Name: isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i Hammer Laboratory för deras kritiska utvärdering av manuskriptet och stöd för detta arbete. Dr Alex Horswill vid University of Colorado School of Medicine vänligt förutsatt AH1263. Dr Chris Waters laboratorium vid Michigan State University förutsatt reagenser. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 16SDG30170026 och start-up medel ger av Michigan State University.

Anmärkning: följande protokoll för berikning av LDL-partiklar från kyckling äggula härrör från Moussa et al. 200233.
1. beredning av kyckling äggula för berikning av LDL-partiklar
<ol><li>Sanitize två stora hönsägg genom att tvätta skalen med 70% etanollösning och låt lufttorka.</li>
	<li>Sanitize ägget separatorn med 70% etanollösning och låt lufttorka. Fäst ägg avskiljaren på läppen på en medelstor bägare.</li>
	<li>Spricka varje ägg indivi...

S. aureus innehåller exogena fettsyror i dess membran fosfolipider27,32,43. Fosfolipidsyntes med exogena fettsyror kringgår fasII-hämning men förändrar även de biofysiska egenskaperna hos membranet27,32,44. Även om införlivandet av exogena fettsyror i fosfolipider av grampositiva patogener är väl dokumenterat, kvarst?...

Meticillinresistenta S. aureus (MRSA) är den vanligaste orsaken till vårdrelaterade infektioner och tillhörande antibiotikaresistens är en avsevärd klinisk utmaning1,2,3. Därför är utvecklingen av nya terapeutiska strategier en hög prioritet. En lovande behandlingsstrategi för grampositiva patogener hämmar fettsyror syntes, ett krav för membran fosfolipid produktion som, i S. aureus, innehåller fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG, och kardiolipin4. I bakterier sker produktionen av fettsyror via fettsyra syntes II-vägen (fasII)5, som skiljer sig avsevärt från den eukaryotiska motsvarigheten, vilket gör fasII till ett attraktivt mål för antibiotika utveckling5,6 . FASII-hämmare riktar sig främst till FabI, ett enzym som krävs för kedje förlängning av fettsyror7. Den Fabi-hämmare triclosan används i stor utsträckning i konsument-och medicintekniska produkter8,9. Ytterligare Fabi-hämmare utvecklas av flera läkemedelsföretag för behandling av infektion med S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Emellertid, många grampositiva patogener, inklusive S. aureus, kan rensa exogena fettsyror för fosfolipid syntes, förbigående fasII hämning27,28,29. Således är den kliniska potentialen för fasII-hämmare diskuteras på grund av stora luckor i vår kunskap om källorna till värd fettsyror och de mekanismer genom vilka patogener extrahera fettsyror från värd27,28. För att ta itu med dessa luckor, vi utvecklat en opartisk lipidomikprofildata analysmetod för att övervaka införlivandet av exogena fettsyror från lipoprotein partiklar i membran fosfolipider av S. aureus.
Under sepsis, värd lipoprotein partiklar utgör en potentiell källa av värd-härledda fettsyror inom kärl sammandrabliden, som en majoritet av värd fettsyror är förknippade med partiklarna30. Lipoproteiner består av ett hydrofila skal bestående av fosfolipider och proteiner som omger en hydrofoba kärna av triglycerider och kolesterolestrar31. Fyra stora klasser av lipoproteiner--chylomicron, mycket low-density lipoprotein, hög densitet lipoprotein, och low-density lipoprotein (LDL)-produceras av värden och fungerar som lipid transport fordon, leverera fettsyror och kolesterol till och från värdceller via vaskulaturen. LDLs är rikligt i förestrade fettsyror inklusive triglycerider och kolesterolestrar31. Vi har tidigare visat att högt renade mänskliga LDLs är en livskraftig källa till exogena fettsyror för PG-syntes, vilket ger en mekanism för FASII hämmare bypass32. Rena mänskliga LDLs kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande medan kommersiella källor av renade mänskliga LDLs är oöverkomligt dyra att använda rutinmässigt eller att utföra storskaliga bakteriella skärmar. För att åtgärda dessa begränsningar har vi ändrat ett förfarande för berikning av LDL från kyckling äggula, en rik källa av lipoprotein partiklar33. Vi har framgångsrikt använt oriktad, högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri för att övervaka införlivandet av humana LDL-härledda fettsyror i membranet i S. aureus32. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder, denna metod kan kvantifiera enskilda fettsyror isomerer för var och en av de tre stora staphylococcal fosfolipid typer. Oljesyra (18:1) är en omättad fettsyra närvarande inom alla värd lipoprotein partiklar som är lätt införlivas i S. aureus fosfolipider29,30,32. S. aureus är inte kapabel av oljesyra syntes29; Därför etablerar mängden fosfolipid-inkorporerade oljesyra förekomsten av värd lipoprotein-härledda fettsyror i stafylokockmembranet29. Dessa fosfolipid arter kan identifieras genom den State-of-the-art masspektrometri metod som beskrivs här, erbjuder oöverträffad upplösning av membranet sammansättningen av S. aureus odlade i närvaro av en fettsyra källa det sannolikt möten under infektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrafuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td>96 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large chicken egg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Common store bought egg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus strain AH1263</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by Alex Horswill of the University of Colorado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>68700</td>
			<td>7,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Becton, Dickison and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (reagent grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MCX10559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC-MS grade)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimyristoyl phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>&#8805;99.5% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-30801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>high resolution/accurate mass MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1260 capillary HPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lipoprotein particles from chicken egg yolk for the study of bacterial pathogen fatty acid incorporation into membrane phospholipids

