Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Beth Gonzalez e Dr. Aprajita Garg per supporto nello svolgimento degli esperimenti in vivo fagocitosi. Una sovvenzione di seme di NSF UMD ADVANCE e UMD NIH T32 borse per la formazione, cellula e biologia molecolare (CMB) e le interazioni ospite-patogeno (HPI), finanziato quest'opera.

1. preparare le particelle della fluorescina per iniezione
<ol><li>Ricostituire 10mg di commercialmente disponibili, calore-uccisi batteri particelle etichettate con fluoresceina (Vedi Tabella materiali) ad una concentrazione stock di 10 mg/mL aggiungendo 990 µ l sterile 1X PBS e 10 µ l 50 mM sodio azide. Vortice di mescolare.<ol>
<li>Dividere in aliquote di µ l 8 monouso in provette da 0,2 mL e conservare in una scatola scura a 4 ° C per ridurre al minimo la sensibilità alla luce associata. No...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li><li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila.">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li><li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein.">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li><li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+(PGRP)+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li><li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li><li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle/Toll/cactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults.">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li><li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila.">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li><li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recessive+mutation,+immune+deficiency+(imd),+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense.">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li><li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilablood+cells.">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li><li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase/cholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases.">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li><li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes.">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li><li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria.">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li><li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li><li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain.">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li><li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O&#8217;Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans.">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).</li><li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eater,+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila.">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila.">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zuker+collection:+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster.">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body.">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li><li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila.">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li></ol>

Commercialmente disponibile, fluorescente contrassegnate particelle sono utilizzate per valutare la fagocitosi in generale (0,2 µm per volta carbossilato microsfere) o fagocitosi dei microbi (calore - fluorescente etichettati o chimicamente uccisi batteri o lieviti). Per valutare la maturazione del fagosoma, i ricercatori possono selezionare particelle marcate con un colorante di pH-sensibile che reagisce in quando il pH si abbassa da neutro ad acido, come il phagolysosome. In alternativa, per esaminare i p...

