Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
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Ringraziamo i membri del laboratorio Hammer per la loro valutazione critica del manoscritto e il sostegno di questo lavoro. Il Dr. Alex Horswill della University of Colorado School of Medicine gentilmente fornito AH1263. Il laboratorio Dr. Chris Waters della Michigan State University ha fornito reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 16SDG30170026 dell'American Heart Association e dai fondi di start-up forniti dalla Michigan State University.

NOTA: Il seguente protocollo per l'arricchimento delle particelle LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è derivato da Moussa et al. 200233.
1. Preparazione del tuorlo d'uovo di gallina per l'arricchimento delle particelle LDL
<ol><li>Sanitizzare due grandi uova di gallina lavando le conchiglie con soluzione di etanolo del 70% e lasciare asciugare all'aria.</li>
	<li>Sanificare il separatore delle uova utilizzando una soluzione di etanolo 70% e lasciare asciugare all'aria....

S. aureus incorpora acidi grassi esogeni nei suoi fosfolipidi di membrana27,32,43. La sintesi fosforalipidea utilizzando acidi grassi esogeni bypassa l'inibizione fasiLi ma altera anche le proprietà biofisiche della membrana27,32,44. Mentre l'incorporazione di acidi grassi esogeni nei fosfolipidi di patogeni Gram-positivi è b...

S. aureus resistente alla meticolina (MRSA) è la causa principale dell'infezione associata all'assistenza sanitaria e la resistenza agli antibiotici associata è una sfida clinica considerevole1,2,3. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche è una priorità assoluta. Una promettente strategia di trattamento per gli agenti patogeni Gram-positivi sta inibendo la sintesi degli acidi grassi, un requisito per la produzione di fosforidi di membrana che, in S. aureus, include fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina4. Nei batteri, la produzione di acidi grassi avviene attraverso la via di sintesi degli acidi grassi II (FASII)5, che è notevolmente diversa dalla controparte eucatriste, rendendoI un obiettivo attraente per lo sviluppo antibiotico5,6 . Gli inibitori del FASII si rivolgono principalmente a FabI, un enzima necessario per l'allungamento della catena del carbonio dell'acido grasso7. L'inibitore FabI triclosan è ampiamente utilizzato nei beni di consumo e medici8,9. Ulteriori inibitori FabI sono in fase di sviluppo da diverse aziende farmaceutiche per il trattamento di S. aureus infezione10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Tuttavia, molti patogeni Gram-positivi, tra cui S. aureus, sono in grado di raccogliere acidi grassi esogeni per la sintesi fosforolipidi, bypassando l'inibizione del FASII27,28,29. Così, il potenziale clinico degli inibitori del FASII è discusso a causa di notevoli lacune nella nostra conoscenza delle fonti di acidi grassi ospiti e dei meccanismi con cui gli agenti patogeni estraggono gli acidi grassi dall'ospite27,28. Per colmare queste lacune, abbiamo sviluppato un metodo di analisi lipidomica imparziale per monitorare l'incorporazione di acido grasso esogeno dalle particelle di lipoproteina in fosfolipidi della membrana di S. aureus.
Durante la sepsi, le particelle di lipoproteina ospite rappresentano una potenziale fonte di acidi grassi derivati dall'ospite all'interno della vascolatura, poiché la maggior parte degli acidi grassi ospiti sono associati alle particelle30. Le lipoproteine sono costituite da un guscio idrofilo composto da fosfolipidi e proteine che racchiudono un nucleo idrofobico di trigliceridi e esteri di colesterolo31. Quattro classi principali di lipoproteine - chylomicron, lipoproteina a bassissima densità, lipoproteina ad alta densità e lipoproteina a bassa densità (LDL) - sono prodotte dall'ospite e funzionano come veicoli di trasporto lipidico, fornendo acidi grassi e colesterolo da e verso cellule ospiti attraverso la vascolatura. I LDL sono abbondanti in acidi grassi esterificati tra cui trigliceridi e tende di colesterolo31 . Abbiamo già dimostrato che gli LDL umani altamente purificati sono una fonte vitale di acidi grassi esogeni per la sintesi di PG, fornendo così un meccanismo per il bypass dell'inibitore di FASII32. Purificanti LDL umani può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, mentre le fonti commerciali di LDL umani purificati sono proibitivi da utilizzare su base di routine o per eseguire schermi batterici su larga scala. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo modificato una procedura per l'arricchimento dei LDL dal tuorlo d'uovo di gallina, una ricca fonte di particelle di lipoproteina33. Abbiamo utilizzato con successo spettrometria di massa ad alta risoluzione, ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem per monitorare l'incorporazione di acidi grassi derivati da LDL umani nella membrana di S. aureus32. A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio può quantificare i singoli isomeri di acidi grassi per ciascuno dei tre principali tipi di fosfolipidi stafilocchidi. L'acido oleico (18:1) è un acido grasso insaturi presente all'interno di tutte le particelle di lipoproteina ospite che è prontamente incorporato nei fosfolipidi S. aureus 29,30,32. S. aureus non è in grado di sintesi di acido oleico29; pertanto, la quantità di acido oleico incorporato al fosfolipidi desta la presenza di acidi grassi di origine lipoproteina ospite all'interno della membrana stafilocca29. Queste specie di fosfolipidi possono essere identificate con il metodo di spettrometria di massa all'avanguardia descritto qui, offrendo una risoluzione senza precedenti della composizione della membrana di S. aureus coltivata in presenza di una fonte di acido grasso che probabilmente durante l'infezione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

