Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Hammer pour leur évaluation critique du manuscrit et leur soutien à ce travail. Dr Alex Horswill de l'Université du Colorado School of Medicine aimablement fourni AH1263. Le laboratoire du Dr Chris Waters de l'Université d'État du Michigan a fourni des réactifs. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association subvention 16SDG30170026 et les fonds de démarrage fournis par l'Université d'État du Michigan.

REMARQUE: Le protocole suivant pour l'enrichissement des particules lDL à partir du jaune d'œuf de poulet est dérivé de Moussa et al. 200233.
1. Préparation du jaune d'œuf de poulet pour l'enrichissement des particules de LDL
<ol><li>Assainissez deux gros œufs de poulet en lavant les coquilles avec une solution d'éthanol à 70 % et laissez sécher à l'air.</li>
	<li>Assainiz le séparateur d'œufs à l'aide d'une solution d'éthanol à 70 % et laissez sécher...

S. aureus intègre des acides gras exogènes dans sa membrane phospholipides27,32,43. La synthèse phospholipide utilisant des acides gras exogènes contourne l'inhibition faSII mais modifie également les propriétés biophysiques de la membrane27,32,44. Bien que l'incorporation d'acides gras exogènes dans les phospholipides ...

Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est la principale cause d'infection associée aux soins de santé et la résistance aux antibiotiques associée est un défi clinique considérable1,2,3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une grande priorité. Une stratégie de traitement prometteuse pour les pathogènes Gram-positifs inhibe la synthèse des acides gras, une exigence pour la production de phospholipide membranaire qui, dans S. aureus, comprend le phosphatidylglycérol (PG), lysyl-PG, et la cardiolipine4. Dans les bactéries, la production d'acides gras se produit par l'intermédiaire de la voie de synthèse d'acide gras II (FASII)5, qui est considérablement différente de la contrepartie eucaryotique, faisant FASII une cible attrayante pour le développement d'antibiotiques5,6 . Les inhibiteurs de FASII ciblent principalement FabI, une enzyme requise pour l'allongement de la chaîne de carbone d'acide gras7. Le triclosan inhibiteur FabI est largement utilisé dans les biens de consommation et médicaux8,9. D'autres inhibiteurs FabI sont en cours de développement par plusieurs sociétés pharmaceutiques pour le traitement de l'infection S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Cependant, beaucoup d'agents pathogènes Gram-positifs, y compris S. aureus,sont capables de récupérer les acides gras exogènes pour la synthèse phospholipide, en contournant l'inhibition FASII27,28,29. Ainsi, le potentiel clinique des inhibiteurs FASII est débattu en raison de lacunes considérables dans notre connaissance des sources d'acides gras hôtes et les mécanismes par lesquels les agents pathogènes extraient les acides gras de l'hôte27,28. Pour combler ces lacunes, nous avons développé une méthode d'analyse lipidomique impartiale pour surveiller l'incorporation d'acide gras exogène des particules de lipoprotéines dans les phospholipides membranaires de S. aureus.
Pendant la septicémie, les particules de lipoprotéines hôtes représentent une source potentielle d'acides gras dérivés de l'hôte dans la vascularisation, car la majorité des acides gras hôtes sont associés aux particules30. Les lipoprotéines se composent d'une coquille hydrophile composée de phospholipides et de protéines qui renferment un noyau hydrophobe de triglycérides et d'esters de cholestérol31. Quatre grandes classes de lipoprotéines - chylomicron, lipoprotéines de très faible densité, lipoprotéines de haute densité et lipoprotéines de faible densité (LDL) - sont produites par l'hôte et fonctionnent comme des véhicules de transport lipidiques, livrant des acides gras et du cholestérol à et à partir cellules hôtes par la vascularisation. Les LDL sont abondants en acides gras estérifiés, y compris les triglycérides et les esters de cholestérol31. Nous avons précédemment démontré que les LDL humains fortement purifiés sont une source viable d'acides gras exogènes pour la synthèse de PG, fournissant ainsi un mécanisme pour le contournement d'inhibiteur de FASII32. La purification des LDL humaines peut être techniquement difficile et prendre beaucoup de temps, tandis que les sources commerciales de LDL humains purifiés sont prohibitivement coûteuses à utiliser de façon routinière ou à effectuer des écrans bactériens à grande échelle. Pour remédier à ces limitations, nous avons modifié une procédure d'enrichissement des LDL à partir du jaune d'œuf de poulet, une riche source de particules de lipoprotéines33. Nous avons utilisé avec succès une spectrométrie de masse non ciblée et à haute résolution/précise et une spectrométrie de masse en tandem pour surveiller l'incorporation d'acides gras humains dérivés du LDL dans la membrane de S. aureus32. Contrairement aux méthodes précédemment signalées, cette approche peut quantifier les isoreurs individuels d'acides gras pour chacun des trois principaux types de phospholipides staphylococciques. L'acide oleique (18:1) est un acide gras insaturé présent dans toutes les particules de lipoprotéines hôtes qui est facilement incorporé e dans les phospholipides de S. aureus 29,30,32. S. aureus n'est pas capable de synthèse d'acide oléique29; par conséquent, la quantité d'acide oléique incorporé au phospholipide établit la présence d'acides gras diipoprotéines dans la membrane staphylococcique29. Ces espèces de phospholipides peuvent être identifiées par la méthode de spectrométrie de masse de pointe décrite ici, offrant une résolution sans précédent de la composition membranaire de S. aureus cultivé en présence d'une source d'acides gras qu'il est probable rencontres pendant l'infection.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