Difese immunitarie innate formano la prima linea di difesa contro i microbi patogeni. Queste risposte possono essere diviso funzionalmente in immunità innata umorale e cellulare, entrambi i quali sono mediati da recettori di riconoscimento modello germinale-codificato (PRRs) che senso pathogen-associated molecular pattern (PAMP)1. Molte delle vie di segnalazione e meccanismi effettori dell'immunità innata sono conservati nei mammiferi e invertebrati, come il nematode, elegans di Caenorhabditis e la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster2. Moscerino della frutta è emerso come un potente sistema di difesa dell'ospite contro microrganismi infettivi3di studiare. Drosophila è geneticamente trattabile, facilmente ed a buon mercato allevati nei laboratori e ha un tempo di generazione breve. Inoltre, la Mosca della frutta esibisce altamente efficienti difese contro una matrice di microbi, che consente l'esame dell'immunità ospite contro gli agenti patogeni virali, batterici, fungini o parassitari.
Drosophila immunologi hanno storicamente utilizzato avanti schermi genetici, genoma mediata da RNA interferenza (RNAi) proiezione di linee cellulari di insetto e pre-esistente ceppi mutanti volare per esaminare l'immunità innata – che conduce la identificazione e caratterizzazione di diverse vie immuni umorali evolutivamente conservati4,5,6,7,8. La risposta immunitaria innata umorale è, senza dubbio, il migliore caratterizzata difesa immunitaria nei moscerini della frutta. A seguito di infezione, la risposta umorale conduce alla produzione e rilascio sistemico di peptide antimicrobico molecole (AMP) nell'emolinfa, il sangue equivalente negli insetti. Amplificatori sono prodotte da pedaggio altamente conservata e Imd vie di segnalazione. La via di pedaggio è omologo al mammifero segnalazione del ricevitore TLR/IL-1R e pathway Imd è omologo alla segnalazione di fattore di necrosi tumorale-alfa dei mammiferi. In Drosophila, pedaggio segnalazione è indotto da batteri Gram-positivi e funghi Drosophila X virus6,9,10 e Imd segnalazione è indotta da batteri gram-negativi11 ,12.
Immunità cellulare, composto di incapsulamento, melanizzazione e fagocitosi dei patogeni invasivi, eseguiti da cellule specializzate del sangue chiamate emociti13. Ci sono tre classi di emociti nel moscerino della frutta: cristallo celle, lamellocytes e plasmatocytes13. Crystal cellule, che costituiscono il 5% degli emociti circolanti nelle larve, rilasciano enzimi proPhenoloxidase (proPO) che conduce la melanizzazione degli agenti patogeni e tessuti dell'ospite presso siti ferita. Lamellocytes, che non si trovano in embrioni sani o larve, sono cellule aderenti che incapsulano oggetti estranei. Queste cellule sono indotte su pupariation o quando parassitanti Vespa uova sono depositate nelle larve. Plasmatocytes fagocitaria, che compongono il 95% del circolante emociti nelle larve e tutti i rimanenti emociti negli adulti, gioca un ruolo nel rimodellamento durante lo sviluppo del tessuto e, in particolare, servire come cellula effettore principale della drosofila l'immunità cellulare.
Fagocitosi un'immediato e fondamentale linea di difesa immunitaria innata; i microbi che violano la barriera epiteliale di host sono rapidamente inghiottiti ed eliminati dalle cellule fagocitiche del sangue (per una rassegna completa di biologia delle cellule della fagocitosi vedere riferimento 14). Questo processo è iniziato quando il riconoscimento di pattern con codifica germline recettori (PRRs) su emociti riconoscono patogeni associati pattern molecolari (PAMPs) di microbi. Una volta legato ai loro target, PRRs avviare cascate di segnalazione che portano alla formazione di pseudopodi attraverso actina citoscheletrica rimodellamento. Pseudopodi circondano il microbo, che successivamente viene inghiottito e interiorizzato in un organello nascente phagosome. I microbi sono distrutti come phagosome subisce il processo di maturazione del fagosoma quando phagosome è trafficata verso l'interno degli emociti e acidifica attraverso una serie di interazioni con i lisosomi. In vitro e cella studi di biologia in cellule di mammifero primario sono stati strumentali nell'identificazione e caratterizzazione di fattori che regolano la fagocitosi, come il ricevitore di Fc-gamma dei mammiferi e C3b recettori15,16. Tuttavia, la possibilità di eseguire grandi schermi o studi in vivo sono limitati nei sistemi mammiferi.
Qui presentiamo un test in vivo per la fagocitosi in adulti mosche della frutta, che si basa su una procedura introdotta dal laboratorio di David Schneider nel 200017. Il laboratorio di Schneider ha mostrato che sessile emociti cluster lungo il vaso dorsale addominale prontamente fagocitare batteri e perle di polistirolo. Per visualizzare la fagocitosi, mosche sono iniettati con fluorescente contrassegnate particelle (come e. coli etichettati con isotiocianato di fluorescina (e. coli -FITC)), incubate per 30 minuti permettere emociti di fagocitare le particelle e poi iniettato con trypan blu, che disseta la fluorescenza delle particelle non phagocytosed durante il periodo di incubazione. Volare navi dorsale sono quindi Imaging utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza. Questa carta seminale, utilizzando un esperimento relativamente semplice, ha dimostrato che emociti fagocitare batteri e granuli di lattice, che fagocitosi batterica possono essere inibite iniettando pre-Vola con granuli di lattice, e che vola senza sia cellulare ed umorale le risposte immunitarie sono suscettibili anche di e. coli. L'analisi presentata in questo rapporto si basa sul lavoro del laboratorio Schneider per quantificare in vivo fagocitosi misurando l'intensità della fluorescenza delle particelle inghiottito da emociti vaso dorsale associato.
Simile all'approccio adottato nei sistemi mammiferi, Drosophila genetisti inizialmente utilizzato genoma schermi RNAi in vitro per identificare i geni richiesti per la risposta immunitaria cellulare18,19,20 ,21,22,23. Tuttavia, lo sviluppo del dosaggio adulto fagocitosi in vivo attivato follow-up esperimenti per essere prontamente effettuati in animali interi, consentendo ai ricercatori di verificare il biologico il ruolo dei fattori individuati negli studi in vitro. Tale era il caso con il recettore transmembrana Eater, che è stato prima identificato come un recettore batterico in un schermo di RNAi utilizzando S2 cellule24 e poi più tardi mostrato a mediare Escherichia coli (Escherichia coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitosi di Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) in adulti25.
Il nostro laboratorio impiegato il test di fagocitosi in vivo in avanti schermi genetici e studi di associazione genome-wide (usando il pannello di riferimento genetico drosofila (DGRP)) per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi in adulti emociti. Questi studi hanno portato alla caratterizzazione i recettori PGRP-SC1A e PGRP-SA26, la vescicola intracellulare traffico proteina Rab1427, il trasportatore del glutammato Polifemo28e RNA-proteina Fox-129.
Anticipiamo che futuri schermi che incorporano la fagocitosi in vivo potrebbero portare all'identificazione di ulteriori geni che sono importanti per la risposta immunitaria cellulare in drosofila. Schermate mediante linee inbred completamente sequenziato, ad esempio la DGRP o la drosofila sintetico popolazione risorsa (DSPR), possono identificare varianti naturali che influenzano lo sviluppo di fagocitosi o emociti. Inoltre, la tecnica potrebbe essere adottata in altre specie di Drosophila o utilizzata per nuove risorse comunitarie di schermo, ad esempio la raccolta di 250 specie di Drosophila mantenuto dal National Drosophila specie Stock Center (NDSSC ) alla Cornell. Questi esperimenti possono essere effettuati utilizzando fluorescente etichettati batteriche o fungine-parete bioparticelle che sono commercialmente disponibili o possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi numero di specie batteriche o fungine – fornito che il microbo esprime marcatori fluorescenti .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

