Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Os autores agradecer Dr. Beth Gonzalez e Dr. Aprajita Garg apoio na realização dos experimentos in vivo de fagocitose. Um avanço de UMD NSF semente Grant UMD NIH T32 bolsas de formação, celular e Biologia Molecular (CMB) e as interações patógeno-hospedeiro (HPI), financiou este trabalho.

1. prepare as partículas de fluoresceína para injeção
<ol><li>Reconstituir a 10 mg de disponíveis comercialmente, calor-matou as bactérias partículas marcadas com fluoresceína (ver Tabela de materiais) a uma concentração das ações de 10 mg/mL, adicionando 990 µ l estéril 1X PBS e 10 µ l 50 milímetros de azida de sódio. Vórtice de misturar.<ol>
<li>Divida em 8 alíquotas de µ l descartáveis em tubos de 0,2 mL e armazenar em uma caixa escura a 4 ° C para minimizar a sensibilidade ass...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. 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Comercialmente disponíveis, fluorescente etiquetadas partículas são utilizadas para avaliar a fagocitose em geral (0,2 µm carboxilato-modificado microesferas) ou fagocitose de micróbios (fluorescente-etiquetadas calor - ou quimicamente matou as bactérias ou leveduras). Para avaliar a maturação do fagossoma, pesquisadores podem selecionar partículas rotuladas com um pH sensíveis corante fluorescente quando o pH diminui de neutro a ácido, como a fagolisossoma. Como alternativa, para examinar os pass...

As defesas imunes inatas formam a primeira linha de defesa contra micróbios patogênicos. Estas respostas podem ser funcionalmente divididas em imunidade humoral e celular inata, ambos os quais são mediados por receptores de reconhecimento padrão germline codificado (PRRs) que detetam o patógeno associado padrões moleculares (PAMPs)1. Muitas das vias de sinalização e mecanismos efetores da imunidade inata são conservados em mamíferos e invertebrados, como o nematódeo, Caenorhabditis elegans e a mosca da fruta, Drosophila melanogaster2. A mosca de fruta tem emergido como um poderoso sistema para estudar a defesa do hospedeiro contra microorganismos infecciosos3. Drosófila é geneticamente tractable, fácil e barata, criados em laboratórios e tem um tempo de geração curto. Além disso, a mosca da fruta apresenta defesas altamente eficientes contra uma matriz de micróbios, permitindo que o exame da imunidade do hospedeiro contra patógenos virais, bacterianas, fúngicas ou parasitárias.
Drosófila imunologistas historicamente utilizaram telas genéticas para a frente, todo o genoma mediada por RNA interferência (RNAi seleção de linhas de células de inseto e pré-existentes cepas moscas mutantes para examinar a imunidade inata – levando à) identificação e caracterização de vários caminhos imune humoral evolutivamente conservada4,5,6,7,8. A resposta imune inata humoral é, sem dúvida, o melhor caracterizada a defesa imunológica em moscas de fruta. Após a infecção, a resposta humoral leva para a produção e liberação sistêmica de peptídeo antimicrobiano moléculas (AMP) para a hemolinfa, o sangue equivalente em insetos. Amplificadores são produzidos pelo pedágio altamente conservado e Imd vias de sinalização. O pathway pedágio é homólogo de mamíferos receptor TLR/IL-1R sinalização e via Imd é homóloga à sinalização de mamíferos de fator de necrose tumoral-alfa. No pedágio da drosófila, sinalização é induzida por bactérias gram-positivas, fungos e Drosophila X virus6,9,10 e Imd sinalização é induzida por bactérias Gram-negativas11 ,12.