Lo stafilococco aureus e altri patogeni positivi al Gram incorporano acidi grassi dall'ambiente nei fosfolipidi della membrana. Durante l'infezione, la maggior parte degli acidi grassi esogeni sono presenti all'interno delle particelle di lipoproteina dell'ospite. Permangono incertezze per quanto riguarda i serbatoi di acidi grassi ospiti e i meccanismi con cui i batteri estraggono gli acidi grassi dalle particelle di lipoproteina. In questo lavoro, descriviamo protocolli per l'arricchimento di particelle di lipoproteina a bassa densità (LDL) dal tuorlo d'uovo di gallina e determinando se i LDL fungono da serbatoi di acido grasso per S. aureus. Questo metodo sfrutta l'analisi lipidomica imparziale e gli LDL di pollo, un modello efficace ed economico per l'esplorazione delle interazioni tra LL e batteri. L'analisi dell'integrazione di S. aureus degli acidi grassi esogeni da LDL viene eseguita utilizzando spettrometria di massa ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem, consentendo la caratterizzazione della composizione dell'acido grasso del batterio identificazione imparziale e di nuove combinazioni di acidi grassi che sorgono nei lipidi della membrana batterica dopo l'esposizione a l'LDL. Queste tecniche avanzate di spettrometria di massa offrono una prospettiva senza precedenti di incorporazione di acidi grassi rivelando gli acidi grassi esogeni specifici incorporati nei fosforidi. I metodi qui descritti sono adattabili allo studio di altri patogeni batterici e fonti alternative di acidi grassi complessi.

Il protocollo per l'arricchimento di LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è illustrato nella figura 1. Questo processo inizia diluindo il tuorlo d'uovo intero con la salina e separando i solidi del tuorlo d'uovo indicati come granuli dalla frazione solubile o plasma contenente i LDL (Figura 1)33. Il contenuto di LDL della frazione plasmatica è ulteriormente arricchito dalla precipitazione del kDa 30-40 dolla...

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Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Questo metodo fornisce un quadro per studiare l'incorporazione di acidi grassi esogeni da sorgenti ospiti complesse in membrane batteriche, in particolare Staphylococcus aureus. Per raggiungere questo obiettivo, vengono descritti i protocolli per l'arricchimento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uova di gallina e la successiva profilazione dell'acido grasso di fosfatidi batterici che utilizzano la spettrometria di massa.

