Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Los autores agradecen el Dr. Beth González y Dr. Aprajita Garg para apoyo en la realización de los experimentos de fagocitosis in vivo. Una subvención de NSF UMD avance semilla y UMD NIH T32 becas de formación, célula y Biología Molecular (CMB) y las interacciones huésped-patógeno (HPI), financiado por este trabajo.

1. preparar partículas de fluoresceína para la inyección
<ol><li>Reconstituir 10 mg de bacterias disponibles comercialmente, muertos de calor las partículas marcadas con fluoresceína (véase Tabla de materiales) a una concentración stock de 10 mg/mL mediante la adición de 990 μl estériles de 1 x PBS y 10 μl 50 mM de azida sódica. Vortex para mezclar.<ol>
<li>Dividir en 8 partes alícuotas μL en tubos de 0.2 mL de un solo uso y guardar en una caja oscura a 4 ° C para minimizar la sensibilid...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. 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Comercialmente disponibles, fluorescencia etiquetadas partículas se utilizan para evaluar fagocitosis en general (0,2 μm modificado carboxylate microesferas) o fagocitosis de microbios (marcada con fluorescencia calor o químicamente mató las bacterias o levaduras). Para evaluar la maduración del fagosoma, los investigadores pueden seleccionar partículas con un tinte pH-sensible que fluoresce cuando pH de neutro a ácido, como en el fagolisosoma. Alternativamente, para examinar los pasos iniciales de la...