Imunidade celular, composta de encapsulamento, melanização e fagocitose de patógenos invasivos, realizada por células especializadas de sangue chamadas de hemócitos13. Existem três classes de hemócitos na mosca da fruta: cristal células, lamellocytes e plasmatocytes13. Pilhas de cristal, que compõem 5% dos hemócitos circulantes em larvas, liberam enzimas proPhenoloxidase (proPO) levando a melanização de agentes patogénicos e tecidos do hospedeiro em locais da ferida. Lamellocytes, que normalmente não são encontrados em embriões saudáveis ou larvas, são células aderentes que encapsulam objetos estranhos. Estas células são induzidas mediante pupariation ou quando parasitam ovos de Vespa são depositados em larvas. Plasmatocytes fagocíticas, que compõem 95% da circulação hemócitos em larvas e todos os restantes hemócitos em adultos, desempenhar um papel no tecido remodelação durante o desenvolvimento e, nomeadamente, servir como a célula principais efetoras da imunidade celular de Drosophila .
Fagocitose uma linha imediata e crucial de defesa imune inata; micróbios que quebrou a barreira epitelial do hospedeiro são rapidamente tragados e eliminados por células fagocíticas (para uma revisão abrangente da biologia das células de fagocitose consulte referência 14). Esse processo é iniciado quando o reconhecimento de padrões codificados germline receptores (PRRs) sobre hemócitos reconhecem patógenos associados a padrões moleculares (PAMPs) de micróbios. Uma vez acoplado para seus destinos, PRRs iniciem cascatas de sinalização que levam à formação de pseudopods através da remodelação de citoesqueleto de actina. Os pseudopods cercam o micróbio, que posteriormente é engolido e interiorizado em uma organela nascente, o fagossomo. Os micróbios são destruídos como o fagossoma sofre o processo de maturação do fagossoma quando o fagossoma é traficado para o interior do hematócito e acidifica através de uma série de interações com lisossomos. Em vitro e célula de estudos de biologia em células de mamíferos primária têm sido fundamentais para identificar e caracterizar os fatores que regulam a fagocitose, como os mamíferos do Fc-gama e C3b receptores15,16. No entanto, a capacidade de executar telas em grande escala ou estudos in vivo são limitadas nos sistemas dos mamíferos.
Aqui nós apresentamos um ensaio in vivo para fagocitose em adultos de moscas de fruta, que é baseado em um procedimento introduzido pelo laboratório de David Schneider em 200017. O laboratório de Schneider mostrou que sessile hemócitos agrupados ao longo do vaso dorsal abdominal prontamente fagocitam bactérias e esferas de poliestireno. Para visualizar a fagocitose, moscas são injetadas com partículas fluorescente etiquetadas (tais como Escherichia coli rotulado com isotiocianato de fluoresceína (e. coli -FITC)), incubadas durante 30 minutos para permitir que o tempo de hemócitos engolir as partículas e então injetado com trypan azul, que sacia a fluorescência de partículas não fagocitados durante o período de incubação. Voar vasos dorsais são então fotografados usando um microscópio fluorescente invertido. Este trabalho seminal, utilizar um experimento relativamente simples, demonstrado que hemócitos fagocitam bactérias e grânulos de látex, a fagocitose bacteriana podem ser inibidos pela pre-injeção de moscas com grânulos de látex, e que voa sem celular e humoral respostas imunes são suscetíveis nem de Escherichia coli. O ensaio apresentado neste relatório baseia-se o trabalho do laboratório Schneider para quantificar a fagocitose in vivo medindo a intensidade da fluorescência das partículas tragado por hemócitos vaso dorsal associado.
Semelhante à abordagem tomada nos sistemas dos mamíferos, Drosophila geneticistas inicialmente usado todo o genoma in vitro RNAi telas para identificar genes necessários para a resposta imune celular18,19,20 ,21,22,23. No entanto, o desenvolvimento do ensaio fagocitose in vivo adulto habilitado experimentos de acompanhamento a efectuar facilmente em animais inteiros, permitindo assim que os investigadores para verificar o biológico o papel dos factores identificados em estudos in vitro. Tal foi o caso com o receptor do transmembrane comedor, que foi identificada pela primeira vez como um receptor bacteriano em uma tela de RNAi usando S2 células24 e então mais tarde mostrada para mediar a Escherichia coli (e. coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitose de Staphylococcus aureus (S. aureus) em adultos25.