Staphylococcus aureus och andra grampositiva patogener inkorporerar fettsyror från miljön i membranfosfolipider. Under infektion, majoriteten av exogena fettsyror är närvarande inom värd lipoprotein partiklar. Osäkerheten kvarstår när det gäller reservoarerna av värd fettsyror och de mekanismer genom vilka bakterier extraherar fettsyror från lipoproteinpartiklarna. I detta arbete beskriver vi protokoll för berikning av Low-density lipoprotein (LDL) partiklar från kyckling äggula och avgöra om LDLs tjäna som fettsyror reservoarer för S. aureus. Denna metod utnyttjar förutsättningslös lipidomikprofildata analys och kyckling LDLs, en effektiv och ekonomisk modell för utforskning av interaktioner mellan LDLs och bakterier. Analysen av S. aureus integration av exogena fettsyror från LDLs utförs med hjälp av högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri, vilket gör det möjligt att karakterisera fettsyrorna sammansättningen av bakterien membran och opartisk identifiering av nya kombinationer av fettsyror som uppstår i bakteriella membran lipider vid exponering för LDLs. Dessa avancerade masspektrometri tekniker erbjuder ett oöverträffat perspektiv av fettsyra inkorporering genom att avslöja de specifika exogena fettsyror som ingår i fosfolipider. De metoder som beskrivs här är anpassningsbara till studiet av andra bakteriella patogener och alternativa källor till komplexa fettsyror.

Protokollet för berikning av LDL från kyckling äggula illustreras i figur 1. Denna process inleds genom att späda hela äggula med saltlösning och separera äggula fasta ämnen som betecknas som granulat från den lösliga eller plasma fraktion som innehåller LDLs (figur 1)33. LDL-halten i plasma fraktionen berikas ytterligare genom utfällning av ~ 30-40 kDa β-livetiner (figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids at JoVE.com

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Denna metod ger en ram för att studera inkorporering av exogena fettsyror från komplexa värd källor till bakterie membran, särskilt Staphylococcus aureus. För att uppnå detta beskrivs protokoll för berikning av lipoproteinpartiklar från kyckling äggula och efterföljande fettsyra profilering av bakteriella fosfolipider som utnyttjar masspektrometri.

