Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников лаборатории Hammer за их критическую оценку рукописи и поддержку этой работы. Д-р Алекс Horswill из Университета Колорадо школы медицины любезно при условии AH1263. Доктор Крис Уотерс (Chris Waters Laboratory) из Мичиганского государственного университета предоставил реагенты. Эта работа была поддержана Американской ассоциацией сердца грант 16SDG30170026 и стартовых средств, предоставляемых Мичиганского государственного университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол для обогащения частиц ЛПНП из куриного яичного желтка получен из Moussa et al. 200233.
1. Приготовление куриного яичного желтка для обогащения частиц ЛПНП
<ol><li>Обезвить два больших куриных яйца, промыв скорлупу с 70% раствор атанола и да?...

S. aureus включает экзогенные жирные кислоты в мембрану фосфолипидов27,32,43. Синтез фосфолипидов с использованием экзогенных жирных кислот обходит ингибирование FASII, но также изменяет биофизические свойства мембраны27,</...

Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) является ведущей причиной инфекции, связанной с здравоохранением, и связанная с этим устойчивость к антибиотикам является значительной клинической проблемой1,2,3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий является приоритетной задачей. Перспективная стратегия лечения грамположительных патогенов ингибирует синтез жирных кислот, требование для производства мембранного фосфолипида, который, в S. aureus, включает в себя фосфатидилглицерол (ПГ), лисил-ПГ, и кардиолипин4. В бактериях, производство жирных кислот происходит через синтез жирных кислот II путь (FASII)5, который значительно отличается от эукариотического аналога, что делает FASII привлекательной мишенью для развития антибиотиков5,6 . Ингибиторы FASII в первую очередь нацелены наFabI, фермент, необходимый для удлинения углеродной цепи жирных кислот 7. Ингибитор FabI триклозан широко используется в потребительских и медицинских товаров8,9. Дополнительные ингибиторы FabI разрабатываются несколькими фармацевтическими компаниями для лечения инфекции S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Тем не менее, многие грамположительных патогенов, в том числе S. aureus, способны очистки экзогенных жирных кислот для синтеза фосфолипидов, в обход ингибирования FASII27,28,29. Таким образом, клинический потенциал ингибиторов FASII обсуждается из-за значительных пробелов в наших знаниях об источниках жирных кислот-хозяев и механизмах, с помощью которых патогенные микроорганизмы извлекают жирные кислоты из организма27,28. Для устранения этих пробелов мы разработали объективный метод липидомного анализа для мониторинга включения экзогенных жирных кислот из частиц липопротеинов в мембранные фосфолипиды S. aureus.
Во время сепсиса, частицы липопротеинов-хозяев представляют потенциальный источник принимающих жирных кислот в сосудистой, так как большинство принимающих жирных кислот связаны с частицами30. Липопротеины состоят из гидрофильной оболочки, состоящей из фосфолипидов и белков, которые заключают гидрофобное ядро триглицеридов и холестериновых эстеров31. Четыре основных класса липопротеинов - хиломикрон, липопротеин с очень низкой плотностью, липопротеины высокой плотности и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) - производятся хозяином и функционируют как липидные транспортные средства, доставляя жирные кислоты и холестерин в и из клетки-хозяина через сосуды. LDLs в изобилии в эстерифицированных жирных кислот, включая триглицериды и холестерин эфиры31. Ранее мы показали, что высокоочищенные лПЛА человека являются жизнеспособным источником экзогенных жирных кислот для синтеза PG, обеспечивая тем самым механизм для ингибитора FASII шунтирования32. Очистка человека LDLs может быть технически сложной и трудоемкой в то время как коммерческие источники очищенных человека LDLs являются непомерно дорогими для использования на регулярной основе или для выполнения крупномасштабных бактериальных экранов. Для устранения этих ограничений, мы изменили процедуру для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка, богатый источник частиц липопротеинов33. Мы успешно использовали нецелевые, с высоким разрешением / точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии для мониторинга включения человека LDL полученных жирных кислот в мембране S. aureus32. В отличие от ранее окоторыхажинных методов, этот подход может количественно изомерить отдельные жирные кислоты для каждого из трех основных типов стафилококковых фосфолипидов. Олеиновая кислота (18:1) является ненасыщенным жирным кислотом, присутствующим во всех частицах липопротеинов- хоста, которые легко включаются в S. aureus phospholipids29,30,32. S. aureus не способен синтезировать олеиновой кислоты29; Таким образом, количество фосфолипид-включенной олеиновой кислоты устанавливает наличие принимающих липопротеинов жирных кислот в стафилококковой мембране29. Эти фосфолипидные виды могут быть идентифицированы по описанному здесь методу масс-спектрометрии, предлагая беспрецедентное разрешение мембранного состава S. aureus, культивируется в присутствии источника жирных кислот, который, скорее всего, может быть встречается во время инфекции.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