Defensas inmunes innatas forman la primera línea de defensa contra los microbios patógenos. Estas respuestas pueden dividirse funcionalmente en la inmunidad innata humoral y celular, los cuales son mediados por receptores de reconocimiento de patrón codificado del germline (PRRs) que sensación patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs)1. Muchas de las vías de señalización y mecanismos efectores de la inmunidad innata se conservan en mamíferos e invertebrados, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster2. La mosca de la fruta se ha convertido en un potente sistema de defensa del huésped contra microorganismos infecciosos3de estudio. Drosophila es genéticamente manejable, fácilmente y a bajo costo criados en laboratorios y tiene un tiempo de generación corto. Además, la mosca de la fruta presenta eficientes defensas contra una amplia gama de microbios, lo que permite el examen de la inmunidad del anfitrión contra patógeno viral, bacteriana, micótica o parasitaria.
Inmunólogos de Drosophila han utilizado históricamente adelantadas pantallas genéticas, genoma mediada por RNA de interferencia (ARNi) proyección de líneas celulares de insectos y existían cepas de mosca mutantes para examinar la inmunidad innata – llevando a la identificación y caracterización de varias vías inmune humoral evolutivamente conservado4,5,6,7,8. La respuesta inmune innata humoral es, sin duda, el mejor caracterizado de defensa inmune en moscas de la fruta. Después de la infección, la respuesta humoral conduce a la producción y la liberación sistémica de péptidos antimicrobianos moléculas (AMP) en la hemolinfa, la sangre equivalente en insectos. Amperios se producen por peaje altamente conservado y vías de señalización del Imd. La vía de peaje es homólogo de mamíferos receptores TLR/IL-1R de señalización, y el camino de Imd es homólogo de mamífero Tumor necrosis factor-alpha señalización. En Drosophila, peaje señalización es inducida por bacterias Gram positivas, hongos y Drosophila X virus6,9,10 y señalización del Imd es inducida por bacterias Gram-negativas11 ,12.
Inmunidad celular, compuesto de encapsulado, melanization y fagocitosis de patógenos invasivos, llevado a cabo por células especializadas de sangre llamadas hemocitos13. Hay tres clases de hemocitos en la mosca de la fruta: cristal células, lamellocytes y plasmatocitos13. Las células de cristal, que constituyen el 5% de las circulación hemocitos de larvas, liberan enzimas proPhenoloxidase (proPO) conduce a la melanization de agentes patógenos y tejidos de host en sitios de la herida. Lamellocytes, que no se encuentran normalmente en embriones sanos o las larvas, son células adherentes que encapsulan objetos extraños. Estas células son inducidas a pupariación o parasitando huevos de avispa se depositan en las larvas. Plasmatocitos fagocitarias, que constituyen el 95% de circulación hemocitos de larvas y hemocitos restantes todos en adultos, juegan un papel en la remodelación durante el desarrollo de tejido y, en particular, como la célula efectora principal de la inmunidad celular de Drosophila .
Fagocitosis de una inmediata y crucial línea de defensa inmune innata; microbios que romper la barrera epitelial del huésped son envolvió rápidamente y eliminados por las células fagocíticas de la sangre (para un examen global de biología celular de la fagocitosis ver referencia 14). Este proceso se inicia cuando el reconocimiento de patrones codificados del germline receptores (PRRs) en hemocitos reconocen patógeno asociado patrones moleculares (PMAP) de microbios. Una vez enlazado a sus objetivos, PRRs inician cascadas de señales que conducen a la formación de pseudópodos a través de la remodelación del citoesqueleto de actina. Los pseudópodos rodean el microbio, que posteriormente se hundió e interiorizado en un orgánulo naciente, el fagosoma. Microbios se destruyen como el fagosoma somete el proceso de maduración del fagosoma cuando el fagosoma es traficada hacia el interior de la hemocyte y acidifica a través de una serie de interacciones con lisosomas. En vitro y célula biología estudios en mamíferos células primarias han sido instrumentales en la identificación y caracterización de factores que regulan la fagocitosis, como los mamíferos receptor Fc gamma y receptores de C3b15,16. Sin embargo, se limita la capacidad para ejecutar grandes pantallas o en estudios in vivo en sistemas mamíferos.
Aquí presentamos un ensayo in vivo para la fagocitosis en moscas de la fruta adultas, que se basa en un procedimiento introducido por primera vez por el laboratorio de David Schneider en 200017. El laboratorio de Schneider demostró que los hemocitos sésiles agrupadas a lo largo de la nave dorsal abdominal fácilmente fagocitar bacterias y granos del poliestireno. Para visualizar la fagocitosis, moscas se inyectan con fluorescencia etiquetadas partículas (tales como e. coli marcados con isotiocianato de fluoresceína (e. coli -FITC)), se incubó por 30 minutos para dar tiempo de hemocitos a fagocitar las partículas y luego inyectado con trypan azul, que apaga la fluorescencia de las partículas no fagocitados durante el período de incubación. Los vasos dorsales mosca entonces son reflejados usando un microscopio fluorescente invertido. Este trabajo seminal, usando un experimento relativamente sencillo, demostrado que los hemocitos fagocitar bacterias y gotas de látex, fagocitosis bacteriana pueden ser inhibidas mediante la pre-inyección de vuela con gotas de látex, y que vuela sin celular y humoral las respuestas inmunes son susceptibles a e. coli. El análisis presentado en este informe se basa en el trabajo del laboratorio de Schneider para cuantificar la fagocitosis in vivo mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de las partículas por hemocitos de vaso dorsal asociada.
Similar a los planteamientos en sistemas mamíferos, Drosophila genetistas utilizan inicialmente genoma pantallas de ARNi en vitro para identificar los genes necesarios para la respuesta inmune celular18,19,20 ,21,22,23. Sin embargo, el desarrollo del ensayo de fagocitosis in vivo adultos permitieron experimentos seguimiento fácilmente realizarse en animales enteros, así permitiendo a los investigadores a verificar los biológicos el papel de los factores identificados en los estudios in vitro. Tal fue el caso con el receptor transmembrana Eater, que fue primero identificado como un receptor bacteriano en una pantalla de RNAi usando S2 células24 y entonces más adelante demostrado para mediar la Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, y fagocitosis de Staphylococcus aureus (S. aureus) en adultos25.
Nuestro laboratorio emplea el ensayo de fagocitosis in vivo en adelantados pantallas genéticas y estudios de Asociación de genoma completo (mediante el Panel de referencia genética de Drosophila (DGRP)) para identificar nuevos genes que regulan la fagocitosis en hemocitos de adultos. Estos estudios condujeron a la caracterización de los receptores PGRP-SC1A y PGRP-SA26, la vesícula intracelular trata de proteína Rab1427, el glutamato transportador Polifemo28, proteína de unión a RNA de Fox-129.
Esperamos que futuras pantallas incorporando la fagocitosis in vivo podrían conducir a la identificación de genes adicionales que son importantes para la inmunorespuesta celular en Drosophila. Pantallas con líneas endogámicas secuenciado completamente, como la DGRP o el recurso Drosophila de población sintética (DSPR), pueden identificar variantes naturales que afecta al desarrollo de la fagocitosis o hemocyte. Además, la técnica podría adoptada en otras especies de Drosophila o utiliza recursos de comunidad nueva pantalla, como la colección de 250 especies de Drosophila mantenida por la nacional Drosophila especie Stock Center (NDSSC ) en Cornell. Estos experimentos pueden llevarse a cabo utilizando marcada con fluorescencia bacteriano o fungicida pared biopartículas que están disponibles comercialmente o se pueden realizar usando cualquier número de especies bacterianas o por hongos – siempre que el microbio expresa marcadores fluorescentes .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

