Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Beth Gonzalez og Dr. Aprajita Garg for støtte i å utføre eksperimenter i vivo fagocytose. En NSF UMD forhånd frø stipend og UMD NIH T32 trening tilskudd, cellen og molekylærbiologi (CMB) og det vert-patogen samhandlinger (HPI), finansiert dette arbeidet.

1. klargjør Fluorescein partikler for injeksjon
<ol><li>Rekonstituer 10 mg av kommersielt tilgjengelig, varme-drepte bakterier partikler merket med fluorescein (se Tabell of Materials) til en lager konsentrasjon av 10 mg/mL ved å legge 990 µL sterilt 1 x PBS og 10 µL 50 mM Natriumazid. Vortex å blande.<ol>
<li>Del i engangs 8 µL dele i 0,2 mL rør og lagre i en mørk boks 4 ° C å minimere tilknyttet lysfølsomhet. Merk: Natriumazid konserveringsmiddel er valgfri og kan utelates hvis 10 mg/mL...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li><li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila.">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li><li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein.">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li><li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+(PGRP)+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li><li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li><li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle/Toll/cactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults.">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li><li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila.">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li><li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recessive+mutation,+immune+deficiency+(imd),+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense.">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li><li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilablood+cells.">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li><li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase/cholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases.">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li><li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes.">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li><li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria.">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li><li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li><li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain.">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li><li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O&#8217;Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans.">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).</li><li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eater,+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila.">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila.">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zuker+collection:+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster.">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body.">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li><li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila.">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li></ol>

Kommersielt tilgjengelig, fluorescently merket, brukes til å vurdere fagocytose generelt (0,2 µm carboxylate endret mikrosfærer) eller fagocytose av mikrober (fluorescently merket varme - eller kjemisk drepte bakterier eller gjær). For å vurdere phagosome modning, kan forskere velge partikler merket med en pH-sensitive fargestoff som fluoresces når pH reduseres fra nøytrale til surt, som i phagolysosome. Også for å undersøke de første stegene fagocytose, patogen anerkjennelse og opptak, bør forsk...

