Name: assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Yazarlar Dr Beth Gonzalez ve Dr Aprajita Garg içinde vivo fagositoz deneyleri yürüten destek için teşekkür ederiz. Bir UBV UMD önceden tohum Grant ve UMD NIH T32 eğitim hibeler, hücre ve moleküler biyoloji (SPK) ve ana bilgisayar-patojen etkileşimleri (HPI), bu eser finanse edilmektedir.

1. floresein parçacıklar enjeksiyon için hazırlayın
<ol><li>Piyasada bulunan, ısı-öldürüldü bakterilerin 10 mg sulandırmak floresein ile etiketli parçacıklar ( Tablo malzemelerigörmek) 990 µL steril 1 x PBS ve 10 µL 50 mM sodyum azid ekleyerek 10 mg/mL stok bir konsantrasyon için. Girdap karıştırmak için.<ol>
<li>Tek kullanımlık 8 µL aliquots 0.2 mL tüpler içine bölmek ve 4 ° C'de ışık ilişkili hassasiyeti en aza indirmek için karanlık bir kutu içinde saklayın. N...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li><li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila.">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li><li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein.">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li><li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+(PGRP)+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li><li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila.">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li><li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle/Toll/cactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults.">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li><li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila.">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li><li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recessive+mutation,+immune+deficiency+(imd),+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense.">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li><li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilablood+cells.">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li><li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase/cholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases.">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li><li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes.">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li><li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria.">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li><li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li><li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain.">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li><li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O&#8217;Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans.">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).</li><li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eater,+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila.">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila.">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li><li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li><li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , (1999).</li><li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zuker+collection:+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster.">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body.">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li><li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila.">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li></ol>

Piyasada bulunan, fluorescently etiketli parçacıklar fagositoz genel (0.2 µm karboksilat-modified mikroküreler) veya fagositoz mikroplar (fluorescently etiketli ısı - veya kimyasal olarak öldürdü bakteri veya Maya) değerlendirmek için kullanılır. Phagosome olgunlaşma değerlendirmek için araştırmacılar pH nötr asidik olduğu gibi phagolysosome inerse fluoresces pH duyarlı boya ile etiketli parçacıklar seçebilirsiniz. Alternatif olarak, fagositoz, patojen tanıma ve alımı ilk adımlar...

Doğuştan gelen bağışıklık savunma patojenik mikroplar karşı savunma ilk satırı oluşturur. Bu yanıtları ikisi de moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili1anlamda germline kodlanmış desen tanıma reseptörleri tarafından (PRRs) aracılı humoral ve hücresel doğuştan gelen bağışıklık işlevsel olarak ayrılabilir. Memeliler ve omurgasızlar, Yuvarlak solucanlar, Caenorhabditis elegans ve meyve sineği Drosophila melanogaster2gibi birçok sinyal yollar ve doğuştan gelen bağışıklık efektör mekanizmaları korunmuş. Meyve sineği bulaşıcı mikroorganizmaların3karşı ana savunma eğitim için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila kolay ve ucuz laboratuvarlarda, yetiştirilen genetik olarak uysal ve kısa oluşturma süresi vardır. Ayrıca, meyve sineği mikroplar, ana bilgisayar dokunulmazlık viral, bakteriyel, mantar veya parazit patojenlere karşı incelenmesi etkinleştirme bir dizi karşı son derece etkili savunma sergiler.
Drosophila immunologists tarihsel olarak ileri genetik ekranlar, böcek hücre satırları filtreleme ve doğuştan gelen bağışıklık-önde gelen incelemek için sinek mutant suşları önceden varolan genom çapında RNA-aracılı girişim (RNAi) kullanılan kimlik ve karakterizasyonu birkaç örümceklerle korunmuş humoral bağışıklık yolları4,5,6,7,8. Humoral doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, tartışmalı, en iyi meyve sinekleri bağışıklık savunma ile karakterizedir. Enfeksiyon, humoral yanıt üretim ve antimikrobiyal peptid sistemik sürümü (AMP) molekülleri içine hemolymph, kan içinde böcekler eşdeğer yol açar. Amper son derece korunmuş otoyol ve yolları sinyal IMD tarafından üretilmektedir. Toll yolu, sinyal memeli için homolog TLR/IL-1R reseptör ve IMD yolu memeli tümör nekrozis faktör-Alfa sinyal için homolog. Drosophila, otoyol sinyal gram-pozitif bakteriler, mantarlar ve Drosophila X virus6,9,10 tarafından indüklenen olduğu ve IMD sinyal Ayagin Gram-negatif bakteriler11 tarafından indüklenen ,12.