Staphylococcus aureus et d'autres pathogènes Gram-positifs incorporent les acides gras de l'environnement dans les phospholipides membranaires. Pendant l'infection, la majorité des acides gras exogènes sont présents dans les particules de lipoprotéines hôtes. L'incertitude demeure quant aux réservoirs d'acides gras hôtes et aux mécanismes par lesquels les bactéries extraient les acides gras des particules de lipoprotéines. Dans ce travail, nous décrivons des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéine de basse densité (LDL) du jaune d'oeuf de poulet et de déterminer si les LDL servent de réservoirs d'acide gras pour S. aureus. Cette méthode exploite l'analyse lipidomique impartiale et les LDL de poulet, un modèle efficace et économique pour l'exploration des interactions entre les LDL et les bactéries. L'analyse de l'intégration de S. aureus des acides gras exogènes des LDL est effectuée en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution/précise et la spectrométrie de masse en tandem, permettant la caractérisation de la composition en acides gras de la bactérie membrane et identification impartiale de nouvelles combinaisons d'acides gras qui surgissent dans les lipides de membrane bactérienne lors de l'exposition aux LDL. Ces techniques avancées de spectrométrie de masse offrent une perspective inégalée de l'incorporation d'acides gras en révélant les acides gras exogènes spécifiques incorporés dans les phospholipides. Les méthodes décrites ici sont adaptables à l'étude d'autres agents pathogènes bactériens et de sources alternatives d'acides gras complexes.

Le protocole d'enrichissement du LDL à partir du jaune d'œuf de poulet est illustré à la figure 1. Ce processus commence par la dilution du jaune d'œuf entier avec salin et la séparation des solides jaune d'œuf appelés granules de la fraction soluble ou plasma contenant les LDL (Figure 1)33. La teneur en LDL de la fraction plasmatique est encore enrichie par la précipitation de la 30-40 kDa -livet...

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Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Cette méthode fournit un cadre pour étudier l'incorporation des acides gras exogènes des sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier Staphylococcus aureus. Pour ce faire, des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéines du jaune d'oeuf de poulet et le profilage suivant d'acide gras des phospholipides bactériens utilisant la spectrométrie de masse sont décrits.