Medfødte immunforsvar danner den første linjen i forsvaret mot sykdomsfremkallende mikrober. Disse svarene kan være funksjonelt delt i humoral og cellulær medfødt immunitet, begge er formidlet av germline-kodet mønster anerkjennelse reseptorer (PRRs) som forstand patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs)1. Mange av signalveier og effektor mekanismer av medfødt immunitet er bevart i pattedyr og evertebrater som Rundormer, Caenorhabditis elegans, og frukt fly, Drosophila melanogaster2. Frukt fly har dukket opp som et kraftig system å studere vert forsvar mot smittsomme mikroorganismer3. Drosophila er genetisk medgjørlig, lett og rimelig oppdratt i laboratorier, og har en kort generasjonstid. Videre utstillinger frukt fly svært effektiv forsvar mot en rekke mikrober, aktivere undersøkelse av verten immunitet mot viral, bakteriell, fungal eller parasittiske patogener.
Drosophila immunologists historisk har utnyttet frem genetisk skjermer, genomet hele RNA-mediert forstyrrelser (RNAi) screening av insekt cellelinjer, og eksisterende mutant fly stammer for å undersøke medfødt immunitet-fører til den identifikasjon og karakterisering av flere evolusjonært bevarte humoral immun trasé4,5,6,7,8. Humoral medfødte immunforsvaret er, uten tvil, best preget immunforsvar forsvar i frukt fluer. Etter infeksjon fører humoral respons til produksjon og systemisk utgivelsen av antimikrobielle peptid (AMP) molekyler i hemolymph, blod tilsvarende i insekter. Forsterkere produseres av høyt konservert Toll og Imd signalnettverk trasé. Toll veien er homologe til pattedyr TLR/IL-1R reseptor signalering Imd veien er homologe til pattedyr Tumor nekrose faktor-alfa signalering. I Drosophila, Toll signalnettverk er indusert av gram-positive bakterier, sopp og Drosophila X virus6,9,10 og Imd signalnettverk er indusert av gram-negative bakterier11 ,12.
Cellulære immunitet, består av innkapsling, melanization og fagocytose invasiv patogener, utført av spesialiserte blodlegemer kalt hemocytes13. Det er tre klasser av hemocytes i frukt fly: krystall celler, lamellocytes og plasmatocytes13. Krystall celler, som utgjør 5% av sirkulerende hemocytes i larver, slipper proPhenoloxidase (forslag) enzymer fører til melanization av patogener og vert vev på såret nettsteder. Lamellocytes, som ikke normalt finnes i friske befruktede egg eller larver, er tilhenger celler som innkapsler fremmedlegemer. Disse cellene er indusert pupariation eller når parasitizing veps egg er avsatt i larver. Phagocytic plasmatocytes, som utgjør 95% av sirkulerende hemocytes i larver og alle gjenværende hemocytes i voksne, spille en rolle i vev remodeling under utvikling og, spesielt, fungere som den viktigste effektor cellen i Drosophila cellulære immunitet.
Fagocytose en umiddelbar og avgjørende linje av medfødte immunforsvaret forsvar; mikrober som bryter vert epithelial barrieren er raskt oppslukt og eliminert phagocytic blodceller (For en omfattende gjennomgang av cellebiologi på fagocytose se referanse 14). Denne prosessen er igangsatt når germline-kodet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) på hemocytes gjenkjenne patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) av mikrober. Når bundet til sine mål, starte PRRs signalnettverk cascades som fører til dannelsen av eukaryotene gjennom begrepsordbok cytoskjelett remodeling. Eukaryotene omgir mikrobe, som senere oppslukt og internalisert i en begynnende organeller, phagosome. Mikrober er ødelagt som phagosome gjennomgår prosessen med phagosome modning når phagosome smugles mot indre av hemocyte og Forsurer gjennom en rekke interaksjon med lysosomer. I vitro og celle har biologi studier i primære pattedyrceller vært medvirkende i identifisere og karakteriserer faktorer som regulerer fagocytose, som pattedyr Fc-gamma reseptor og C3b reseptorer15,16. Likevel muligheten til å kjøre store skjermer eller i vivo studier er begrenset i pattedyr systemer.
Her presenterer vi en i vivo analysen for fagocytose i voksen frukt fluer, som er basert på en prosedyre først introdusert av laboratoriet av David Schneider i 200017. Schneider laboratoriet viste at fastsittende hemocytes gruppert langs abdominal dorsal fartøyet lett phagocytose polystyren perler og bakterier. For å visualisere fagocytose, fluer er injisert med fluorescently merket partikler (som E. coli merket med fluorescein isothiocyanate (E. coli -FITC)), ruges i 30 minutter for å gi hemocytes tid til å sluke partikler, og deretter injisert med trypan blå som slukker fluorescens partikler ikke phagocytosed under inkubasjonstiden. Fly dorsal fartøy er da fotografert med en invertert fluorescerende mikroskop. Denne banebrytende papir, bruker et relativt enkelt eksperiment, viste at hemocytes phagocytose bakterier og latex perler, som bakteriell fagocytose kan bli hemmet av pre sprøytebruk flyr med latex perler, og som flyr uten både cellulære og humorale immunreaksjoner er utsatt til E. coli. Analysen presentert i denne rapporten bygger på arbeidet til Schneider lab å kvantifisere i vivo fagocytose ved å måle fluorescens intensiteten av partikler omsluttet av dorsal fartøyet tilknyttet hemocytes.
Lik tilnærming tatt i pattedyr systemer, Drosophila Genetikere opprinnelig brukt genomet hele i vitro RNAi skjermer for å identifisere tilblivelse kreves for mobilnettet immunforsvaret18,19,20 ,21,22,23. Men aktivert utviklingen av voksen i vivo fagocytose analysen oppfølgingseksperimenter utføres lett i hele dyr, slik at forskere til å kontrollere biologiske faktorer i in vitro studier rollen. Slik var tilfellet med transmembrane reseptoren Eater, som ble først identifisert som en bakteriell reseptor i en RNAi skjermen bruker S2 celler24 og deretter vist å megle Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, og gule stafylokokker (S. aureus) fagocytose voksne25.
Våre lab ansatt i vivo fagocytose analysen i fremover genetisk skjermer og genom hele association studier (med Drosophila genetisk referanse Panel (DGRP)) til å identifisere romanen gener som regulerer fagocytose i voksen hemocytes. Disse studiene førte til karakterisering receptors PGRP-SC1A og PGRP-SA26, intracellulær vesicle menneskehandel protein Rab1427, glutamat transporter Polyfemos28og RNA-bindende protein Fox-129.
Vi forventer at fremtidige skjermer innlemme det i vivo fagocytose kan føre til identifisering av flere gener som er viktige for mobilnettet immunforsvaret i Drosophila. Skjermer med fullt sekvensielt innavlet linjer, som DGRP eller Drosophila syntetiske befolkningen ressurs (DSPR), kan identifisere naturlig varianter påvirker fagocytose eller hemocyte utvikling. Videre kan teknikken være vedtatt i andre arter av Drosophila eller brukes til skjermen nye-ressurser, som samlingen av 250 Drosophila arter vedlikeholdes av den nasjonale Drosophila arter lager Center (NDSSC ) ved Cornell. Disse eksperimentene kan utføres ved hjelp av fluorescently-merket bakterielle eller sopp-vegg bioparticles som er tilgjengelig kommersielt eller kan utføres ved hjelp av en rekke bakterier og sopp arter-forutsatt at mikrobe uttrykker fluorescerende markører .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

