Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. Beth Gonzalez og Dr. Aprajita Garg for støtte i udførelsen af in vivo fagocytose eksperimenter. En NSF UMD ADVANCE frø Grant og UMD NIH T32 stipendier, celle og molekylærbiologi (CMB) og vært-patogen interaktioner (HPI), finansieret dette arbejde.

1. Forbered Fluorescein partikler til injektion
<ol><li>Rekonstruere 10 mg af kommercielt tilgængelige, Varme-dræbte bakterier partikler mærket med fluorescein (Se Tabel af materialer) til en stock koncentration på 10 mg/mL ved at tilføje 990 µL sterilt 1 x PBS og 10 µL 50 mM natriumazid. Vortex at blande.<ol>
<li>Opdele i engangsbrug 8 µL delprøver i 0,2 mL rør og gemme i en mørk kasse ved 4 ° C at minimere tilknyttede lysfølsomhed. Bemærk: Natriumazid konserverende er valgfri og kan ...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li><li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila.">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li><li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein.">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li><li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+(PGRP)+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li><li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li><li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle/Toll/cactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults.">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li><li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila.">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li><li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recessive+mutation,+immune+deficiency+(imd),+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense.">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li><li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilablood+cells.">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li><li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase/cholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases.">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li><li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes.">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li><li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria.">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li><li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li><li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain.">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li><li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O&#8217;Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans.">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).</li><li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eater,+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila.">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila.">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zuker+collection:+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster.">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body.">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li><li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila.">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li></ol>

Kommercielt tilgængelige, fluorescently mærket partikler bruges til at vurdere fagocytose i almindelighed (0,2 µm carboxylat modificerede mikrokugler) eller fagocytose af mikrober (fluorescently mærket varme - eller kemisk dræbte bakterier eller gær). For at vurdere phagosome modning, kan forskere vælge partikler mærket med en pH-følsom farvestof, der fluorescerer når pH falder fra neutral til Sure, som i phagolysosome. Alternativt, for at undersøge de indledende trin i fagocytose, patogen anerken...

Medfødte immun forsvaret danne den første linje i forsvaret mod patogene mikrober. Disse svar kan opdeles funktionelt humorale og cellulære medfødt immunitet, som begge er medieret af germline-kodet mønster anerkendelse receptorer (PRRs) at fornemmer patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs)1. Mange af de signaling veje og effektor mekanismer af medfødt immunitet er bevaret i pattedyr og hvirvelløse dyr, såsom fyrretræsnematoden, Caenorhabditis elegans, og bananfluen Drosophila melanogaster2. Frugt fly fremstod som et kraftfuldt system at studere vært forsvar mod smitsomme mikroorganismer3. Drosophila er genetisk tractable, nemt og billigt opdrættet i laboratorier, og har en kort generationstid. Derudover udstiller frugtflue højeffektive forsvar mod en bred vifte af mikrober, gør det muligt for undersøgelse af vært immunitet mod viral, bakterie, svampe eller parasitære patogener.
Drosophila immunologists har historisk udnyttet fremad genetiske skærme, genome-wide RNA-medieret interferens (RNAi) screening af insekt cellelinjer, og præ-eksisterende flyve mutantstammen for at undersøge medfødt immunitet – fører til den identifikation og karakterisering af flere evolutionært bevarede humorale immun veje4,5,6,7,8. Den humorale medfødte immun respons er velsagtens, bedst karakteriseret immunforsvaret i bananfluer. Efter infektion fører den humorale respons til produktion og systemisk frigivelse af antimikrobielle peptid (AMP) molekyler til hemolymph, blodet svarer i insekter. Ampere er produceret af stærkt bevarede vejafgift og Imd signalering veje. Vejafgift vej er homologe til pattedyr TLR/IL-1R receptor signalering, og Imd pathway er homologe til pattedyr Tumor nekrose faktor-alfa signalering. I Drosophila, vejafgift signalering er foranlediget af gram-positive bakterier, svampe og Drosophila X virus6,9,10 og Imd signalering er foranlediget af gram-negative bakterier11 ,12.
