Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Vi takker medlemmer av hammer laboratoriet for deres kritiske vurdering av manuskriptet og støtte til dette arbeidet. Dr. Alex Horswill ved University of Colorado School of Medicine Vennligst gitt AH1263. Dr. Chris Waters laboratorium ved Michigan State University gitt reagenser. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 16SDG30170026 og oppstart midler gir ved Michigan State University.

Merk: følgende protokoll for berikelse av LDL-partikler fra kylling eggeplomme er avledet fra Moussa et al. 200233.
1. utarbeidelse av kylling eggeplomme for berikelse av LDL-partikler
<ol><li>Rense to store kylling egg ved å vaske skjellene med 70% etanol løsning og la den lufttørke.</li>
	<li>Rense egget separator med 70% etanol løsning og la det lufttørke. Fest egg skilletegnet på kanten av et mellomstort beger.</li>
	<li>Sprekk hvert egg enkeltvis inn i egg...

S. aureus inkorporerer eksogene fettsyrer i membranen fosfolipider27,32,43. Fosfolipid syntese ved hjelp av eksogene fettsyrer går utenom FASII hemming, men også endrer Biofysiske egenskaper av membranen27,32,44. Mens inkorporering av eksogene fettsyrer i fosfolipider av gram-positive patogener er godt dokumentert, hullene fo...

Meticillinresistente-resistente S. aureus (MRSA) er den ledende årsak til helse-assosiert infeksjon og den tilknyttede antibiotikaresistens er en betydelig klinisk utfordring1,2,3. Derfor er utviklingen av romanen terapeutiske strategier en høy prioritet. En lovende behandling strategi for gram-positive patogener er hemme fatty acid syntese, et krav for membran fosfolipid produksjon som, i S. aureus, inkluderer EGGFOSFATIDYLGLYSEROL (PG), LYSYL-PG, og cardiolipin4. I bakterier, oppstår fatty acid produksjon via fatty acid syntese II Pathway (FASII)5, som er betydelig forskjellig fra eukaryote motstykke, noe som gjør FASII et attraktivt mål for antibiotika utvikling5,6 . FASII-hemmere primært målet FabI, et enzym som kreves for fettsyrer karbon kjede forlengelse7. Den FabI inhibitor Triklosan er bredt brukt i forbruker-og medisinske varer8,9. Ytterligere FabI hemmere utvikles av flere farmasøytiske selskaper for behandling av S. aureus infeksjon10, 11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Men mange gram-positive patogener, inkludert S. aureus, er i stand til å renovering eksogene fettsyrer for fosfolipid syntese, omgåelsen FASIIhemming 27,28,29. Således er det kliniske potensialet av FASII hemmere diskutert på grunn av betydelige hull i vår kunnskap om kildene til verten fettsyrer og mekanismene som patogener ekstrakt fettsyrer fra verten27,28. For å møte disse hullene, utviklet vi en upartisk lipidomic analysemetode for å overvåke inkorporering av eksogene fatty acid fra lipoprotein partikler i membran fosfolipider av S. aureus.
Under sepsis, vert lipoprotein partikler representerer en potensiell kilde til verts-avledet fettsyrer i blodkar, som et flertall av verten fettsyrer er forbundet med partikler30. Lipoproteiner består av et hydrofile skall bestående av fosfolipider og proteiner som omslutter en hydrofobe kjerne av triglyserider og kolesterol estere31. Fire store klasser av lipoproteiner--chylomikron, svært lav tetthet lipoprotein, high-density lipoprotein, og lav tetthet lipoprotein (LDL)-er produsert av verten og fungere som lipid transport kjøretøy, levere fettsyrer og kolesterol til og fra verts celler via blodkar. LDLs er rikelig i forestret fatty acid inkludert triglyserider og kolesterol estere31. Vi har tidligere vist at svært renset menneskelige LDLs er en levedyktig kilde til eksogene fettsyrer for PG syntese, og dermed gi en mekanisme for FASII inhibitor bypass32. Rensende menneskelige LDLs kan være teknisk utfordrende og tidkrevende mens kommersielle kilder til renset menneskelige LDLs er uoverkommelig dyrt å bruke på en rutinemessig basis eller for å utføre store bakterielle skjermer. For å møte disse begrensningene, har vi endret en prosedyre for berikelse av LDLs fra kylling eggeplomme, en rik kilde til lipoprotein partikler33. Vi har med hell brukt målrettede, høyoppløselig/nøyaktig masse massespektrometri og tandem masse massespektrometri å overvåke innlemmelse av humant LDL-avledet fettsyrer i membranen av S. aureus32. I motsetning til tidligere rapporterte metoder, denne tilnærmingen kan kvantifisere individuelle fatty acid isomerene for hver av de tre store stafylokokk fosfolipid typer. Oljesyre acid (18:1) er en umettede fatty acid stede innenfor alle vert lipoprotein partikler som er lett innlemmet i S. aureus fosfolipider29,30,32. S. aureus er ikke i stand til oljesyre syre syntese29; Derfor etablerer mengden av fosfolipid-innarbeidet oljesyre syre tilstedeværelsen av verten lipoprotein-avledede fettsyrer i stafylokokk membranen29. Disse fosfolipid arter kan identifiseres av State-of-the-art masse massespektrometri metoden beskrevet her, og tilbyr enestående oppløsning av membranen sammensetningen av S. aureus kultivert i nærvær av en fatty acid kilde det sannsynlig oppstår under infeksjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