I alle dyr gir medfødt immunitet en umiddelbar og robust forsvar mot et bredt spekter av patogener. Humoral og cellulær immunreaksjoner er de viktigste grenene av medfødt immunitet, og mange av faktorene som regulerer disse svarene er evolutionarily konservert mellom dyr og pattedyr. Fagocytose, den sentrale delen av mobilnettet medfødt immunitet, utføres av spesialiserte blod celler i immunsystemet. Frukt fly, Drosophila melanogaster, har dukket opp som en kraftig genetisk modell å undersøke molekylære mekanismer og fysiologiske virkningene av fagocytose i hele dyr. Her viser vi en injeksjon-basert i vivo fagocytose analysen for å kvantifisere partikkel opptak og ødeleggelse av Drosophila blodlegemer, hemocytes. Prosedyren kan forskere å kontrollere nøyaktig partikkel konsentrasjonen og dose, gjør det mulig å oppnå svært reproduserbar resultater på kort tid. Eksperimentet er kvantitative, enkel å utføre, og kan brukes til skjermen for vert faktorer som innflytelse patogen anerkjennelse, opptak og klarering.

En skjematisk av i vivo fagocytose analysen ved hjelp av fluorescein-merket partikler vises i figur 1A. Fluene er montert ventral side ned på et stykke elektriske tape og de to første delene av magen, der dorsal fartøyet ligger, er synlig (figur 1B). Sentrale kilder for eksperimentell feil oppstå ved injeksjon og tenkelig trinnene av fremgangsmåten (figur 1 c). Bruker samme p for å injisere fle...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Denne protokollen beskriver i vivo fagocytose analysen voksen Drosophila melanogaster å kvantifisere phagocyte anerkjennelse og rydding av mikrobielle infeksjoner.

Vurdere mobilnettet immunforsvaret frukt fly, Drosophila melanogaster, bruke i Vivo fagocytose analysen