Cellulær immunitet, består af indkapsling, melanization og fagocytose af invasive patogener, udført af specialiserede celler kaldes hemocytes13. Der er tre klasser af hemocytes i bananfluen: krystal celler, lamellocytes og plasmatocytes13. Krystal celler, som udgør 5% af de cirkulerende hemocytes i larver, frigive proPhenoloxidase (proPO) enzymer fører til melanization af patogener og værten væv på sår websteder. Lamellocytes, som ikke normalt findes i sund embryoner eller larver, er vedhængende celler, der indkapsler fremmedlegemer. Disse celler er induceret ved pupariation, eller når parasitizing hveps Rognene bliver lagt i larver. Fagocyterende plasmatocytes, som udgør 95% af det cirkulerende hemocytes i larver og alle resterende hemocytes i voksne, spille en rolle i væv remodellering under udvikling, og navnlig, tjene som den vigtigste effektor celle i Drosophila cellulær immunitet.
Fagocytose en umiddelbar og afgørende linje i medfødte immun forsvaret; mikrober, der bryder den vært epitel barriere er hurtigt opslugt og elimineret af fagocyterende celler (For en omfattende gennemgang af cellebiologi af fagocytose Se reference 14). Denne proces sættes i gang når germline-kodet mønstergenkendelse receptorer (PRRs) på hemocytes genkende patogen associeret molekylære mønstre (PAMPs) af mikrober. En gang bundet til deres mål, indlede PRRs signaling cascades, der fører til dannelsen af pseudopods gennem actin cytoskeleton remodellering. Pseudopods surround mikrobe, som efterfølgende er opslugt og internaliseret i en spirende organelle, phagosome. Mikrober er ødelagt som phagosome gennemgår processen med phagosome modning når phagosome er smugles mod hemocyte indre og forsurer gennem en serie af interaktioner med lysosomer. I vitro og celle har biologi undersøgelser i pattedyrceller primære været medvirkende til at identificere og karakterisere faktorer, der regulerer fagocytose, som pattedyr Fc-gamma receptor og C3b receptorer15,16. Ikke desto mindre, evnen til at udføre store skærme eller in vivo-undersøgelser er begrænset i pattedyr systemer.
Her præsenterer vi en in vivo assay for fagocytose i voksen bananfluer, som er baseret på en af David Schneider laboratorium i 200017først indførte procedure. Schneider lab viste, at siddende hemocytes grupperet langs den abdominale dorsale fartøj let phagocytosis polystyren perler og bakterier. For at visualisere fagocytose, fluer er indsprøjtet med fluorescently mærket partikler (såsom E. coli mærket med fluorescein isothiocyanat (E. coli -FITC)), inkuberes i 30 minutter for at tillade hemocytes tid til at opsluge partiklerne, og derefter injiceres med trypan blå, som slukker fluorescens af partikler ikke phagocytosed under inkubationstiden. Flyve dorsale fartøjer er derefter afbildet ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop. Denne skelsættende papir, ved hjælp af et relativt simpelt eksperiment, viste, at hemocytes phagocytosis bakterier og latex perler, at bakteriel fagocytose kan hæmmes ved indblæsning af pre flyver med latex perler, og der flyver uden cellulære og humorale immunrespons er modtagelige selv for E. coli. Analysen i denne rapport bygger på arbejdet i Schneider lab at kvantificere in vivo fagocytose af måling af fluorescens-intensiteten af partikler opslugt af dorsale fartøj forbundet hemocytes.
Svarer til holdningen i pattedyr systemer, Drosophila genetikere starten brugte genome-wide in vitro-RNAi skærme for at identificere gener, der kræves til den cellulære immunrespons18,19,20 ,21,22,23. Men udviklingen af adult in vivo fagocytose assay aktiveret opfølgende forsøg skal udføres let i hele dyr, således at forskere til at kontrollere biologiske rolle i in vitro undersøgelser faktorer. Sådan var tilfældet med den transmembrane receptor Eater, som blev først identificeret som en bakteriel receptor i et RNAi skærmen ved hjælp af S2 celler24 og derefter senere vist at mægle Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, og Staphylococcus aureus (S. aureus) fagocytose i voksne25.