Nosso laboratório empregou o ensaio in vivo de fagocitose em telas de genéticas para a frente e estudos de associação de genoma-largo (usando o painel de referência genética drosófila (DGRP)) para identificar novos genes que regulam a fagocitose de hemócitos adultos. Estes estudos levaram à caracterização os receptores PGRP-SC1A e PGRP-SA26, a vesícula intracelular tráfico de proteína Rab1427, o glutamato transportador Polifemo28e RNA-proteína obrigatória Fox-129.
Nós antecipamos que futuras telas incorporando a fagocitose in vivo podem levar à identificação de genes adicionais que são importantes para a resposta imune celular em Drosophila. Telas usando linhas puras totalmente sequenciado, tais como o DGRP ou a drosófila sintético população recurso (DSPR), podem identificar variantes naturais que afectam a fagocitose ou hematócito desenvolvimento. Além disso, a técnica poderia ser adotada em outras espécies de Drosophila ou usada para recursos da comunidade nova tela, como a coleção de 250 espécies de Drosophila , mantido pelo nacional drosófila espécie Stock Center (NDSSC ) em Cornell. Estas experiências podem ser realizadas usando fluorescente-etiquetadas bacteriana ou fúngica-parede bioparticles que estão disponíveis comercialmente, ou podem ser realizadas usando qualquer número de espécies bacterianas ou fúngicas – desde que o micróbio expressa marcadores fluorescentes .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

Em todos os animais, imunidade inata fornece uma defesa imediata e robusta contra um amplo espectro de patógenos. Respostas de imune humorais e celulares são os principais ramos da imunidade inata, e muitos dos fatores regulam estas respostas são conservados evolutivamente entre invertebrados e mamíferos. Fagocitose, o componente central da imunidade inata celular, é realizada por células especializadas do sistema imunológico. Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem emergido como um poderoso modelo genético para investigar os mecanismos moleculares e fisiológicos impactos de fagocitose em animais inteiros. Aqui vamos demonstrar um ensaio baseado em injeção de fagocitose in vivo para quantificar a absorção de partículas e a destruição por células do sangue de Drosophila , hemócitos. O procedimento permite que os pesquisadores controlar com precisão a concentração de partículas e dose, tornando-se possível obter resultados altamente reprodutíveis em um curto espaço de tempo. O experimento é quantitativa, fácil de realizar e pode ser aplicado para esse reconhecimento do patógeno de influência, captação e afastamento de tela para fatores do hospedeiro.

Um esquema do ensaio in vivo de fagocitose partículas de fluoresceína-etiquetado é mostrado na figura 1A. Moscas são montado lado ventral para baixo em um pedaço de fita isolante e os dois primeiros segmentos do abdome, onde se encontra o vaso dorsal, é claramente visível (figura 1B). Principais fontes de erro experimental surgem em etapas do processo (Figura 1) de imagem e a injeção. Usando...