Staphylococcus aureus og andre gram-positive patogener innlemme fettsyrer fra miljøet i membran fosfolipider. Under infeksjon, flertallet av eksogene fettsyrer er til stede i verten lipoprotein partikler. Usikkerhet gjenstår som til reservoarer av verten fettsyrer og mekanismene som bakterier ekstrakt fettsyrer fra lipoprotein partiklene. I dette arbeidet, beskriver vi protokoller for berikelse av lav tetthet lipoprotein (LDL) partikler fra kylling eggeplomme og bestemme om LDLs tjene som fatty acid reservoarer for S. aureus. Denne metoden utnytter objektiv lipidomic analyse og kylling LDLs, en effektiv og økonomisk modell for utforskning av interaksjoner mellom LDLs og bakterier. Analysen av S. aureus integrering av eksogene fettsyrer fra LDLs utføres ved hjelp av høyoppløselig/nøyaktig masse massespektrometri og tandem masse massespektrometri, slik karakterisering av fatty acid sammensetningen av bakteriell membran og objektiv identifisering av romanen kombinasjoner av fettsyrer som oppstår i bakteriell membran lipider ved eksponering for LDLs. Disse avanserte masse massespektrometri teknikker gir et enestående perspektiv av fatty acid innlemmelse ved å avsløre den spesifikke eksogene fettsyrer innlemmet i fosfolipider. Metodene skissert her er tilpasningsdyktige til studiet av andre bakterielle patogener og alternative kilder til komplekse fettsyrer.

Protokollen for berikelse av LDL fra kylling eggeplomme er illustrert i figur 1. Denne prosessen begynner med å fortynne hele eggeplomme med saltvann og skille eggeplomme partikler referert til som granulat fra løselig eller plasma brøkdel inneholder LDLs (figur 1)33. LDL-innholdet i plasma fraksjonen er ytterligere beriket med utfelling av ~ 30-40 kDa β-livetins (figur 2)...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Denne metoden gir et rammeverk for å studere inkorporering av eksogene fettsyrer fra komplekse verts kilder i bakterielle membraner, spesielt Staphylococcus aureus. For å oppnå dette, protokoller for berikelse av lipoprotein partikler fra kylling eggeplomme og påfølgende fatty acid profilering av bakteriell fosfolipider utnytte masse massespektrometri er beskrevet.