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Denne in vivo phagocytosis analysen gjør det mulig for forskere å utføre genetiske skjermer og genom-wide association studier for å identifisere nye gener som regulerer fagocytose i voksne blodlegemer. Dette eksperimentet er kvantitativt, lett å utføre, og kan brukes på screening av levende dyr for vertsfaktorer som påvirker patogengjenkjenning, opptak og klaring. Etter å ha trukket tynnveggsglasskapillærer med en nåletrekker, bruk et mikrometer til å holde nålen under et mikroskop, og bruk nummer fem, finpunkts, pinsett i rustfritt stål for å bryte spissen til en 100-mikrometerspissdiameter.For å måle volumet av væske som skal injiseres i hver flue, last en kapillær nål med steril 5% matfaring i PBS, og utvise væsken på en dråpe mineralolje på et 0,01-millimetertrinns mikrometer. Dispenser 10 mikroliter på 1,6 milligram per milliliter partikler på en liten firkant av Parafilm, og trekk væsken inn i nålen. Monter nålen i injektordysen, og linje de bedøvede fluene langs deres utpekte område på flyputen, ventral side opp, med hodene orientert mot forsiden av puten.Plasser hetteglassene i tilsvarende områder på benken, og injiser fluene i øvre hjørne av magen med fem, 100-millisekunders væskepumper for å levere ca 10 nanoliter partikler totalt. Overfør hver flue til riktig hetteglass når det injiseres, og noterer tiden på hetteglasset. Deretter laster du en ny nål med 0,4% Trypan Blue-oppløsning, og setter den pneumatiske injektoren til inngjerdet, slik at en konstant luftstrøm kan skyve væsken ut av nålen.30 minutter etter den første injeksjonen, injiser hver fluemage med Trypan Blue til magen er fulle og distended. Monter fluene på mikroskopsklier med elektrisk tape, ventral side ned, skyve vingene til siden av flyet for å feste dem til båndet. Skyv deretter forsiktig hodet inn i båndet for å sikre at flyet ikke vil bevege seg.Umiddelbart etter at alle fluene er sikret, bilde insektene, en om gangen, på en 25 eller 32 ganger forstørrelse på et omvendt fluorescensmikroskop festet til et digitalt kamera og en datamaskin, med fokus på dorsalfartøyet til hver fly ved hjelp av dataprogramvaren for digitalkameraet. Deretter registrerer du eksponeringstiden og forstørrelsen mellom eksperimenter. For å kvantifisere fluorescensen, åpne et passende bildeanalyseprogram og åpne ett bilde.For å måle fluorescensintensiteten til dorsalfartøyet, tegn en polygon rundt dorsalbeholderen, og velg Mål for å registrere fluorescensintensiteten inne i polygonet. For å bestemme bakgrunnsfluorescensintensiteten, kopier den første polygonet og flytt den til et område ved siden av ryggbeholderen til hver flue. Velg deretter Mål, og registrer fluorescensintensiteten til bakgrunnsområdet.For å normalisere dorsalkarets fluorescens ved bakgrunnsfluorescens, etter å ha målt fluorescensintensiteten til resten av fluene, del det dorsale fartøyets fluorescens ved bakgrunnsfluorescens, og beregn den gjennomsnittlige normaliserte dorsale fartøyets fluorescensintensitet av alle fluene i en stamme. Etter å ha blitt montert ventral side ned på et stykke elektrisk tape, er de to første segmentene av magen, hvor dorsalbeholderen er plassert, tydelig synlige. Viktige kilder til eksperimentell feil oppstår ved injeksjons- og bildetrinnene i prosedyren.Ved hjelp av samme nål for å injisere flere fluer kan føre til at den blir tilstoppet med flyvev eller partikler. Fluer som ikke mottar nok Trypan Blå fluorescens sterkt gjennom hele magen, noe som kan redusere forholdet mellom dorsalkaret til bakgrunnen fluorescens, og dermed redusere dyrets sanne fluorescensintensitetsforhold. Fluer bør fotograferes mens de immobiliseres av karbondioksid, da aktivt bevegelige fluer produserer uklare bilder som ikke kan kvantifiseres.En mutant linje fra Zuker-samlingen av etylmetansulfonatbehandlede fluer er ikke i stand til å fagocytose gram-negative og gram-positive bakterier og viser nesten ingen dorsal fartøy fluorescens i in vivo phagocytosis analysen, sammen med isogenic bakgrunn Zuker belastning og en annen vanlig laboratoriekontroll belastning. Hold oversikt over tiden og rekkefølgen fluer injiseres for å sikre at fluer er på sammenlignbare stadier av patogengjenkjenning og opptak når de blir avbildet. De molekylære mekanismene underliggende fagocytiske defekter kan bestemmes ved å studere enkelt hemocytter med konfokal mikroskopi eller etter fluorescens-aktivert cellesortering eller ved magnetisk perleisolering av voksne hemocytter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakteriell infeksjon og immunforsvar fenotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...