Hücresel bağışıklık, kapsülleme, melanization ve fagositoz invaziv patojenlerin oluşan özel kan hemocytes13denilen hücreler tarafından yürütülmektedir. Hemocytes meyve sineği içinde üç sınıf vardır: Kristal hücreleri, lamellocytes ve plasmatocytes13. Larva dolaşımdaki hemocytes % 5 makyaj, kristal hücrelerin patojenler ve ana bilgisayar doku yara sitelerdeki melanization önde gelen proPhenoloxidase (proPO) enzimler serbest bırakın. Normalde sağlıklı embriyo veya larva bulunmayan, Lamellocytes yabancı nesneler kapsülleyen yapisan hücrelerdir. Bu hücreler üzerine pupariation veya parasitizing arı yumurta larva yatırılan zaman indüklenir. Larva hemocytes ve tüm kalan hemocytes erişkinlerde dolaşan % 95 makyaj, fagositik plasmatocytes geliştirme sırasında remodeling doku bir rol oynamaktadır ve özellikle, Drosophila hücresel bağışıklık ana efektör hücresi olarak hizmet vermektedir.
Fagositoz bir acil ve çok önemli savunma hattı, doğuştan gelen bağışıklık; ana bilgisayar epitel bariyeri mikroplar hızlı bir şekilde sardı ve fagositik kan hücreleri tarafından elimine (hücre biyolojisi fagositoz, kapsamlı bir inceleme için bkz: başvuru 14). Germline kodlanmış örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) hemocytes tarihinde patojen tanıması mikroplar moleküler desenleri (PAMPs) ilişkili zaman bu işlemi başlatılır. Bir kez hedeflerine bağlı, PRRs aktin sitoiskeleti remodeling aracılığıyla pseudopods oluşumu neden sinyal cascades başlatın. Pseudopods hangi daha sonra sardı ve doğmakta olan organel, phagosome içselleştirilmiş mikrop, surround. Phagosome hemocyte iç doğru insan ticareti ve etkileşimleri organellerin ile bir dizi acidifies phagosome phagosome olgunlaşma süreci uğrar gibi mikropların yok edilir. Vitro ve hücre memeli Primer hücre biyolojisi çalışmalarında ve fagositoz, memeli Fc-gama reseptör ve C3b reseptörleri15,16gibi düzenleyen faktörler karakterize vesile olmuştur. Yine de, büyük ölçekli ekranları veya içinde vivo çalışmalar yürütme yeteneğini memeli sistemlerinde sınırlıdır.
Burada içinde vivo bir tahlil için ilk David Schneider laboratuvarda 200017tarafından tanıtılan bir yordam temel fagositoz yetişkin meyve sinekleri içinde mevcut. Schneider laboratuvar sesil hemocytes karın sırt gemi kolayca kümelenmiş polistren boncuk ve bakteri phagocytose gösterdi. Fagositoz görselleştirmek için sinekler (örneğin floresein isothiocyanate ile (E. coli -FITC) etiketli E. coli ), fluorescently etiketli parçacıkları ile enjekte edilir parçacıkları, yutmak için hemocytes zaman izin vermek 30 dakika boyunca inkübe ve sonra Kuluçka döneminde değil fagosite parçacıklar Floresans quenches trypan mavi, enjekte. Sinek dorsal damarları sonra ters bir floresan mikroskop kullanarak yansıma. Seminal bu kağıt hemocytes bakteri phagocytose ve lateks boncuklar, bu bakteri fagositoz önceden enjekte edilerek inhibe olabilir gösterdi nispeten basit bir deney kullanarak lateks boncuk ile gider ve bu hem hücresel ve humoral olmadan uçar bağışıklık yanıtı bile E. coliiçin açıktır. Bu raporda sunulan tahlil içinde vivo fagositoz dorsal gemi ilişkili hemocytes tarafından yuttu parçacıklar floresan yoğunluğu ölçme ölçmek için Schneider laboratuvar çalışmalarını kurar.