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detta protokoll ger en ram för att studera införlivandet av exogena fettsyror från komplexa värdkällor i bakteriella membran, särskilt stafylokocker aureus. Protokollet utnyttjar opartisk lipidomic analys och lipoprotein partiklar isolerade från kyckling äggulor som en ekonomisk källa till komplexa fettsyror att kvantifiera fettsyra införlivande i bakteriella lipider. Masspektrometriteknikerna beskriver här erbjuder ett oöverträffat perspektiv på fettsyraprofilen hos staphylococcus aureus lipider, men kan anpassas för att studera andra bakteriella membran.När du utför detta protokoll, bör man vara försiktig att varje fraktionering steg för att identifiera och behålla ldl-innehållande fraktion. Avlägsnande av ammoniaksulfat från plasmafraktionen är avgörande för nedströms applikationer av LDLs. Ge gott om utrymme i slangarna och ändra vattnet efter behov för att möjliggöra effektiv dialys.Till att börja tvätta två äggulor två gånger med 30 milliliter sterilfosfat buffrad saltlösning för att ta bort kvarvarande albumin. Punktera vitellinemembranet med en steril pipettspets och dränera membraninnehållet i ett sterilt koniskt centrifugrör på 50 milliliter. Tillsätt ungefär 24 till 30 milliliter eller 17 molar natriumkloridlösning vid pH sju till äggulan och blanda kraftigt.Placera sedan röret på en gungande shaker att blanda på fyra grader Celsius i 60 minuter. Centrifugera äggulan utspädning vid 10 grader Celsius vid 10, 000 gånger g i 45 minuter. Överför den supernatant plasmafraktionen till ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter och lämna kvar den pelleterade granulära fraktionen.Och centrifug igen. Först, blanda plasmafraktionen med 40 massa volym procent ammoniumsulfat på en gungande shaker eller liknande enhet vid fyra grader Celsius i 60 minuter. Efter justering av pH-värdet centrifugera plasmafraktionen vid fyra grader Celsius och 10, 000 tid g under en löptid på 45 minuter.Ta bort den övre halvslösa gula fraktionen i sju kilodalton porstorlek dialysrör. Ge minst 25%av extra utrymme i slangen så att den kan svälla. Placera dialysrör i tre liter ultrarent vatten till dialyze över natten vid tre grader Celsius för att ta bort ammoniumsulfat.Efter dialys, centrifug lösningen vid fyra grader Celsius som tidigare beskrivits. Ta försiktigt bort den övre, halvsliga gula fraktionen till ett sterilt rör och förvara i fyra grader Celsius. Efter att kulturen inkuberas över natten överför du 500 mikroliter till två sterila 250 milliliter förbryllade kolvar som innehåller 49,5 milliliter 1%tryptonebuljong.Inkubera i cirka fyra timmar vid 37 grader Celsius med skakningar för att nå mitten av fasen. Överför 100 milliliter av kultur i 25 milliliter steg till fyra sterila 50 milliliter centrifugrör och centrifug de fyra rören vid 10, 000 gånger g till pellet cellerna. Ta bort supernatanten och återuppstäng varje cellpellets i 750 mikroliter av 1%tryptonebuljong.Kombinera de fyra 750 mikrolitercellsupphängningar i en enda 15 milliliter tub. Och alikvot 350 mikroliter av cellupphängningen i sex sterila 1,5 milliliter centrifugrör. Använd en pipett för att lägga till 30 mikroliter av LDLs i 1,5 milliliter centrifugeröret för att uppnå en önskad slutkoncentration på 5%Och inkubera vid 37 grader Celsius med skakning i fyra timmar.Centrifugera kulturerna vid fyra grader Celsius vid 16, 000 gånger g under en löptid på två minuter. Och åter upphäva cellpellets i 330 mikroliter av sterilfosfat-buffrad saltlösning att tvätta. Upprepa denna tvätt en gång till.Ant registrera vikten av de sex våtcellspelletsen genom att subtrahera det tomma rörets vikt. Snap frysa cellen pellets på torris. Först lägga till en skopa av 5 millimeter zirkonium oxid pärlor ovanpå varje cell pellet.Tillsätt 740 mikroliter av 75%HPLC-kvalitet metanol kyld till minus 80 grader Celsius direkt i varje rör. Tillsätt sedan två mikroliter av 50 mikromolar dimyristoyl fosfatidylkolin som en intern standard. Placera provet som innehåller 1,5 milliliter centrifugrör i en tillgänglig port på en kulmixervävnadshomogenator.Homogenisera proverna på låg hastighet. Ställa in två till tre i tre minuter. Inspektera proverna visuellt för homogenitet.Om klumpar av celler är synliga, fortsätt homogenisering i bullet blender i två minuters steg. Nästa tillsätt 270 mikroliter av kloroform till varje prov i en kemisk rök huva. Vortexa proverna kraftigt i 30 minuter.Centrifugera proverna i en bänk-top centrifugera i upp till 30 minuter