Золотистый стафилококк и другие грамположительные патогены включают жирные кислоты из окружающей среды в мембранные фосфолипиды. Во время инфекции, большинство экзогенных жирных кислот присутствуют в принимающих частиц липопротеинов. Сохраняется неопределенность в отношении резервуаров жирных кислот-хозяев и механизмов, с помощью которых бактерии извлекают жирные кислоты из частиц липопротеинов. В этой работе мы описываем протоколы для обогащения частиц липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из куриного яичного желтка и определяем, служат ли ЛПНП резервуарами жирных кислот для S. aureus. Этот метод использует объективный липидомный анализ и куриные ЛПНП, эффективную и экономичную модель для исследования взаимодействий между ЛПЛ и бактериями. Анализ интеграции S. aureus экзогенных жирных кислот из ЛПНП проводится с использованием высокой разрешения/точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии, что позволяет охарактеризовать состав жирных кислот бактериальной мембраны и объективное выявление новых комбинаций жирных кислот, которые возникают в бактериальных мембранных липидах при воздействии ЛПНП. Эти передовые методы масс-спектрометрии предлагают беспрецедентную перспективу инкорпорации жирных кислот, раскрывая конкретные экзогенные жирные кислоты, включенные в фосфолипиды. Методы, изложенные здесь, адаптируются к изучению других бактериальных патогенов и альтернативных источников сложных жирных кислот.

Протокол для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка иллюстрируется на рисунке 1. Этот процесс начинается с разбавления всего яичного желтка солевом раствором и разделения твердых веществ яичного желтка, называемых гранулами из растворимых или пл?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Изоляция частиц липопротеинов из куриного яичного желтка для изучения бактериального патогена жирной кислоты Инкорпорации в Мембрана фосфолипиды

Этот метод обеспечивает основу для изучения включения экзогенных жирных кислот из сложных источников хозяина в бактериальные мембраны, в частности золотистый стафилококк. Для этого описаны протоколы для обогащения частиц липопротеинов из куриного яичного желтка и последующего профилирования жирных кислот бактериальными фосфолипидами с использованием масс-спектрометрии.