En todos los animales, inmunidad innata proporciona una defensa inmediata y robusta contra un amplio espectro de patógenos. Respuesta inmune humoral y celular son las ramas principales de la inmunidad innata, y muchos de los factores de regulación de estas respuestas están conservadas evolutivamente entre los invertebrados y mamíferos. Fagocitosis, el componente central de la inmunidad celular innata, es llevado a cabo por células de sangre especializadas del sistema inmune. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha emergido como un poderoso modelo genético para investigar los mecanismos moleculares y efectos fisiológicos de la fagocitosis en animales enteros. Aquí demostramos un ensayo de fagocitosis in vivo basado en la inyección para cuantificar la absorción de partículas y la destrucción de las células sanguíneas de la Drosophila , hemocitos. El procedimiento permite a los investigadores controlar con precisión la concentración de partículas y la dosis, lo que permite obtener resultados altamente reproducibles en un corto período de tiempo. El experimento es cuantitativo, fácil de realizar y se puede aplicar a la pantalla para los factores del huésped que reconocimiento de patógeno de influencia, la absorción y separación.

En figura 1Ase muestra un esquema del ensayo de fagocitosis in vivo usando partículas marcados con fluoresceína. Las moscas son montado lado ventral hacia abajo en un pedazo de cinta aislante y los dos primeros segmentos del abdomen, donde se encuentra el vaso dorsal, es claramente visible (figura 1B). Principales fuentes de error experimental se presentan en la inyección y proyección de imagen pasos del procedimiento (<stron...

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Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.

Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Este ensayo de fagocitosis in vivo permite a los investigadores realizar análisis genéticos y estudios de asociación en todo el genoma para identificar genes nuevos que regulan la fagocitosis en las células sanguíneas adultas. Este experimento es cuantitativo, fácil de realizar y se puede aplicar al cribado de animales vivos en busca de factores de acogida que influyen en el reconocimiento, la absorción y el aclaramiento de patógenos. Después de tirar de los capilares de vidrio de pared delgada con un tirador de aguja, utilice un micrómetro para sujetar la aguja bajo un microscopio y utilice pinzas de acero inoxidable de punta fina número cinco para romper la punta a un diámetro de punta de 100 micrómetros.Para medir el volumen de líquido que se inyectará en cada mosca, cargue una aguja capilar con colorante estéril de 5% alimentos en PBS, y expulse el líquido en una gota de aceite mineral en un micrómetro de etapa de 0,01 milímetros. Dispensar 10 microlitros de 1,6 miligramos por mililitro de partículas en un pequeño cuadrado de Parafilm, y tirar del líquido dentro de la aguja. Monte la aguja en la boquilla del inyector y forje las moscas anestesiadas a lo largo de su área designada en la almohadilla de mosca, del lado ventral hacia arriba, con las cabezas orientadas hacia la parte delantera de la almohadilla.Coloque los viales en las áreas correspondientes en el banco e inyecte las moscas en la esquina superior del abdomen con cinco bombas de 100 milisegundos de líquido para entregar alrededor de 10 nanolitros de partículas en total. Transfiera cada mosca al vial adecuado a medida que se inyecta, observando el tiempo en el vial. A continuación, cargue una nueva aguja con una solución 0.4%Trypan Blue, y ajuste el inyector neumático en privado, para permitir un flujo constante de aire para empujar el líquido fuera de la aguja.30 minutos después de la inyección inicial, inyectar cada abdomen de la mosca con Trypan Blue hasta que el abdomen esté lleno y distendido. Montar las moscas en diapositivas de microscopio con cinta eléctrica, lado ventral hacia abajo, empujando las alas hacia el lado de la mosca para asegurarlas a la cinta. A continuación, empuje suavemente la cabeza en la cinta para asegurarse de que la mosca no se moverá.Inmediatamente después de que todas las moscas han sido aseguradas, imagen de los insectos, uno a la vez, a un aumento de 25 o 32 veces en un microscopio de fluorescencia invertido conectado a una cámara digital y computadora, centrándose en el recipiente dorsal de cada mosca utilizando el software de computadora para la cámara digital. A continuación, registre el tiempo de exposición y el aumento entre los experimentos. Para cuantificar la fluorescencia, abra un programa de análisis de imágenes adecuado y abra una imagen.Para medir la intensidad de fluorescencia del recipiente dorsal, dibuje un polígono alrededor del recipiente dorsal y seleccione Medir para registrar la intensidad de fluorescencia dentro del polígono. Para determinar la intensidad de fluorescencia de fondo, copie el primer polígono y muévalo a un área adyacente al recipiente dorsal de cada mosca. A continuación, seleccione Medir y registre la intensidad de fluorescencia del área de fondo.Para normalizar la fluorescencia del vaso dorsal por la fluorescencia de fondo, después de medir las intensidades de fluorescencia del resto de las moscas, dividir la fluorescencia del vaso dorsal por la fluorescencia de fondo, y calcular la intensidad media de fluorescencia del vaso dorsal normalizado de todas las moscas en una sola cepa. Después de ser montado lado ventral hacia abajo en un pedazo de cinta eléctrica, los dos primeros segmentos del abdomen, donde se encuentra el vaso dorsal, son claramente visibles. Las fuentes clave de error experimental surgen en los pasos de inyección e imágenes del procedimiento.El uso de la misma aguja para inyectar varias moscas puede hacer que se obstruya con tejido mosca o partículas. Las moscas que no reciben suficiente fluorescencia de Trypan Blue brillantemente a lo largo de todo su abdomen, lo que puede reducir la relación del vaso dorsal con la fluorescencia de fondo, disminuyendo así la verdadera proporción de intensidad de fluorescencia del animal. Las moscas deben ser fotografiadas mientras están inmovilizadas por dióxido de carbono, ya que las moscas en movimiento activo producen imágenes borrosas que no se pueden cuantificar.Una línea mutante de la colección Zuker de moscas tratadas con metanoesulfonato etílico son incapaces de fagocitosis gram-negativa y gram-positiva bacterias y muestra casi ninguna fluorescencia del vaso dorsal en el ensayo de fagocitosis in vivo, emparejado con el fondo isogénico cepa Zuker y otra cepa común de control de laboratorio. Lleve un registro del tiempo y el orden en que se inyectan las moscas para asegurarse de que las moscas se encuentran en etapas comparables de reconocimiento y absorción de patógenos cuando se imagenn. Los mecanismos moleculares subyacentes a los defectos fagocíticos se pueden determinar mediante el estudio de hemocitos individuales con microscopía confocal o después de la clasificación celular activada por fluorescencia o por aislamiento magnético de cuentas de hemocitos adultos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Investigación

Inmunología e Infección

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

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La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

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Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

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La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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