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Ce protocole fournit un cadre pour étudier l’incorporation d’acides gras exogènes provenant de sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier le staphylocoque aureus. Le protocole utilise une analyse lipidomique impartiale et des particules de lipoprotéine isolées des jaunes d’œufs de poulet comme source économique d’acides gras complexes pour quantifier l’incorporation d’acides gras dans les lipides bactériens. Les techniques de spectrométrie de masse décrit ici offrent une perspective inégalée du profil d’acide gras des lipides staphylococcus aureus, mais peuvent être adaptés pour étudier d’autres membranes bactériennes.Lors de l’exécution de ce protocole, il faut prendre soin que chaque étape de fractionnement pour identifier et conserver la fraction contenant du LDL. L’élimination du sulfate d’ammoniac de la fraction plasmatique est essentielle pour les applications en aval des LDL. Fournir suffisamment d’espace dans le tube et changer l’eau au besoin pour permettre une dialyse efficace.Pour commencer, lavez deux jaunes d’œufs deux fois avec 30 millilitres de saline tamponnée de phosphate stérile pour éliminer l’albumine résiduelle. Percer la membrane vitelline à l’aide d’une pointe stérile de pipette et égoutter le contenu de la membrane dans un tube stérile de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Ajouter environ 24 à 30 millilitres ou 17 solutions molaires de chlorure de sodium au pH sept au jaune d’œuf et mélanger vigoureusement.Ensuite, placez le tube sur un shaker à bascule pour mélanger à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Centrifugeuse la dilution du jaune d’œuf à 10 degrés Celsius à 10 000 fois g pendant 45 minutes. Transférer la fraction plasmatique supernatante dans un tube conique stérile de 50 millilitres, laissant derrière elle la fraction granulaire granulaire granulée.Et centrifugeuse à nouveau. Tout d’abord, mélanger la fraction plasmatique avec 40 volumes de masse pour cent de sulfate d’ammonium sur un shaker à bascule ou un dispositif similaire à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Après avoir ajusté le pH, centrifugez la fraction plasmatique à quatre degrés Celsius et 10 000 g de temps pour une durée de 45 minutes.Enlevez la fraction jaune semisolide supérieure en sept tubes de dialyse de taille pore kilodalton. Fournir un minimum de 25% d’espace supplémentaire dans le tube pour lui permettre de gonfler. Placez le tube de dialyse dans trois litres d’eau ultrapure pour dialyser pendant la nuit à trois degrés Celsius pour enlever le sulfate d’ammonium.Après dialyse, centrifugeuse la solution à quatre degrés Celsius comme décrit précédemment. Retirer délicatement la fraction jaune supérieure semi-ssolide dans un tube stérile et la conserver à quatre degrés Celsius. Après l’incubation nocturne de la culture, transférer 500 microlitres dans deux flacons stériles déconcertés de 250 millilitres contenant 49,5 millilitres de bouillon tryptone de 1 %.Incuber pendant environ quatre heures à 37 degrés Celsius avec des secousses pour atteindre la phase médiane. Transférer 100 millilitres de culture par incréments de 25 millilitres dans quatre tubes stériles de centrifugeuse de 50 millilitres et centrifuger les quatre tubes à 10 000 fois g pour pelleter les cellules. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau chaque granulé cellulaire dans 750 microlitres de bouillon tryptone de 1 %.Combinez les quatre suspensions cellulaires de 750 microlitres en un seul tube de 15 millilitres. Et aliquot 350 microlitres de la suspension cellulaire en six tubes stériles centrifugeuse de 1,5 millilitre. Utilisez une pipette pour ajouter 30 microlitres de LDLs dans le tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre pour atteindre une concentration finale désirée de 5% et incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses pendant quatre heures.Centrifuger les cultures à 4 degrés Celsius à 16 000 fois g pour une durée de deux minutes. Et re-suspendre les granulés cellulaires dans 330 microlitres de stériles phosphate tamponné saline à laver. Répétez ce lavage une fois de plus.Enregistrez le poids des six granulés de cellules humides en soustrayant le poids du tube vide. Casser congeler les granulés cellulaires sur la glace sèche. Ajoutez d’abord une boule de perles d’oxyde de zirconium de 5 millimètres sur chaque granule cellulaire.Ajouter 740 microlitres de méthanol de qualité HPLC à moins 80 degrés Celsius directement dans chaque tube. Ajoutez ensuite deux microlitres de 50 dimyristoyl phosphatidylcholine micromolar comme norme interne. Placez l’échantillon contenant des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre dans un port disponible sur un homogénéiseur de tissu de mélangeur de balles.Homogénéiser les échantillons à basse