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Этот протокол обеспечивает основу для изучения включения экзогенных жирных кислот из сложных источников хозяина в бактериальные мембраны, особенно золотистый стафилококк. Протокол использует объективный липидомный анализ и частицы липопротеинов, изолированные от куриных яичных желтков в качестве экономического источника сложных жирных кислот для количественной оценки включения жирных кислот в бактериальные липиды. Методы масс-спектрометрии, описываемые здесь, предлагают беспрецедентную перспективу профиля жирных кислот из липидов золотистого стафилококка, но могут быть адаптированы для изучения других бактериальных мембран.При выполнении этого протокола следует позаботиться о том, чтобы каждый шаг фракциоции выявлял и сохранял фракцию, содержащую ЛПНП. Удаление сульфата аммиака из плазменной фракции имеет решающее значение для применения в нижнем течении LDLs. Обеспечить достаточно места в трубе и изменить воду по мере необходимости, чтобы позволить эффективный диализ.Для начала, мыть два яичных желтка в два раза с 30 миллилитров стерильного фосфата буферного солевого раствора для удаления остаточного альбумин. Проколите вителлиновую мембрану стерильным наконечником пипетки и слейте содержимое мембраны в стерильную 50-миллилитровую коническую центрифугу. Добавить примерно от 24 до 30 миллилитров или 17 молярного раствора хлорида натрия при рН семь в яичный желток и энергично перемешать.Затем поместите трубку на качалку, чтобы смешать при четырех градусах по Цельсию в течение 60 минут. Центрифуга разбавления яичного желтка при 10 градусах Цельсия при 10 000 раз г в течение 45 минут. Перенесите супернатантную плазменную фракцию в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку, оставив за собой гранулированную гранулированную гранулированную фракцию.И снова центрифуга. Во-первых, смешать плазменную фракцию с 40 массой процента аммония сульфата на качалки шейкер или аналогичное устройство при четырех градусах по Цельсию в течение 60 минут. После регулировки рН центрифуга плазменной фракции при четырех градусах Цельсия и 10 000 времени г в течение 45 минут.Удалите верхнюю полутвердую желтую фракцию в семь килодальтонных пор размером с диализную трубку. Предоставьте минимум 25% дополнительной комнаты в трубе, чтобы она зыбь. Поместите диализные трубки в три литра ультрапурной воды, чтобы парализовать ночь при трех градусах по Цельсию, чтобы удалить сульфат аммония.После диализа центрифуга раствора при четырех градусах Цельсия, как описано ранее. Аккуратно удалите верхнюю, полутвердую желтую фракцию в стерильную трубку и храните при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации культуры, передача 500 микролитров в два стерильных 250 миллилитров сбит с толку колбы, содержащие 49,5 миллилитров 1%триптон бульон.Инкубировать в течение примерно четырех часов при 37 градусах по Цельсию со тряской, чтобы достичь середины длинной фазы. Передача 100 миллилитров культуры в 25 миллилитров шагом в четыре стерильных 50 миллилитров центрифуг трубки и центрифуги четыре трубки на 10000 раз г гранулы клеток. Удалите супернатант и повторно приостановите каждую ячейку гранулы в 750 микролитров 1%триптон бульона.Объедините четыре 750 микролитровых клеточных суспензий в одну 15-миллилитровую трубку. И aliquot 350 микролитров клеточной подвески в шесть стерильных 1,5 миллилитров центрифуг труб. Используйте пипетку, чтобы добавить 30 микролитров LDLs в 1,5 миллилитр центрифуги трубки для достижения желаемой конечной концентрации 5% И инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания в течение четырех часов.Центрифуга культур при четырех градусах по Цельсию при 16 000 раз г в течение двух минут. И повторно приостановить клеточные гранулы в 330 микролитров стерильных фосфат-буферных солевой раствор для мытья. Повторите эту стирку еще раз.Завещайте вес шести гранул влажных клеток, вычитая вес пустой трубки. Привязать заморозить ячейки гранулы на сухом льду. Сначала добавьте одну мерную ложку 5-миллиметровых бусинок оксида циркония поверх каждой клеточной гранулы.Добавьте 740 микролитров метанола класса 75% HPLC, охлажденных до минус 80 градусов по Цельсию непосредственно в каждую трубку. Затем добавьте два микролитров 50 микромолящих димиристойл фосфатидилхолина в качестве внутреннего стандарта. Поместите образец, содержащий 1,5 миллилитровые центрифуги трубок в доступный порт на пуля блендер ткани гомогенизатора.Гомогенизировать образцы на низкой скорости. Установка два-три в течение трех минут. Визуально проинспектировать образцы на однородность.