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Denne protokollen gir et rammeverk for å studere inkorporering av eksogene fettsyrer fra komplekse vertskilder til bakterielle membraner, spesielt stafylokokker aureus. Protokollen benytter objektive lipidomanalyse og lipoproteinpartikler isolert fra kyllingeggeplommer som en økonomisk kilde til komplekse fettsyrer for å kvantifisere fettsyreinkorporering i bakterielle lipider. Massespektrometriteknikkene beskriver her gir et enestående perspektiv på fettsyreprofilen til stafylokokker aureuslipider, men kan tilpasses til å studere andre bakterielle membraner.Når du utfører denne protokollen, bør det tas hensyn til at hvert brøkdelstrinn for å identifisere og beholde den LDL-inneholdende brøken. Fjerning av ammoniakksulfatet fra plasmafraksjonen er avgjørende for nedstrøms anvendelser av LDLs. Gi rikelig plass i slangen og endre vannet etter behov for å tillate effektiv dialyse.Til å begynne med vask to eggeplommer to ganger med 30 milliliter sterilfosfat bufret saltvann for å fjerne gjenværende albumin. Punktere vitellinmembranen med en steril pipettespiss og tøm innholdet i membranen i et sterilt konisk sentrifugrør på 50 milliliter. Tilsett ca 24 til 30 milliliter eller 17 molar natriumkloridoppløsning ved pH syv til eggeplommen og bland kraftig.Plasser deretter røret på en gyngeshaker for å blande på fire grader Celsius i 60 minutter. Sentrifuge eggeplomme fortynning ved 10 grader Celsius ved 10,000 ganger g i 45 minutter. Overfør den overnaturlige plasmafraksjonen til et sterilt konisk rør på 50 milliliter, og etterlater den pelleted granulære fraksjonen.Og sentrifuge igjen. Bland først plasmafraksjonen med 40 massevolum prosent ammoniumsulfat på en gyngeshaker eller lignende enhet ved fire grader Celsius i 60 minutter. Etter justering av pH, sentrifuger plasmafraksjonen ved fire grader Celsius og 10 000 tid g i en varighet på 45 minutter.Fjern den øvre halvsolide gule fraksjonen i syv kilodalton pore størrelse dialyse rør. Gi minst 25% ekstra plass i slangen for å tillate det å hovne opp. Plasser dialyseslangen i tre liter ultrarent vann for å dialyze over natten ved tre grader Celsius for å fjerne ammoniumsulfat.Etter dialyse sentrifuger løsningen ved fire grader Celsius som tidligere beskrevet. Fjern forsiktig den øvre, halvsolide gule fraksjonen til et sterilt rør og lagre på fire grader Celsius. Etter overnatting inkubasjon av kulturen, overføre 500 mikroliter i to sterile 250 milliliter forvirret flasker som inneholder 49,5 milliliter på 1% tryptone kjøttkraft.Inkuber i ca. fire timer ved 37 grader Celsius med risting for å nå midt i lang fase. Overfør 100 milliliter kultur i 25 milliliter trinn til fire sterile 50 milliliter sentrifuge rør og sentrifuge de fire rørene på 10,000 ganger g å pellet cellene. Fjern supernatant og re-suspendere hver celle pellet i 750 mikroliter på 1% tryptone kjøttkraft.Kombiner de fire 750 mikroliter cellesuspensjonene i et enkelt 15 milliliter rør. Og aliquot 350 mikroliter av cellen suspensjon i seks sterile 1,5 milliliter sentrifuge rør. Bruk en pipette til å legge til 30 mikroliter LDLs i 1,5 milliliter sentrifugerør for å oppnå en ønsket endelig konsentrasjon på 5% og inkubere ved 37 grader Celsius med risting i fire timer.Sentrifuge kulturer på fire grader Celsius på 16, 000 ganger g for en varighet på to minutter. Og re-suspendere cellepellets i 330 mikroliter sterilfosfat-bufret saltvann å vaske. Gjenta denne vasken en gang til.Registrer vekten av de seks våtcellepellets ved å trekke vekten av det tomme røret. Fest fryse cellepellets på tørris. Først legger du til en scoop på 5 millimeter zirkoniumoksidperler på toppen av hver cellepellet.Tilsett 740 mikroliter med 75 % HPLC-graders metanol kjølt ned til minus 80 grader Celsius direkte i hvert rør. Tilsett deretter to mikroliter på 50 mikromolar dimyristoylfosfatidylkolin som en intern standard. Plasser prøven som inneholder 1,5 milliliter sentrifugerør i en tilgjengelig port på en kuleblender vev homogenisator.Homogeniser prøvene på lav hastighet. Innstilling to til tre i tre minutter. Inspiser prøvene visuelt for homogenitet.Hvis klumper av celler er synlige, fortsett homogenisering i kuleblenderen i to minutters intervaller. Deretter legger du til 270 mikroliter kloroform til hver prøve i en kjemisk røykhette. Vortex