vitesse. Réglage de deux à trois pendant trois minutes. Inspectez visuellement les échantillons pour détecter l’homogénéité.Si des amas de cellules sont visibles, continuez l’homogénéisation dans le mélangeur de balles par incréments de deux minutes. Ajouter ensuite 270 microlitres de chloroforme à chaque échantillon dans un capot de fumée chimique. Vortex les échantillons vigoureusement pendant 30 minutes.Centrifugez les échantillons dans une centrifugeuse sur banc jusqu’à 30 minutes au moins 2000 fois g. Dans le capot chimique des vapeurs, recueillir le supernatant monophasique et le transférer dans un nouveau tube à essai tout en évitant soigneusement la pastille protéique au fond du tube d’extraction. Transférez les extraits de lipides dilués préalablement préparés à un flacon d’autosampler approprié.Pour l’analyse basée sur l’injection de flux, placez les flacons d’autosampler dans un autosampler à température contrôlée d’un système HPLC capable d’applications de flux capillaires. Configurer le système HPLC selon le manuscrit. L’élixent est introduit de la ligne de transfert HPLC au spectromètre de masse par une source d’ionisation électrospray équipée d’une aiguille métallique de calibre 34 à faible débit.Dans le logiciel de commande d’instruments Thermo Tune Plus, réglez la tension d’ionisation à 4000 volts et le gaz de gaine à cinq. De même, réglez la température capillaire à 150 degrés Celsius et l’objectif S à 50%Cliquez sur le bouton d’analyse définir, et dans le menu analyseur, sélectionnez FTMS. Réglez le champ de plage de masse à la normale et dans le champ de résolution, sélectionnez 100 000.Assurez-vous que le type d’analyse est réglé à plein. Sous le menu des plages de balayage, entrez 200 dans le premier champ de masse et entrez 2000 dans le dernier champ de masse. Après avoir défini davantage la précision de masse observée, faire la moyenne du signal à travers le large pic dans le chromatogramme ion total.Cliquez à droite sur l’icône thumbtack dans la fenêtre de visualisation du spectre de masse et sélectionnez la liste du spectre de vue. À partir du même menu, sélectionnez les options d’affichage, puis tous les pics basculent la boîte dans le menu d’affichage. Cliquez sur le bouton correct pour fermer la fenêtre de visualisation.Cliquez à droite sur l’icône thumbtack dans la fenêtre de visualisation du spectre de masse à nouveau et sélectionnez la masse exacte du presse-papiers d’exportation. Coller la cellule de données exportée A1 de la première feuille de travail dans la nouvelle feuille de calcul Excel et procéder selon le manuscrit. Pour effectuer des identifications lipidiques précises à base de masse, ouvrez le logiciel LIMSA.À partir du menu principal, sélectionnez la liste de pointe sous le menu de type spectre. Sélectionnez le mode positif ou le mode négatif pour correspondre à la polarité dans laquelle les données de spectrométrie de masse ont été acquises. Dans la largeur maximale à moitié maximale et au-dessus de la fenêtre z, entrez dans la fenêtre de recherche de masse désirée pour trouver le pic.Dans ce protocole, la teneur en LDL de la fraction plasmatique a été encore enrichie par la précipitation des lévitines bêta de 30 à 40 kilodaltons. La présence de bandes protéiques à 140, 80, 65, 60 et 15 kilodaltons est corrélée avec les apoprotéines des LDL. Le traitement par triclosan inhibe la croissance de l’aureus staphylocoque dans un milieu sans acides gras.Tout en complétant des cultures avec le plasma de jaune d’oeuf comme sources exogènes d’acide gras surmonte l’inhibition de croissance triclosan-induite. De même, la supplémentation des cultures triclosan-traitées avec le jaune d’oeuf enrichi LDL restaure la croissance. En outre, l’ajout de LDLs jaune d’œuf soutient la croissance d’un acide gras S.aureus précédemment caractérisé, auxotroph.La teneur en acides pré-gras a été mesurée dans le bouillon de tryptone de 1% ou le jaune d’oeuf de poulet LDL en employant l’injection de flux spectrométrie précise de masse de haute résolution. Des quantités minimales d’acide gras libre ont été trouvées. L’analyse orthogonale partielle la moins discriminante des phospholipides abondants de membrane d’aureus de staphylocoque a démontré la séparation claire de classe, avec une composition d’acide gras des conditions non traitées et de jaune d’oeuf de poulet LDL traitées.L’enrichissement des LDL à partir du jaune d’œuf de poulet fournit une source peu coûteuse d’acides gras complexes pour étudier les interactions entre les pathogènes bactériens et les lipoprotéines hôtes. Le chloroforme et le méthanol utilisés dans la préparation des extraits lipidiques sont dangereux. S’il vous plaît assurez-vous d’utiliser ces reagents dans un capot de fumée chimique et de contenir tous les flux de déchets.

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