In tutti gli animali, l'immunità innata fornisce un immediato e robusta difesa contro un ampio spettro di agenti patogeni. Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono i rami principali dell'immunità innata, e molti dei fattori che regolano queste risposte sono evolutivamente conservate tra gli invertebrati e mammiferi. Fagocitosi, il componente centrale di immunità innata cellulare, viene effettuata da cellule di sangue specializzate del sistema immunitario. Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come un potente modello genetico per studiare i meccanismi molecolari e fisiologici degli impatti della fagocitosi in animali interi. Qui dimostriamo un test di fagocitosi in vivo basati su iniezione per quantificare l'assorbimento delle particelle e la distruzione di cellule del sangue di Drosophila , emociti. La procedura permette ai ricercatori di controllare con precisione la concentrazione di particelle e la dose, che permette di ottenere risultati altamente riproducibili in un breve lasso di tempo. L'esperimento è quantitativa, facile da eseguire e può essere applicato per schermo per fattori ospite che influenza patogeno riconoscimento, assorbimento e liquidazione.

Un disegno schematico del dosaggio fagocitosi in vivo utilizzando particelle della fluorescina-labeled è mostrato in Figura 1A. Le mosche sono montati sul lato ventrale verso il basso su un pezzo di nastro isolante e i primi due segmenti dell'addome, dove il vaso dorsale si trova, è chiaramente visibile (Figura 1B). Principali fonti di errore sperimentale derivano alle fasi della procedura (Figura 1</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.

Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Questo saggio di fagocitosi in vivo consente ai ricercatori di effettuare schermi genetici e studi di associazione a livello genomico per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi nelle cellule del sangue adulte. Questo esperimento è quantitativo, facile da eseguire e può essere applicato allo screening di animali vivi per fattori ospiti che influenzano il riconoscimento, l'assorbimento e la clearance degli agenti patogeni. Dopo aver tirato capillari in vetro a parete sottile con un estrattore ad ago, utilizzare un micrometro per tenere l'ago al microscopio e utilizzare le pinzette in acciaio inossidabile a punto fine al numero cinque per rompere la punta a un diametro della punta di 100 micrometri.Per misurare il volume di liquido che verrà iniettato in ogni mosca, caricare un ago capillare con colorazione sterile del 5% degli alimenti in PBS ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro a stadio di 0,01 millimetri. Distribuire 10 microlitri da 1,6 milligrammi per particelle millilitre su un piccolo quadrato di Parafilm e tirare il liquido nell'ago. Montare l'ago nell'ugello dell'iniettore e allineare le mosche anestetizzate lungo la loro area designata sul fly pad, lato ventrale verso l'alto, con le teste orientate verso la parte anteriore del pad.Posizionare le fiale nelle aree corrispondenti sul banco e iniettare le mosche nell'angolo superiore dell'addome con cinque pompe di liquido da 100 millisecondi per fornire circa 10 nanolitri di particelle in totale. Trasferire ogni mosca nella fiala appropriata mentre viene iniettata, notando il tempo sul flaconcino. Successivamente, caricare un nuovo ago con la soluzione 0.4%Trypan Blue e impostare l'iniettore pneumatico su gated, per consentire un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori dall'ago.30 minuti dopo l'iniezione iniziale, iniettare ogni addome di mosca con Trypan Blue fino a quando gli addome sono pieni e distesi. Montare le mosche su vetrini al microscopio con nastro elettrico, lato ventrale verso il basso, spingendo le ali sul lato della mosca per fissarle al nastro. Quindi, spingere delicatamente la testa nel nastro per assicurarsi che la mosca non si muova.Subito dopo che tutte le mosche sono state fissate, immagini gli insetti, uno alla volta, con un ingrandimento 25 o 32 volte superiore su un microscopio a fluorescenza invertito collegato a una fotocamera digitale e a un computer, concentrandosi sul vaso dorsale di ogni mosca utilizzando il software del computer per la fotocamera digitale. Quindi, registrare il tempo di esposizione e l'ingrandimento tra gli esperimenti. Per quantificare la fluorescenza, aprire un programma di analisi dell'imaging appropriato e aprire un'immagine.Per misurare l'intensità di fluorescenza del vaso dorsale, disegnare un poligono attorno al vaso dorsale e selezionare Misura per registrare l'intensità della fluorescenza all'interno del poligono. Per determinare l'intensità della fluorescenza di fondo, copiare il primo poligono e spostarlo in un'area adiacente al vaso dorsale di ogni mosca. Quindi, selezionate Misura (Measure) e registrate l'intensità di fluorescenza dell'area di sfondo.Per normalizzare la fluorescenza del vaso dorsale per la fluorescenza di fondo, dopo aver misurato le intensità di fluorescenza del resto delle mosche, dividere la fluorescenza del vaso dorsale per la fluorescenza di fondo e calcolare l'intensità media di fluorescenza del vaso dorsale normalizzata di tutte le mosche in un unico ceppo. Dopo essere stati montati sul lato ventrale verso il basso su un pezzo di nastro elettrico, i primi due segmenti dell'addome, dove si trova il vaso dorsale, sono chiaramente visibili. Le principali fonti di errore sperimentale si verificano nelle fasi di iniezione e imaging della procedura.L'uso dello stesso ago per iniettare più mosche può causare l'intasarsi di tessuto di mosca o particelle. Mosche che non ricevono abbastanza fluorescenza Trypan Blue brillantemente in tutto il loro addome, il che può ridurre il rapporto tra il vaso dorsale e la fluorescenza di fondo, diminuendo così il vero rapporto di intensità della fluorescenza dell'animale. Le mosche dovrebbero essere fotografate mentre sono immobilizzate dall'anidride carbonica, poiché le mosche in movimento attivo producono immagini sfocate che non possono essere quantificate.Una linea mutante della collezione Zuker di mosche trattate con etile metanosulfonato non è in grado di flegocitosi batteri gram-negativi e gram-positivi e non mostra quasi nessuna fluorescenza del vaso dorsale nel saggio di fagocitosi in vivo, accoppiata al ceppo di Zuker di fondo isogenico e a un altro comune ceppo di controllo di laboratorio. Tieni traccia del tempo e dell'ordine in cui le mosche vengono iniettate per garantire che le mosche si trovano in fasi comparabili di riconoscimento e assorbimento degli agenti patogeni quando vengono immagini. I meccanismi molecolari alla base dei difetti fagocitici possono essere determinati studiando singoli emociti con microscopia confocale o dopo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o mediante isolamento magnetico delle perline di emociti adulti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Seven Steps to Stellate Cells

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...