Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
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हम पांडुलिपि और इस काम के समर्थन के अपने महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए हैमर प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. कोलोराडो स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ एलेक्स Horswill कृपया AH1263 प्रदान की है। मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में डॉ क्रिस वाटर्स प्रयोगशाला अभिकर्मकों प्रदान की. यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 16SDG30170026 और शुरू हुआ धन मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान द्वारा समर्थित किया गया था.

नोट: चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल कणों के संवर्धन के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल Moussa एट अल से ली गई है 200233.
1. एलडीएल कणों के संवर्धन के लिए चिकन अंडे की जर्दी की तैयारी
<ol><li>70% इथेनॉल समाधान क?...

एस ऑरियस ने एक्सोजेनस फैटी एसिड को अपनी झिल्ली फॉस्फोलिपिड27,32,43में समाविष्ट किया है . बाह्य जात वसा अम्लों का प्रयोग करके फॉस्फोलिपिड संश्लेषण एफएएसआई अवरोध को न?...

मेथिसिलिन-प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) स्वास्थ्य देखभाल से जुड़े संक्रमण का प्रमुख कारण है और संबद्ध एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक काफी नैदानिक चुनौती1,2,3है। इसलिए, उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का विकास एक उच्च प्राथमिकता है. ग्राम सकारात्मक रोगजनकों के लिए एक आशाजनक उपचार रणनीति फैटी एसिड संश्लेषण को बाधित कर रही है, झिल्ली फॉस्फोलिपिड उत्पादन के लिए एक आवश्यकता है कि, एस ऑरियसमें, फॉस्फेटtidylglycerol (पीजी), lysyl-पीजी, और cardilipin4शामिल हैं। बैक्टीरिया में, फैटी एसिड उत्पादन फैटी एसिड संश्लेषण द्वितीय मार्ग (FASII)5के माध्यम से होता है, जो यूकैरियोटिक समकक्ष से काफी अलग है, जिससे FASII एंटीबायोटिक विकास के लिए एक आकर्षक लक्ष्य5,6 . FASII अवरोधक मुख्य रूप से लक्ष्य फैबी, फैटी एसिड कार्बन श्रृंखला दीर्घीकरण7के लिए आवश्यक एक एंजाइम. फेबी अवरोधक ट्राइक्लोसन का प्रयोग मोटे तौर पर उपभोक्ता और चिकित्सा वस्तुओं8,9 में किया जाताहै. एस ऑरियस संक्रमण10,11,12,13,14 के उपचार के लिए कई दवा कंपनियों द्वारा अतिरिक्त फैबी अवरोधक विकसित किए जा रहे हैं ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. हालांकि, कई ग्राम सकारात्मक रोगजनकों, एस ऑरियससहित, फास्फोलिपिड संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड की सफाई करने में सक्षम हैं, FASII निषेध को दरकिनार27,28,29. इस प्रकार, एफएएसआईआई अवरोधकों की नैदानिक क्षमता पर मेजबान फैटी एसिड के स्रोतों और तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान में काफी कमियों के कारण बहस होती है जिसके द्वारा रोगजनक मेजबान27,28से फैटी एसिड निकालते हैं। इन कमियों को दूर करने के लिए, हमने एस ऑरियसकी झिल्ली फॉस्फोलिपिड में लिपोप्रोटीन कणों से बहिर्जात फैटी एसिड को शामिल करने की निगरानी करने के लिए एक निष्पक्ष लिपिडोमिक विश्लेषण विधि विकसित की है।
सेप्सिस के दौरान, मेजबान लिपोप्रोटीन कण वास्कुलेचर के भीतर मेजबान व्युत्पन्न फैटी एसिड के एक संभावित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि मेजबान फैटी एसिड के बहुमत कणों के साथ जुड़े हुए हैं30। लाइपोप्रोटीन में फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन से बना हाइड्रोफिलिक खोल होता है जो ट्राइग्लिसराइड्स और कोलेस्ट्रॉल एस्टर31के हाइड्रोफोबिक कोर को संलग्न करता है . लिपोप्रोटीन के चार प्रमुख वर्गों---chylomicron, बहुत कम घनत्व लिपोप्रोटीन, उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन, और कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) लिपिड परिवहन वाहनों के रूप में मेजबान और समारोह द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल देने के लिए और से वाहिकाविन्यास के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं. एलडीएल ट्राइग्लिसराइड्स और कोलेस्ट्रॉल एस्टर31सहित एस्टर्वेड फैटी एसिड में प्रचुर मात्रा में हैं। हम पहले से पता चला है कि अत्यधिक शुद्ध मानव LDLs पीजी संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड का एक व्यवहार्य स्रोत हैं, इस प्रकार FASII अवरोध करनेवाला बाईपास32के लिए एक तंत्र प्रदान . मानव एलडीएल को शुद्ध करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लगता है, जबकि शुद्ध मानव एलडीएल के वाणिज्यिक स्रोत नियमित आधार पर उपयोग करने के लिए या बड़े पैमाने पर जीवाणु स्क्रीन करने के लिए निषिद्ध रूप से महंगे हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम चिकन अंडे की जर्दी, लिपोप्रोटीन कणों का एक समृद्ध स्रोत33से एलडीएल के संवर्धन के लिए एक प्रक्रिया को संशोधित किया है। हम सफलतापूर्वक untargeted, उच्च संकल्प / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का इस्तेमाल किया है एस aureus32की झिल्ली में मानव एलडीएल व्युत्पन्न फैटी एसिड के निगमन पर नजर रखने के लिए. पहले की सूचना दी तरीकों के विपरीत, इस दृष्टिकोण तीन प्रमुख staphylococcal फॉस्फोलिपिड प्रकार में से प्रत्येक के लिए व्यक्तिगत फैटी एसिड आइसोमर्स मात्रा में कर सकते हैं. Oleic एसिड (18:1) सभी मेजबान लिपोप्रोटीन कणों के भीतर मौजूद एक असंतृप्त फैटी एसिड है कि आसानी से एस ऑरियस फॉस्फोलिपिड29,30,32में शामिल किया जाता है . एस ऑरियस ओलिक एसिड संश्लेषण29में सक्षम नहीं है; इसलिए, फॉस्फोलिपिड-इन्कॉर्पोरेट्ड ओलिक एसिड की मात्रा स्टैफिलोकोकल झिल्ली29के भीतर मेजबान लिपोप्रोटीन व्युत्पन्न फैटी एसिड की उपस्थिति स्थापित करती है। इन फॉस्फोलिपिड प्रजातियों की पहचान यहां वर्णित अत्याधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि द्वारा की जा सकती है, जिसमें एक फैटी एसिड स्रोत की उपस्थिति में एस ऑरियस की झिल्ली संरचना के अभूतपूर्व संकल्प की पेशकश की गई है। संक्रमण के दौरान मुठभेड़ों.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

