Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

私たちは、この作品の原稿とサポートの彼らの批判的な評価のためにハンマー研究室のメンバーに感謝します。コロラド大学医学部のアレックス・ホースウィル博士はAH1263を親切に提供しました。ミシガン州立大学のクリス・ウォーターズ博士の研究室は試薬を提供しました。この研究は、アメリカ心臓協会の助成金16SDG30170026とミシガン州立大学が提供するスタートアップ資金によって支援されました。

注:鶏卵黄からのLDL粒子の濃縮のための以下のプロトコルは、Moussaら200233に由来する。
1. LDL粒子濃縮用鶏卵黄の調製
<ol><li>70%のエタノール溶液で殻を洗って2つの大きな鶏卵を消毒し、空気乾燥を可能にします。</li>
	<li>70%のエタノール溶液を使用して卵分離器を消毒し、空気乾燥を可能にします。中型ビーカーの唇に卵セパレータを取り付けます。</li>...

S.アウレウスは、その膜リン脂質27、32、43に外因性脂肪酸を組み込む。外因性脂肪酸を用いるリン脂質合成は、FASII阻害をバイパスするが、膜27、32、44の生体物理学的特性も変化する。グラム陽性病原体のリン脂質への外因性脂肪酸の取り込みは?...

メチシリン耐性S.アウレウス(MRSA)は、ヘルスケア関連感染の主な原因であり、関連する抗生物質耐性はかなりの臨床的課題である1、2、3である。したがって、新規治療戦略の開発は最優先事項である。グラム陽性病原体の有望な治療戦略は、脂肪酸合成を阻害しており、S.アウレウスにおいて、ホスファチジルグリセロール(PG)、リシル-PG、およびカージリピン4を含むリン脂質産生の要件である。細菌では、脂肪酸合成II経路(FASII)5を介して脂肪酸産生が起こり、真核生物とはかなり異なり、FASIIは抗生物質開発の魅力的な標的となる5,6.FASII阻害剤は、主にFabIを標的とし、脂肪酸炭素鎖伸びに必要な酵素7.FabI阻害剤トリクロサンは、広く消費財や医療用品8、9で使用されています。追加のFabI阻害剤は、S.アウレウス感染症10、11、12、13、14の治療のためにいくつかの製薬会社によって開発されています ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.しかしながら、S.aureusを含む多くのグラム陽性病原体は、リン脂質合成のための外因性脂肪酸を清掃し、FASII阻害27、28、29をバイパスすることができる。したがって、FASII阻害剤の臨床的可能性は、宿主脂肪酸の供給源と病原体が宿主27、28から脂肪酸を抽出するメカニズムに関する我々の知識のかなりのギャップのために議論される。これらのギャップに対処するために、リポタンパク質粒子からS.aureusの膜リン脂質への外因性脂肪酸の取り込みを監視する偏りのないリピドミック分析法を開発した。
敗血症の間、宿主リポタンパク質粒子は血管内の宿主由来脂肪酸の潜在的な供給源を表し、宿主脂肪酸の大部分は粒子30に関連している。リポタンパク質は、リン脂質およびタンパク質からなる親水性シェルからなるもので、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31の疎水性コアを囲む。シロミクロン、非常に密度の高いリポタンパク質、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質(LDL)の4つの主要なクラスは、ホストによって生成され、脂質輸送手段として機能し、脂肪酸とコレステロールを送達します。血管系を介して細胞をホストします。LLLは、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31を含むエステル化脂肪酸に豊富である。我々は、高度に精製されたヒトLLLがPG合成のための外因性脂肪酸の生存可能な供給源であることを以前に実証し、したがってFASII阻害剤バイパス32のメカニズムを提供する。精製ヒトLLLの浄化は技術的に困難で時間がかかる一方で、精製されたヒトLLLの商業的供給源は日常的に使用したり、大規模な細菌スクリーンを実行するために非常に高価です。これらの制限に対処するために、我々は、リポタンパク質粒子33の豊富な供給源である鶏卵黄からのLLLの濃縮のための手順を修正した。我々は、S.aureus32の膜へのヒトLDL由来脂肪酸の取り込みを監視するために、標的とされていない、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を使用することに成功しました。以前に報告された方法とは異なり、このアプローチは、3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプのそれぞれについて個々の脂肪酸異性体を定量することができる。オレイン酸(18:1)は、S.アウレウスリン脂質29、30、32に容易に組み込まれるすべての宿主リポタンパク質粒子内に存在する不飽和脂肪酸である。S.アウレウスはオレイン酸合成29ができない。従って、リン脂質組み込みオレイン酸の量は、ブドウ球菌膜29内の宿主リポタンパク質由来脂肪酸の存在を確立する。これらのリン脂質種は、ここで説明する最先端の質量分析法によって同定することができ、脂肪酸源の存在下で培養されたS.aureusの膜組成の前例のない分解能を提供する可能性が高い感染中に遭遇する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