Vores lab ansat in vivo fagocytose assay i fremad genetiske skærme og genome-wide association studier (ved hjælp af Drosophila genetiske Reference Panel (DGRP)) til at identificere nye gener, der regulerer fagocytose i voksen hemocytes. Disse undersøgelser førte til karakterisering PGRP-SC1A-receptorer og PGRP-SA26, den intracellulære vesikel Handel protein Rab1427, glutamat transporter Polyfem28og RNA-bindende protein Fox-129.
Vi forventer, at fremtidige skærme indarbejde den in vivo fagocytose kunne føre til identifikation af yderligere gener, der er vigtig for cellulære immunrespons i Drosophila. Skærme bruger fuldt sekventeret indavlede linjer, som DGRP eller Drosophila syntetiske befolkning ressource (DSPR), kan identificere naturlige varianter påvirker fagocytose eller hemocyte udvikling. Desuden kunne teknikken vedtages i andre arter af Drosophila eller anvendes til skærmen nye fællesskabsmidler såsom indsamling af 250 Drosophila arter vedligeholdes af de nationale Drosophila arter Stock Center (NDSSC ) på Cornell. Disse forsøg kan foretages ved hjælp af fluorescently mærket bakteriel eller svampeinfektion-væg bioparticles der findes i handelen og kan udføres ved hjælp af et vilkårligt antal af bakterie- eller svampeinfektion arter – forudsat at mikrobe udtrykker fluorescerende markører .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

I alle dyr giver medfødt immunitet en øjeblikkelig og robuste forsvar mod et bredt spektrum af patogener. Humorale og cellulære immunrespons er de vigtigste grene af medfødt immunitet, og mange af de faktorer, der regulerer disse svar er evolutionært bevaret mellem hvirvelløse dyr og pattedyr. Fagocytose, den centrale del af cellulære medfødt immunitet, udføres af specialiserede celler i immunsystemet. Bananfluen Drosophila melanogaster, fremstod som en kraftfuld genetiske model til at undersøge de molekylære mekanismer og fysiologiske virkninger af fagocytose i hele dyr. Her viser vi en injektion-baserede in vivo fagocytose assay for at kvantificere partikel optagelse og ødelæggelse af Drosophila blodlegemer, hemocytes. Proceduren, der giver forskere til netop kontrol partikel koncentration og dosis, hvilket gør det muligt at opnå meget reproducerbare resultater i en kort tid. Eksperimentet er kvantitative, nem at udføre og kan anvendes til at screene for værten faktorer at indflydelse patogen anerkendelse, optagelse og clearance.

En skematisk af in vivo fagocytose analysen ved hjælp af fluorescein-mærket partikler er vist i figur 1A. Fluer er monteret ventrale side ned på et stykke af elektrisk tape og de første to segmenter af maven, hvor den dorsale fartøj er placeret, er klart synlige (figur 1B). Vigtige kilder til eksperimentel fejl opstår på injektion og imaging trin af proceduren (figur 1 c). Ved hjælp af den sa...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Denne protokol beskriver en in vivo fagocytose assay i voksen Drosophila melanogaster at kvantificere phagocyt anerkendelse og clearance af mikrobielle infektioner.

Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Denne in vivo fagocytose assay giver forskerne mulighed for at udføre genetiske skærme og genom-dækkende forening undersøgelser for at identificere nye gener, der regulerer fagocytose i voksne blodlegemer. Dette eksperiment er kvantitativt, let at udføre, og kan anvendes til screening af levende dyr for værtsfaktorer, der påvirker patogen anerkendelse, optagelse, og clearance. Efter at trække tyndvægsglas kapillærer med en nål puller, skal du bruge et mikrometer til at holde nålen under et mikroskop, og bruge nummer fem, fine-point, rustfrit stål pincet til at bryde spidsen til en 100-mikrometer spids diameter.For at måle mængden af væske, der vil blive injiceret i hver flue, indlæse en kapillær nål med sterile 5% mad farve i PBS, og udvise væsken på en dråbe mineralsk olie på en 0,01-millimeter fase mikrometer. Dispensere 10 mikroliter af 1,6 milligram per milliliter partikler på en lille firkant af Parafilm, og træk væsken ind i nålen. Monter nålen i injektordysen, og line den bedøvede fluer langs deres udpegede område på fluepuden, ventrale side op, med hovederne orienteret mod forsiden af puden.Placer hætteglassene i tilsvarende områder på bænken, og injicer fluerne i øverste hjørne af maven med fem, 100-millisekundpumper af væske til at levere omkring 10 nanoliter af partikler i alt. Hver flue overføres til det relevante hætteglas, efterhånden som det injiceres, og hætteglasset tages i betragtning. Dernæst indlæses en ny nål med 0,4% Trypan Blue-opløsning, og indstil pneumatiske injektor til gated, så en konstant luftstrøm kan skubbe væsken ud af nålen.30 minutter efter den første injektion injiceres hver flue abdomen med Trypan Blue, indtil maven er fuld og udspilet. Monter fluerne på mikroskop dias med elektrisk tape, ventrale side ned, skubbe vingerne til siden af fluen for at sikre dem til båndet. Skub derefter forsigtigt hovedet ind i båndet for at sikre, at fluen ikke bevæger sig.Umiddelbart efter alle fluorescens mikroskop er blevet sikret, billede insekterne, en ad gangen, på en 25 eller 32 gange forstørrelse på en omvendt fluorescens mikroskop knyttet til et digitalt kamera og computer, der fokuserer på dorsale fartøj af hver flue ved hjælp af computersoftware til det digitale kamera. Derefter skal du registrere eksponeringstiden og forstørrelsen mellem eksperimenter. Hvis du vil kvantificere fluorescensen, skal du åbne et passende billedanalyseprogram og åbne et billede.For at måle røgrørsintensiteten af dorsale beholderen tegnes en polygon rundt om dorsale beholderen, og der skal vælges Mål for at registrere fluorescensintensiteten inde i polygonen. For at bestemme baggrundsfluorescensintensiteten skal du kopiere den første polygon og flytte den til et område, der støder op til dorsalbeholderen for hver fluorescensintensitet for hver fluorescens. Vælg derefter Målpunkt, og post fluorescensintensiteten i baggrundsområdet.For at normalisere dorsalbeholderens fluorescens ved baggrundsfluorescens skal du efter måling af fluorescensintensiteten i resten af fluoreferne i resten af fluoreferne ved at fordele dorsalbeholderens fluorescens med baggrundsfluorescensen og beregne den gennemsnitlige normaliserede dorsale beholderfluorescensintensitet af alle fluorescensintensiteten af alle fluierne i én stamme. Efter at være blevet monteret ventrale side ned på et stykke elektrisk tape, de første to segmenter af maven, hvor dorsale fartøj er placeret, er klart synlige. Der opstår vigtige kilder til eksperimentelle fejl ved procedurens injektions- og billeddannelsestrin.Brug af den samme nål til at injicere flere fluer kan få det tilstoppet med fluevæv eller partikler. Fluer, der ikke får nok Trypan Blue fluorescens klart i hele deres mave, hvilket kan reducere forholdet mellem dorsal beholderen til baggrunden fluorescens, og dermed mindske den sande fluorescens intensitetsforhold af dyret. Fluer skal fotograferes, mens immobiliseret af kuldioxid, som aktivt bevæger fluer producere slørede billeder, der ikke kan kvantificeres.En mutant linje fra Zuker-samlingen af ethylmethansulfonerede fluer er ude af stand til at fagocytosegram-negative og grampositive bakterier og udviser næsten ingen dorsal beholderfluorescens i in vivo fagocytosis-analysen, parret med den isogene baggrund Zuker-stamme og en anden fælles laboratoriekontrolstamme. Hold styr på den tid og rækkefølge, hvori fluer injiceres for at sikre, at fluer er på sammenlignelige stadier af patogengenkendelse og optagelse, når de afbildes. De molekylære mekanismer, der ligger til grund for fagocytiske defekter, kan bestemmes ved at studere enkelte hæmocytter med konfokal mikroskopi eller efter fluorescensaktiv cellesortering eller ved magnetisk perleisolering af voksne hæmocytter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Brug af RNA-interferens Undersøge Innate immunresponset i musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakteriel infektion og immunforsvaret fænotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...