vid minst 2, 000 gånger g. I den kemiska rökhuven, samla den monofasiska supernatanten och överför den till ett nytt provrör samtidigt som proteinpelleten i botten av extraktionsröret noggrant undviks. Överför de utspädda lipidextrakten som tidigare förberetts till en lämplig autosampler-injektionsflaska.För flödesinjektionsbaserad analys placerar du injektionsflaskan med autosampler i en temperaturstyrd autosampler av ett HPLC-system som klarar kapillärflödesapplikationer. Sätt upp HPLC-systemet enligt manuskriptet. Eluenten introduceras från HPLC-överföringsledningen till masspektrometern genom en elektrosprayjoniseringskälla försedd med en lågflödesmetallnål med 34 gauge.I thermo Tune Plus-instrumentstyrningsprogrammet ställer du joniseringsspänningen på 4, 000 volt och mantgas till fem. På samma sätt, ställ in kapillärtemperaturen till 150 grader Celsius och S-linsen till 50%Klicka på knappen definiera skanning, och i analysatorn menyn, välj FTMS. Ställ in massområdesfältet på normalt och i upplösningsfältet väljer du 100, 000.Se till att skanningstypen är inställd på full. Under menyn skanningsintervall anger du 200 i det första massfältet och anger 2, 000 i det sista massfältet. Efter ytterligare definiera observerade massa noggrannhet, medelvärde signalen över den breda toppen i den totala jonkromatogram.Högerklicka på ikonen för tummenack i massspektrumvisningsfönstret och välj vyspektrumlista. På samma meny väljer du visningsalternativ och sedan alla toppar växla rutan i visningsmenyn. Klicka på okej-knappen för att stänga visningsfönstret.Högerklicka på ikonen för tummenack i massspektrumvisningsfönstret igen och välj den exakta massan för exportklipp. Klistra in den exporterade datacellen A1 i det första kalkylbladet i det nya Excel-kalkylbladet och fortsätt enligt manuskriptet. För att utföra noggranna massbaserade lipididentifikationer, öppna LIMSA-programvaran.Välj topplista under menyn för spektrumtyp på huvudmenyn. Välj positivt läge eller negativt läge för att motsvara den polaritet som masspektrometridatan förvärvades i. I topp full bredd på halv maximum och över z fönster, ange önskad massa sökfönstret för topp hitta.I detta protokoll var LDL-innehållet i plasma fraktionen ytterligare berikas av utfällning av 30 till 40 kilodalton beta levitins. Förekomsten av proteinband vid 140, 80, 65, 60 och 15 kilodalton korrelerar med apoproteinerna av LDLs. Behandling med triklosan hämmar tillväxten av Staph Aureus i fettsyrafritt medium.Medan komplettera kulturer med äggula plasma som exogena fettsyror källor övervinner triclosan-inducerad tillväxthämning. På samma sätt, tillskott av triklosan-behandlade kulturer med berikad äggula LDL återställer tillväxt. Ytterligare, tillägg av äggula-LDLs stöder tillväxten av en tidigare karakteriserad S.aureus fettsyra, auxotroph.Pre-fettsyra innehåll mättes i 1%tryptone buljong eller kyckling äggula LDL genom att anställa flöde injektion hög upplösning exakt masspektrometri. Minimala mängder av fri fettsyra hittades. Ortogonal delvis minst kvadrater discriminant analys av riklig staph aureus membran fosfolipider visat klar klass separation, med en fettsyra sammansättning av obehandlade och kyckling äggula LDL behandlade villkor.Anrikning av LDLs från kyckling äggula ger en billig källa till komplexa fettsyror för att undersöka interaktioner mellan bakteriella patogener och värd lipoproteiner. Kloroform och metanol som används vid framställning av lipidextrakt är farliga. Var vänlig och se till att använda dessa reagenser i en kemisk rökhuv och innehålla alla avfallsflöden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriell Inner-membran Display för screening av ett bibliotek av antikroppsfragment

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifiering av fettsyror i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fettsyra 13C Isotopologue profilering ger inblick i trofiska Carbon överföring och lipidmetabolismen ryggradslösa konsumenternas

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Snabb isolering av Mitoribosome från HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Anrikning av Native Lipoproteinpartiklar med mikroRNA och efterföljande bestämning av deras absoluta/relativa mikroRNA innehåll och deras cellulära överföringshastigheten

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en enstegs inkorporering av membranproteiner i biotinylerade Peptidiscs för strömlinjeformade Proteinbindnings analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...