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Questo protocollo fornisce un quadro per lo studio dell'incorporazione di acidi grassi esogeni da fonti ospiti complesse nelle membrane batteriche, in particolare lo stafilococco aureo. Il protocollo utilizza l'analisi lipidomica imparziale e le particelle di lipoproteina isolate dai tuorli d'uovo di gallina come fonte economica di acidi grassi complessi per quantificare l'incorporazione di acidi grassi nei lipidi batterici. Le tecniche di spettrometria di massa descritte qui offrono una prospettiva impareggiabile del profilo degli acidi grassi dei lipidi stafilococco aureo, ma possono essere adattate per studiare altre membrane batteriche.Quando si esegue questo protocollo, si deve fare attenzione che ogni fase di frazionamento identifichi e mantenga la frazione contenente LDL. La rimozione del solfato di ammoniaca dalla frazione plasmatica è fondamentale per le applicazioni a valle degli LDL. Fornire ampio spazio nei tubi e cambiare l'acqua in base alle esigenze per consentire un'efficace dialisi.Per iniziare, lavare due tuorli d'uovo due volte con 30 millilitri di soluzione salina tamponata di fosfato sterile per rimuovere l'albumina residua. Forare la membrana vitellina con una punta sterile di pipetta e drenare il contenuto della membrana in un tubo di centrifuga conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere circa 24-30 millilitri o 17 soluzione di cloruro di sodio molare a pH sette al tuorlo d'uovo e mescolare vigorosamente.Quindi posizionare il tubo su uno shaker a dondolo per mescolare a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Centrifuga la diluizione del tuorlo d'uovo a 10 gradi Celsius a 10.000 volte g per 45 minuti. Trasferire la frazione plasmatica supernatante in un tubo conico sterile da 50 millilitri, lasciandosi alle spalle la frazione granulare pelletata.E centrifuga di nuovo. In primo luogo, mescolare la frazione plasmatica con 40 percento di solfato di ammonio in volume di massa su uno shaker a dondolo o un dispositivo simile a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Dopo aver regolato il pH, centrifugare la frazione plasmatica a quattro gradi Celsius e 10.000 g di tempo per una durata di 45 minuti.Rimuovere la frazione gialla semisolida superiore in tubi di dialisi di dimensioni dei pori di sette kilodalton. Fornire un minimo del 25% di spazio extra nel tubo per consentire il suo rigonfiamento. Posizionare i tubi di dialisi in tre litri di acqua ultrapura per dializzare durante la notte a tre gradi Celsius per rimuovere il solfato di ammonio.Dopo la dialisi, centrifugare la soluzione a quattro gradi Celsius come descritto in precedenza. Rimuovere con cura la frazione gialla superiore semisolida in un tubo sterile e conservare a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna della coltura, trasferire 500 microlitri in due contenitori sterili sconcertati da 250 millilitri contenenti 49,5 millilitri di brodo di tripptone all'1%.Incubare per circa quattro ore a 37 gradi Celsius con tremori per raggiungere la fase medio-lunga. Trasferire 100 millilitri di coltura in incrementi di 25 millilitri a quattro tubi sterili di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare i quattro tubi a 10.000 volte g per pellettare le cellule. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo ogni pellet cellulare in 750 microlitri di brodo di tripptone all'1%.Unire le quattro sospensioni a celle a 750 microlitri in un unico tubo da 15 millilitri. E aliquote 350 microlitri della sospensione cellulare in sei tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri. Utilizzare una pipetta per aggiungere 30 microlitri di LDL nel tubo di centrifuga da 1,5 millilitri per ottenere una concentrazione finale desiderata del 5% E incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento per quattro ore.Centrifugare le colture a quattro gradi Celsius a 16.000 volte g per una durata di due minuti. E sospendere di nuovo i pellet cellulari in 330 microlitri di soluzione salina sterile tamponata da fosfati da lavare. Ripeti questo lavaggio ancora una volta.Registrare il peso dei sei pellet di cellule bagnate sottraendo il peso del tubo vuoto. Snap congelare i pellet cellulari sul ghiaccio secco. Per prima cosa aggiungi una pallina di perline di ossido di zirconio da 5 millimetri sopra ogni pellet cellulare.Aggiungere 740 microlitri di metanolo di grado HPLC 75% refrigerato a meno 80 gradi Celsius direttamente in ogni tubo. Quindi aggiungere due microlitri di 50 micromolare dimiristoil fosfatidilcolina come standard interno. Posizionare il campione contenente tubi di centrifuga da 1,5 millilitri in una porta disponibile su un omogeneizzatore di tessuto del frullatore di proiettili.Omogeneizzare i campioni a bassa velocità. Impostare da due a tre per tre minuti. Ispezionare