prøvene kraftig i 30 minutter.Sentrifuge prøvene i en benk-top sentrifuge i opptil 30 minutter minst 2, 000 ganger g. I den kjemiske røykhetten samler du monofasisk supernatant og overfører den til et nytt testrør samtidig som proteinpelleten forsiktig unngår proteinpelleten nederst i ekstraksjonsrøret. Overfør de fortynnede lipidekstraktene som tidligere var forberedt til et passende autosampler hetteglass.For flow-injeksjonsbasert analyse plasserer du de automatiske hetteglassene i en temperaturkontrollert autosampler av et HPLC-system som er i stand til kapillærstrømningsapplikasjoner. Sett opp HPLC-systemet i henhold til manuskriptet. Eluent introduseres fra HPLC-overføringslinjen til massespektrometeret gjennom en elektrosprayioniseringskilde utstyrt med en lavstrøms 34 gauge metallnål.I Thermo Tune Plus-instrumentkontrollprogramvaren setter du ioniseringsspenningen til 4000 volt og skjedegass til fem. På samme måte setter du kapillærtemperaturen til 150 grader Celsius og S-objektivet til 50%Klikk på define scan-knappen, og velg FTMS i analysemenyen. Sett masseområdefeltet til normalt, og velg 100 000 i oppløsningsfeltet.Kontroller at skannetypen er satt til full. Under skanneområdemenyen skriver du inn 200 i det første massefeltet og skriver inn 2000 i det siste massefeltet. Etter ytterligere å definere observert massenøyaktighet, gjennomsnittlig signalet over den brede toppen i det totale ionkromatrammet.Høyreklikk på thumbtack-ikonet i massespektrumvisningsvinduet og velg vis spektrumliste. Fra samme meny velger du visningsalternativer og deretter alle topper-veksleboksen i skjermmenyen. Klikk på ok-knappen for å lukke visningsvinduet.Høyreklikk på thumbtack-ikonet i massespektrumvisningsvinduet igjen og velg eksportutklippstavlen nøyaktig masse. Lim inn den eksporterte datacellen A1 i det første regnearket i det nye Excel-regnearket og fortsett i henhold til manuskriptet. Hvis du vil utføre nøyaktige massebaserte lipididentifikasjoner, åpner du LIMSA-programvaren.Velg topplisten under spektrumtypemenyen fra hovedmenyen. Velg positiv modus eller negativ modus for å samsvare med polariteten der massespektrometridataene ble anskaffet. I toppen full bredde på halv maksimum og over z vinduet, skriv inn ønsket massesøkevindu for topp funn.I denne protokollen ble LDL-innholdet i plasmafraksjonen ytterligere beriket av nedbør av 30 til 40 kilodalton beta levitins. Tilstedeværelsen av proteinbånd på 140, 80, 65, 60 og 15 kilodaltonn korrelerer med apoproteinene til LDLs. Behandling med triklosan hemmer veksten av staph aureus i fettsyrefritt medium.Mens supplere kulturer med eggeplomme plasma som eksogene fettsyrekilder overvinner triklosan-indusert vekst hemming. Tilsvarende gjenoppretter tilskudd av triklosan-behandlede kulturer med beriket eggeplomme LDL vekst. Videre støtter tillegg av eggeplomme LDLs veksten av en tidligere preget S.aureus fettsyre, auxotroph.Pre-fettsyreinnhold ble målt i 1% tryptone kjøttkraft eller kylling eggeplomme LDL ved å bruke strømningsinjeksjon høy oppløsning nøyaktig massespektrometri. Det ble funnet minimale mengder fri fettsyre. Ortogonale delvise, minste firkanter diskriminantanalyse av rikelig staph aureus membran fosfolipids viste klar klasse separasjon, med en fettsyresammensetning av ubehandlede og kylling eggeplomme LDL behandlede forhold.Berikelse av LDLs fra kylling eggeplomme gir en billig kilde til komplekse fettsyrer for å undersøke samspillet mellom bakterielle patogener og vert lipoproteiner. Kloroform og metanol som brukes til fremstilling av lipidekstrakter er farlige. Pass på at du bruker disse reagensene i en kjemisk røykhette og inneholder alle avfallsstrømmer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriell Inner-membran Display for Screening et bibliotek av antistoff-fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifisering av fettsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fettsyrer 13C Isotopologue profilering gir innsikt i Trophic karbon overføring og Lipid metabolismen av virvelløse forbrukere

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Rask isolering av Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en ett-trinns innlemmelse av membran proteiner i Biotinylated Peptidiscs for strømlinjeformet protein bindende analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...