas til fem. På samme måde skal du indstille kapillærtemperaturen til 150 grader Celsius og S-objektivet til 50%Klik på knappen Definer scanning, og vælg FTMS i analysatormenuen. Angiv masseområdefeltet til normal, og vælg 100.000 i beslutningsfeltet.Sørg for, at scanningstypen er indstillet til fuld. Under menuen scanningsområder skal du skrive 200 i det første massefelt og indtaste 2.000 i det sidste massefelt. Efter yderligere definition af observeret massenøjagtighed beregnes signalet over den brede top i det samlede ionkromatogram.Højreklik på thumbtack-ikonet i vinduet til visning af massespektrum, og vælg visningsspektredliste. Vælg visningsindstillinger i den samme menu, og derefter skifter alle toppebokse i visningsmenuen. Klik på knappen okay for at lukke visningsvinduet.Højreklik på thumbtack-ikonet i massespektrets visningsvindue igen, og vælg den nøjagtige masse af udklipsholderen. Indsæt den eksporterede datacelle A1 i det første regneark i det nye Excel-regneark, og fortsæt i henhold til manuskriptet. Hvis du vil udføre nøjagtige massebaserede lipididentifikationer, skal du åbne LIMSA-softwaren.Vælg topliste under menuen spektrumtype i hovedmenuen. Vælg positiv tilstand eller negativ tilstand, der svarer til den polaritet, hvori massespektrometridataene blev anskaffet. I toppen fuld bredde ved halvt maksimum og over z vindue, skal du indtaste den ønskede masse søgevindue for peak finde.I denne protokol blev LDL-indholdet af plasmafraktionen yderligere beriget med udfældning af de 30 til 40 kilodalton beta levitiner. Tilstedeværelsen af proteinbånd på 140, 80, 65, 60 og 15 kilodaltons korrelerer med apoproteiner af LDR. Behandling med triclosan hæmmer væksten af staph aureus i fedtsyrefri medium.Mens supplere kulturer med æggeblomme plasma som udefrakommende fedtsyre kilder overvinder triclosan-induceret væksthæmning. Tilsvarende tilskud af triclosan-behandlede kulturer med beriget æggeblomme LDL genskaber vækst. Yderligere, tilsætning af æggeblomme LDR understøtter væksten af en tidligere karakteriseret S.aureus fedtsyre, auxotroph.Præfedtsyreindholdet blev målt i 1% tryptone bouillon eller kylling æggeblomme LDL ved at anvende flow injektion høj opløsning nøjagtig massespektrometri. Der blev fundet minimale mængder fri fedtsyre. Ortogonale delvise mindste kvadrater discriminant analyse af rigelige staph aureus membran fosfolipider demonstreret klar klasse adskillelse, med en fedtsyre sammensætning af ubehandlet og kylling æggeblomme LDL behandlede betingelser.Berigelse af LDR fra kylling æggeblomme giver en billig kilde til komplekse fedtsyrer til at undersøge samspillet mellem bakterielle patogener og vært lipoproteiner. Chloroform og methanol, der anvendes til fremstilling af lipidekstrakter, er farlige. Sørg for at bruge disse reagenser i en kemisk røghætte og indeholder alle affaldsstrømme.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriel Inner-membran Display til screening af et bibliotek af antistof fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifikation af fedtsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fedtsyre 13C Isotopologue profilering giver indblik i trofiske Carbon overførsel og Lipid metabolisme af hvirvelløse forbrugere

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Hurtig Isolation af Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, et et-trins inkorporering af membran proteiner i Biotinylerede Peptiskiver for strømlinede protein bindende assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...