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Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Este ensaio de fagocitose in vivo permite que os pesquisadores realizem telas genéticas e estudos de associação genoma para identificar novos genes que regulam a fagocitose em células sanguíneas adultas. Este experimento é quantitativo, fácil de realizar, e pode ser aplicado à triagem de animais vivos para fatores hospedeiros que influenciam o reconhecimento, absorção e liberação de patógenos. Depois de puxar capilares de vidro de parede fina com um puxador de agulha, use um micrômetro para segurar a agulha sob um microscópio, e use o número cinco, pinças de aço inoxidável de ponta fina para quebrar a ponta para um diâmetro de ponta de 100 micrômetros.Para medir o volume de líquido que será injetado em cada mosca, carregue uma agulha capilar com coloração de alimentos estéril de 5% em PBS e expela o líquido em uma gota de óleo mineral em um micrômetro de estágio de 0,01 milímetros. Distribua 10 microlitadores de 1,6 miligramas por partículas mililitros em um pequeno quadrado de Parafilm, e puxe o líquido para dentro da agulha. Monte a agulha no bocal do injetor, e forra as moscas anestesiadas ao longo de sua área designada na plataforma de voo, lado ventral para cima, com as cabeças orientadas para a frente da almofada.Coloque os frascos em áreas correspondentes no banco, e injete as moscas no canto superior do abdômen com cinco bombas de 100 milissegundos de líquido para entregar cerca de 10 nanoliters de partículas totais. Transfira cada mosca para o frasco apropriado à medida que for injetado, observando o tempo no frasco. Em seguida, carregue uma nova agulha com solução 0,4%Trypan Blue, e ajuste o injetor pneumático para o portão, para permitir um fluxo constante de ar para empurrar o líquido para fora da agulha.30 minutos após a injeção inicial, injete cada abdômen de mosca com Trypan Blue até que os abdômens estejam cheios e distendidos. Monte as moscas em deslizamentos de microscópio com fita elétrica, lado ventral para baixo, empurrando as asas para o lado da mosca para fixá-las à fita. Em seguida, empurre suavemente a cabeça para dentro da fita para garantir que a mosca não se mova.Imediatamente depois de todas as moscas terem sido protegidas, imagem os insetos, um de cada vez, em uma ampliação 25 ou 32 vezes em um microscópio de fluorescência invertida ligado a uma câmera digital e computador, focando no vaso dorsal de cada mosca usando o software do computador para a câmera digital. Em seguida, regise o tempo de exposição e a ampliação entre os experimentos. Para quantificar a fluorescência, abra um programa de análise de imagem apropriado e abra uma imagem.Para medir a intensidade da fluorescência do vaso dorsal, desenhe um polígono ao redor do vaso dorsal e selecione Medida para registrar a intensidade da fluorescência dentro do polígono. Para determinar a intensidade da fluorescência de fundo, copie o primeiro polígono e mova-o para uma área adjacente ao vaso dorsal de cada mosca. Em seguida, selecione Medir e regise a intensidade da fluorescência da área de fundo.Para normalizar a fluorescência do vaso dorsal pela fluorescência de fundo, depois de medir as intensidades de fluorescência do resto das moscas, divida a fluorescência do vaso dorsal pela fluorescência de fundo, e calcule a intensidade média normalizada da fluorescência do vaso dorsal de todas as moscas em uma cepa. Após ser montado lado ventral para baixo em um pedaço de fita elétrica, os dois primeiros segmentos do abdômen, onde o vaso dorsal está localizado, são claramente visíveis. As principais fontes de erro experimental surgem nas etapas de injeção e imagem do procedimento.Usar a mesma agulha para injetar várias moscas pode fazê-la ficar entupida com tecido de mosca ou partículas. Moscas que não recebem fluorescência trippan azul suficiente brilhantemente em todo o seu abdômen, o que pode reduzir a razão do vaso dorsal para a fluorescência de fundo, diminuindo assim a verdadeira razão de intensidade de fluorescência do animal. As moscas devem ser fotografadas enquanto imobilizadas por dióxido de carbono, pois moscas em movimento ativo produzem imagens embaçadas que não podem ser quantificadas.Uma linha mutante da coleção Zuker de moscas tratadas com metanosulfonato etílico são incapazes de fagocytose gram-negativas e gram-positivas bactérias e não exibe quase nenhuma fluorescência de vaso dorsal no ensaio de fagocitose in vivo, emparelhado com a cepa de fundo isogênico Zuker e outra cepa comum de controle de laboratório. Acompanhe o tempo e a ordem em que as moscas são injetadas para garantir que as moscas estejam em estágios comparáveis de reconhecimento e absorção de patógenos quando imagens. Os mecanismos moleculares subjacentes aos defeitos fagocíticos podem ser determinados estudando hemócitos únicos com microscopia confocal ou após a triagem celular ativada pela fluorescência ou pelo isolamento magnético de hemócitos adultos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Imunologia e Infecção

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...