स्टैफिलोकोकस ऑरियस और अन्य ग्राम-पॉजिटिव रोगजनकों में पर्यावरण से फैटी एसिड को झिल्ली फॉस्फोलिपिड में शामिल किया जाता है। संक्रमण के दौरान, अधिकांश exogenous फैटी एसिड मेजबान लिपोप्रोटीन कणों के भीतर मौजूद हैं। अनिश्चितता मेजबान फैटी एसिड के जलाशयों और तंत्र जिसके द्वारा बैक्टीरिया लिपोप्रोटीन कणों से फैटी एसिड निकालने के रूप में रहता है। इस काम में, हम चिकन अंडे की जर्दी से कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) कणों के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन और निर्धारित है कि क्या एलडीएल एस ऑरियसके लिए फैटी एसिड जलाशयों के रूप में सेवा करते हैं। इस विधि निष्पक्ष lipidomic विश्लेषण और चिकन LDLs, LDLs और बैक्टीरिया के बीच बातचीत की खोज के लिए एक प्रभावी और किफायती मॉडल का शोषण. एलडीएल से Exogenous फैटी एसिड के एस aureus एकीकरण का विश्लेषण उच्च संकल्प / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर के लिए किया जाता है, जीवाणु की फैटी एसिड संरचना की विशेषता को सक्षम करने एलडीएल के संपर्क में आने पर जीवाणु झिल्ली लिपिड में उत्पन्न होने वाले फैटी एसिड के उपन्यास संयोजनों की झिल्ली और निष्पक्ष पहचान। इन उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक फॉस्फोलिपिड में शामिल विशिष्ट exogenous फैटी एसिड खुलासा करके फैटी एसिड निगमन की एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं. यहाँ उल्लिखित तरीके अन्य जीवाणु रोगजनकों और जटिल फैटी एसिड के वैकल्पिक स्रोतों के अध्ययन के लिए अनुकूलनीय हैं।

चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल चित्र 1में दिखाया गया है। यह प्रक्रिया पूरे अंडे की जर्दी को लवणके साथ कम करके और अंडे की जर्दी ठोसों को अलग करके शुरू होत...

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Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

जीवाणु रोगजनक फैटी एसिड समावेश के अध्ययन के लिए चिकन अंडे Yolk से लाइपोप्रोटीन कणों का अलगाव झिल्ली Phospholipids में शामिल

इस विधि में जटिल मेजबान स्रोतों से बाह्य जात फैटी एसिड को जीवाणु झिल्ली, विशेष रूप से स्टेफिलोकोकस ऑरियसमें शामिल करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, चिकन अंडे की जर्दी से लिपोप्रोटीन कणों के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने वाले बैक्टीरियल फॉस्फोलिपिड के बाद फैटी एसिड प्रोफाइलिंग का वर्णन किया गया है।

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

एंटीबॉडी टुकड़े की एक लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के लिए बैक्टीरियल इनर-झिल्ली प्रदर्शन

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

में फैटी एसिड की पहचान<em&gt; बेसिलस cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

फैटी एसिड 13सी Isotopologue profiling Invertebrate उपभोक्ताओं के पौष्टिकता कार्बन हस्तांतरण और लिपिड चयापचय में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK कोशिकाओं से Mitoribosome का तेजी से अलगाव

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

MicroRNA के साथ देशी Lipoprotein कणों का संवर्धन और उनके निरपेक्ष के बाद दृढ़ संकल्प/

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, एक एक कदम झिल्ली प्रोटीन का शामिल Biotinylated Peptidiscs के लिए सुव्यवस्थित प्रोटीन बंधन परख के लिए

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

पूर्वनिर्मित नैनोडिस्क में मेम्ब्रेन प्रोटीन का सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...