visivamente i campioni per l'omogeneità.Se sono visibili grumi di celle, continuare l'omogeneizzazione nel frullatore di punti elenco con incrementi di due minuti. Aggiungere quindi 270 microlitri di cloroformio a ciascun campione in una cappa chimica. Vortice vigorosamente i campioni per 30 minuti.Centrifugare i campioni in una centrifuga da banco per un massimo di 30 minuti ad un minimo di 2.000 volte g. Nella cappa aspirante chimica, raccogliere il supernatante monofasico e trasferirlo in una nuova provetta evitando accuratamente il pellet proteico nella parte inferiore del tubo di estrazione. Trasferire gli estratti lipidici diluiti precedentemente preparati su un apposito flaconcino autocampionatore.Per l'analisi basata sull'iniezione di flusso, posizionare i flaconcini dell'autocampionatore in un autocampionatore a temperatura controllata di un sistema HPLC in grado di applicazioni di flusso capillare. Impostare il sistema HPLC in base al manoscritto. L'eluente viene introdotto dalla linea di trasferimento HPLC allo spettrometro di massa attraverso una sorgente di ionizzazione elettrospray dotata di un ago metallico a basso flusso calibro 34.Nel software di controllo dello strumento Thermo Tune Plus, impostare la tensione di ionizzazione su 4.000 volt e gas di sheath su cinque. Analogamente, impostare la temperatura capillare su 150 gradi Celsius e l'obiettivo S sul 50%Fare clic sul pulsante definisci scansione e nel menu dell'analizzatore selezionare FTMS. Impostare il campo intervallo di massa su normale e nel campo risoluzione selezionare 100.000.Verificare che il tipo di analisi sia impostato su completo. Nel menu intervalli di scansione immettere 200 nel primo campo di massa e immettere 2.000 nell'ultimo campo di massa. Dopo aver definito ulteriormente la precisione di massa osservata, media il segnale attraverso il picco ampio nel cromatogramma ionici totale.Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della levetta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare l'elenco dello spettro di visualizzazione. Dallo stesso menu, selezionate le opzioni di visualizzazione e quindi tutti i picchi attivano l'interruttore nel menu di visualizzazione. Fare clic sul pulsante ok per chiudere la finestra di visualizzazione.Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della levetta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare la massa esatta degli Appunti di esportazione. Incollare la cella di dati esportata A1 del primo foglio di lavoro nel nuovo foglio di calcolo di Excel e procedere in base al manoscritto. Per eseguire accurate identificazioni lipidiche basate sulla massa, aprire il software LIMSA.Dal menu principale, selezionare l'elenco dei picchi nel menu del tipo di spettro. Selezionare la modalità positiva o la modalità negativa per corrispondere alla polarità in cui sono stati acquisiti i dati della spettrometria di massa. Nella larghezza completa del picco a metà massima e sopra la finestra z, immettere la finestra di ricerca di massa desiderata per la ricerca del picco.In questo protocollo, il contenuto di LDL della frazione plasmatica è stato ulteriormente arricchito dalla precipitazione delle levitine beta da 30 a 40 kilodalton. La presenza di bande proteiche a 140, 80, 65, 60 e 15 kilodaltoni è correlata con le apoproteine dei LDLs. Il trattamento con triclosan inibisce la crescita dell'aureo dello stafiloco nel mezzo privo di acidi grassi.Mentre l'integrazione delle colture con plasma di tuorlo d'uovo come fonti di acidi grassi esogeni supera l'inibizione della crescita indotta da triclosan. Allo stesso modo, l'integrazione di colture trattate con triclosan con tuorlo d'uovo arricchito LDL ripristina la crescita. Inoltre, l'aggiunta di LDL al tuorlo d'uovo supporta la crescita di un acido grasso S.aureus precedentemente caratterizzato, auxotroph.Il contenuto di acidi grassi pre-grassi è stato misurato in brodo di tripptone all'1% o tuorlo d'uovo di gallina LDL utilizzando una spettrometria di massa accurata ad alta risoluzione ad iniezione di flusso. Sono state trovate quantità minime di acido grasso libero. L'analisi discriminante dei meno quadrati parziali ortogonali di abbondanti fosfolipidi della membrana stafa aurea ha dimostrato una chiara separazione di classe, con una composizione di acidi grassi di condizioni non trattate e trattate con tuorlo d'uovo di gallina LDL.L'arricchimento degli LDL dal tuorlo d'uovo di gallina fornisce una fonte economica di acidi grassi complessi per studiare le interazioni tra agenti patogeni batterici e lipoproteine ospiti. Il cloroformio e il metanolo utilizzati nella preparazione degli estratti lipidici sono pericolosi. Assicurarsi di utilizzare questi reagenti in una cappa aspirante chimica e contenere tutti i flussi di rifiuti.

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