黄色ブドウ球菌および他のグラム陽性病原体は、環境からの脂肪酸を膜リン脂質に組み込む。感染中、外因性脂肪酸の大部分は宿主リポタンパク質粒子内に存在する。宿主脂肪酸の貯蔵所や、細菌がリポタンパク質粒子から脂肪酸を抽出するメカニズムに関しては、不確実性が残っている。本研究では、鶏卵黄からの低密度リポタンパク質(LDL)粒子を濃縮し、LDLがS.アウレウスの脂肪酸貯留槽として機能するかどうかを決定するためのプロトコルについて説明する。この方法は、LLLと細菌間の相互作用を探索するための効果的かつ経済的なモデルである、公平なリピドミック分析と鶏LLLを利用する。LDLからの外因性脂肪酸のS.aureus統合の解析は、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を用いて行われ、細菌の脂肪酸組成の特性評価を可能にする。LLLへの曝露時に細菌膜脂質に生じる脂肪酸の新しい組み合わせの膜および公平な同定。これらの高度な質量分析技術は、リン脂質に組み込まれた特定の外因性脂肪酸を明らかにすることによって、脂肪酸の組み込みの比類のない視点を提供します。ここで概説する方法は、他の細菌病原体および複合脂肪酸の代替供給源の研究に適応可能である。

鶏卵黄からのLDLの濃縮のためのプロトコルを図1に示す。このプロセスは、全卵黄を生理食で希釈し、顆粒と呼ばれる卵黄固体をLLLを含む可溶性または血漿分画から分離することから始まる(図1)33。血漿画分のLDL含有量は、〜30〜40kDaβ-ライブチン(図2)33の沈殿によってさらに濃縮され?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