Если скопления клеток видны, продолжайте гомогенизацию в пулевом блендере двумя минутами. Далее добавьте 270 микролитров хлороформа к каждому образцу в химическом дымовом капюшоне. Вихрь образцов энергично в течение 30 минут.Центрифуга образцов в центрифуге на скамейке до 30 минут при минимуме 2 000 раз г. В химическом вытяжке дыма, собирать монофазный супернатант и передать его в новую пробирку, тщательно избегая белка гранулы в нижней части извлечения трубки. Перенесите разбавленные липидные экстракты, ранее подготовленные к соответствующему автозапомохаму.Для анализа на основе впрыска потока поместите флаконы autosampler в контролируемый температурой автоамперлер системы HPLC, способной к капиллярных приложений потока. Настройка системы HPLC в соответствии с рукописью. Элуент вводится от линии передачи HPLC к масс-спектрометру через источник ионизации электроспрей, оснащенный низкотекутной металлической иглой 34 калибра.В программном обеспечении для управления приборами Thermo Tune Plus установите напряжение ионизации до 4000 вольт и газ оболочки до пяти. Аналогичным образом, установите температуру капилляра до 150 градусов по Цельсию и S-объектив до 50%Нажмите кнопку определения сканирования, и в меню анализатора, выберите FTMS. Установите поле диапазона массы в нормальное русло и в поле разрешения, выберите 100 000.Убедитесь, что тип сканирования установлен в полном объеме. В меню диапазонов сканирования введите 200 в первом массовом поле и введите 2000 в последнем массовом поле. После дальнейшего определения наблюдаемой точности массы, средний сигнал через широкий пик в общей ионой хроматограмме.Право нажмите значок thumbtack в окне просмотра массового спектра и выберите список спектра представления. Из того же меню выберите параметры отображения, а затем все пики переключить окно в меню дисплея. Нажмите кнопку "Хорошо", чтобы закрыть окно просмотра.Право нажмите значок thumbtack в окне просмотра массового спектра снова и выберите экспорт буфер обмена точной массы. Вставьте экспортируемую ячейку данных A1 первого листа в новую таблицу Excel и продолжайте в соответствии с рукописью. Для выполнения точной массовой идентификации липидов откройте программное обеспечение LIMSA.Из основного меню выберите пиковый список под меню типа спектра. Выберите положительный режим или отрицательный режим, чтобы соответствовать полярности, в которой были получены данные масс-спектрометрии. В пиковой полной ширине в половине максимума и над окном z введите желаемое окно массового поиска для пиковой находки.В этом протоколе содержание ЛПНП в плазменной фракции было дополнительно обогащено осадками бета-левитинов от 30 до 40 килоталтонов. Наличие белковых полос на 140, 80, 65, 60 и 15 килодалтонов коррелирует с апопротеинами ЛДЛ. Лечение триклозаном тормозит рост стафилококка в среде, свободной от жирных кислот.Дополняя культуры плазмой яичного желтка в качестве экзогенных источников жирных кислот, мы преодолеваем ингибирование роста, вызванное триклозаном. Аналогичным образом, добавки триклозан обработанных культур с обогащенным яичным желтком LDL восстанавливает рост. Кроме того, добавление яичного желтка LDLs поддерживает рост ранее охарактеризованных S.aureus жирной кислоты, auxotroph.Предварительно жирной кислоты содержание было измерено в 1%триптон бульон или куриный яичный желток ЛПНП с использованием потока инъекций высокого разрешения точной масс-спектрометрии. Было обнаружено минимальное количество свободных жирных кислот. Ортогональный частичный наименее квадратов дискриминантный анализ обильного стафилококка ауреус мембраны фосфолипиды продемонстрировали четкое разделение класса, с жирной кислоты состав необработанных и куриный яичный желток LDL обработанных условиях.Обогащение LDLs из куриного яичного желтка обеспечивает недорогой источник сложных жирных кислот для изучения взаимодействия между бактериальными патогенами и липопротеинов хозяина. Хлороформ и метанол, используемые при приготовлении липидных экстрактов, опасны. Пожалуйста, не забудьте использовать эти реагенты в химическом капоте дыма и содержать все потоки отходов.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Определение жирных кислот в<em&gt; Эхиноцереус бациллы</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Жирные кислоты 13C Isotopologue профилирования обеспечивает проницательность в трофических углерода передачи и метаболизма липидов беспозвоночных потребителей

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Быстрая изоляция Mitoribosome из клеток ГЭС

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Обогащение частиц липопротеинов коренных народов с микроРНК и последующее определение их абсолютной/относительной микроРНК содержание и их сотовой скорость передачи

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...