このプロトコルは、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌への外因性脂肪酸の取り込みを研究するためのフレームワークを提供する。このプロトコルは、鶏卵黄から分離された公平なリピドミック分析とリポタンパク質粒子を、脂肪酸を細菌脂質に組み込むものを定量化する複雑な脂肪酸の経済的源として利用しています。質量分析技術は、ここで記載されているブドウ球菌脂質の脂肪酸プロファイルの比類のない視点を提供するが、他の細菌膜を研究するために適応することができる。このプロトコルを実行する場合は、LDL 含有分数を識別して保持するために、各分数処理手順に注意する必要があります。血漿分画からの硫酸アンモニアの除去は、LDLの下流の用途に不可欠です。まず、2つの卵黄を30ミリリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、残りのアルブミンを除去します。無菌ピペットチップでビテリン膜を穿刺し、無菌50ミリリットル円錐形遠心管に膜の内容物を排出します。卵黄にpH 7で約24〜30ミリリットルまたは17モル塩化ナトリウム溶液を加え、激しく混ぜます。その後、ロッキングシェーカーの上にチューブを置き、摂氏4度で60分間混ぜます。卵黄希釈液を摂氏10度で10,000倍gで45分間遠心分離する。上清プラズマ分を無菌50ミリリットル円錐形チューブに移し、ペレット状の粒状分画を残します。そして再び遠心分離機。まず、4°Cのロッキングシェーカーまたは同様の装置で、プラズマ分率を40質量体積%硫酸アンモニウムと60分間混合します。pHを調整した後、45分間、プラズマ画分を摂氏4度、10,000時間gで遠心分離する。上部半固体黄色の分率を7キロダルトンの孔サイズ透析管に取り除く。チュービングに25%以上の余分な部屋を用意して膨らませます。透析チューブを3リットルの超純水に入れ、硫酸アンモニウムを取り除くために一晩透析を摂氏3度で下します。透析後、前述のように摂氏4度で溶液を遠心分離する。上半固体の黄色分率を滅菌チューブに慎重に取り出し、摂氏4度で保管します。培養物を一晩培養した後、500マイクロリットルを1%トリプコンブロスの49.5ミリリットルを含む2つの無菌250ミリリットルバッフルフラスコに移す。摂氏37度で約4時間インキュベートし、揺れが中期に達する。100ミリリットルの培養物を25ミリリットル単位で4本の無菌50ミリリットル遠心管に移し、4本のチューブを10,000gで遠心分離して細胞をペレット化する。上清を取り除き、1%トリプトンブロスの750マイクロリットルの各細胞ペレットを再中断します。4つの750マイクロリットルセルサスペンションを15ミリリットルチューブに組み合わせます。そしてアリコート350マイクロリットルの細胞懸濁液を6つの無菌1.5ミリリットル遠心分離管に入った。ピペットを使用して1.5ミリリットル遠心分離管に30マイクロリットルのLLDを加え、所望の最終濃度5%を達成し、摂氏37度で4時間の振盪を行います。2分間16,000倍のgで摂氏4度で文化を遠心分離します。そして、洗浄するために330マイクロリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水中の細胞ペレットを再懸濁する。この洗浄をもう一度繰り返します。空の管の重量を減算して、6つの湿潤細胞ペレットの重量を記録する。スナップはドライアイス上の細胞ペレットを凍結します。まず、各細胞ペレットの上に5ミリメートル酸化ジルコニウムビーズの1スクープを追加します。740マイクロリットルの740マイクロリットルの75%HPLCグレードのメタノールをマイナス80°Cまで直接各チューブに加えます。次に、50マイクロモルジミリストイルホスファチジルコリンの2マイクロリットルを内部標準として追加します。1.5ミリリットルの遠心分離管を含むサンプルを弾丸ブレンダー組織ホモジナイザーの利用可能なポートに入れる。サンプルを低速で均質化します。2~3分の間に3分を設定します。サンプルの均質性を視覚的に検査します。セルの束が見える場合は、弾丸ブレンダーで 2 分ずつ均質化を続けます。次に、化学ヒュームフードの各サンプルにクロロホルムの270マイクロリットルを追加します。30分間、サンプルを激しく渦にかけます。ベンチトップ遠心分離機のサンプルを最低2,000回gで最大30分間遠心分離します。化学煙フードでは、モノファシカル上清を収集し、抽出管の底にあるタンパク質ペレットを慎重に避けながら、新しい試験管に移します。あらかじめ調製した希釈脂質抽出物を適切なオートサンプラーバイアルに移す。フローインジェクションベースの解析では、オートサンプラーバイアルをキャピラリーフローアプリケーションが可能なHPLCシステムの温度制御オートサンプラーに配置します。原稿に従ってHPLCシステムを設定します。溶離液は、HPLC移送ラインから質量分析計に、低流量34ゲージの金属針を取り付けたエレクトロスプレーイオン化源を介して導入される。Thermo Tune Plus の計測器制御ソフトウェアで、イオン化電圧を 4,000 ボルト、シースガスを 5 に設定します。同様に、キャピラリー温度を摂氏150度に設定し、Sレンズを50%に設定して、スキャンを定義ボタンをクリックし、アナライザーメニューでFTMSを選択します。質量範囲フィールドを標準に設定し、解像度フィールドで 100,000 を選択します。スキャンの種類が [完全] に設定されていることを確認します。スキャン範囲メニューで、最初の質量フィールドに 200 と入力し、最後の質量フィールドに 2,000 と入力します。観測質量精度をさらに定義した後、全イオンクロマトグラムの広いピークを横切る信号を平均化します。マススペクトル表示ウィンドウでサムタックアイコンを右クリックし、スペクトル表示リストを選択します。同じメニューから表示オプションを選択し、表示メニューのすべてのピークトグルボックスを選択します。[大丈夫]ボタンをクリックして、表示ウィンドウを閉じます。マススペクトル表示ウィンドウで thumbtack アイコンをもう一度右クリックし、エクスポートクリップボードの正確な質量を選択します。最初のワークシートのエクスポートされたデータセルA1を新しいExcelスプレッドシートに貼り付け、原稿に従って処理を進めます。正確な質量ベースの脂質同定を行うために、LIMSAソフトウェアを開いてください。メインメニューから、スペクトルタイプメニューのピークリストを選択します。質量分析データが取得された極性に対応するには、正のモードまたは負のモードを選択します。ピークの最大の最大と z の上のピークの全幅で、ピーク検索のための目的のマス検索ウィンドウを入力します。このプロトコルでは、血漿分画のLDL含有量は、30〜40キロダルトンβレビチンの沈殿によってさらに濃縮された。140、80、65、60、および15キロダルトンのタンパク質バンドの存在は、LDLのアポタンパク質と相関します。外因性脂肪酸源として卵黄血漿で培養物を補いながら、トリクロサン誘発性の成長阻害を克服する。同様に, 富化卵黄 LDL とトリクロサン処理培養の補充は、成長を復元します。.また、卵黄LDLの添加は、以前に特徴づけられていたS.アウレウス脂肪酸、食後の成長を支える。プレ脂肪酸含量は、フロー注入高分解能精度質量分析法を採用することにより、1%トリプトンブロスまたは鶏卵黄LDLで測定した。遊離脂肪酸の最小量が見つかりました.豊富なステープル・アウレウス膜リン脂質の直交部分最小二乗法分析は、未処理の脂肪酸組成と鶏卵黄LDL処理条件下で明確なクラス分離を示した。鶏卵黄からのLDLの濃縮は、細菌病原体と宿主リポタンパク質との相互作用を調査するための複雑な脂肪酸の安価な供給源を提供する。脂質抽出物の調製に用いるクロロホルムおよびメタノールは危険である。これらの試薬は化学発煙フードに入れて使用し、すべての廃棄物の流れを含めてください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

脂肪酸の同定で<em&gt;セレウス菌</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

脂肪酸13C Isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick、合理化されたタンパク質結合アッセイのためのバイオチン化ペプチドディスクへの膜タンパク質のワンステップ組み込み

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...