Benzer şekilde yaklaşım memeli sistemlerinde alınan, Drosophila genetikçileri başlangıçta genom genelinde kullanılan tüp bebek RNAi ekranlar hücresel immün yanıt18,19için,20 gerekli genlerin tanımlamak için ,21,22,23. Ancak, Yetişkin içinde vivo fagositoz tahlil gelişimi izleme denemeleri kolayca böylece biyolojik doğrulamak için araştırmacılar içinde vitro çalışmalarda tespit faktörler rol izin tüm hayvanlarda gerçekleştirilebilmesi etkin. Böyle transmembran reseptör yiyen, ilk24 S2 kullanarak bir RNAi ekranında bakteriyel bir reseptör hücreleri olarak tanımlanan ve Escherichia coli (e.coli), enterokok arabuluculuk için daha sonra gösterilen olduğu faecalistir, ve Staphylococcus aureus (S. aureus) fagositoz yetişkin25.
Laboratuarımızın içinde vivo fagositoz tahlil ileri genetik ekranlar ve genom çapında dernek çalışmaları ( Drosophila genetik başvuru Masası (DGRP) kullanarak) Yetişkin hemocytes fagositoz düzenleyen yeni genlerin tanımlamak için istihdam. Bu çalışmalar için karakterizasyonu reseptörleri PGRP-SC1A ve PGRP-SA26, protein Rab1427, Glutamat ışınlama Polyphemus28ve RNA-bağlayıcı protein Fox-129kaçakçılığı hücre içi vezikül yol açtı.
Biz gelecekte ekranlar içinde vivo fagositoz birleşmeyle Drosophilahücresel bağışıklık yanıtında için önemli ek genler tanımlaması yol açabileceğini tahmin. DGRP veya Drosophila sentetik nüfus kaynak (DSPR), gibi tam olarak sıralı doğuştan hatlarını kullanarak ekranlar fagositoz ya da hemocyte geliştirme etkileyen doğal türevleri tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, teknik Drosophila diğer türler içinde kabul veya olabilir ekran yeni topluluk kaynaklarına, ulusal Drosophila tür stok Merkezi (NDSSC tarafından tutulan 250 Drosophila türler topluluğu gibi kullanılan ) Cornell'de. Bu deneyler ticari olarak kullanılabilir fluorescently etiketli bakteri veya duvar mantar bioparticles kullanarak yürütülen olabilir veya bakteriyel veya mantar türleri-mikrop floresan işaretleri ifade sağlanan herhangi bir sayıda kullanarak yapılamaz .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2&#956;m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8810</td>
			<td>Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5430-10 PicoNozzle Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-10</td>
			<td>Holder for 1.0mm pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E13231</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E23370</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2861</td>
			<td>Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35361</td>
			<td>Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10010</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump PV820</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid &#8211; allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables &#8211; the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms &#8220;TIMED&#8221; mode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23371</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S23372</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2851</td>
			<td>Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-3</td>
			<td>Needles for injection. OD = 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23373</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z23374</td>
			<td>Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2841</td>
			<td>Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the cellular immune response of the fruit fly, drosophila melanogaster, using an in vivo phagocytosis assay

Bütün hayvanlarda doğuştan gelen bağışıklık patojenler geniş bir yelpazede karşı acil ve sağlam bir savunma sağlar. Humoral ve hücresel immün yanıt-e doğru doğuştan gelen bağışıklık ana dallar ve birçok bu yanıtları düzenleyen etkenler örümceklerle omurgasızlar ve memeliler arasında korunmuş. Fagositoz, Merkezi bileşeni hücresel doğuştan gelen bağışıklık, bağışıklık sisteminin özel kan hücreleri tarafından yapılır. Meyve sineği Drosophila melanogaster, moleküler mekanizmaları ve fagositoz bütün hayvanlarda fizyolojik etkilerini araştırmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada parçacık alımı ve imha Drosophila kan hücreleri, hemocytes tarafından ölçmek için bir enjeksiyon tabanlı içinde vivo fagositoz tahlil göstermektedir. Yordamı araştırmacılar tam parçacık konsantrasyonu ve doz, son derece tekrarlanabilir sonuçlar kısa bir miktarda elde etmek mümkün hale kontrolü sağlar. Deneme nicel, gerçekleştirmek, kolay ve ana faktörler için ekran o etkisi patojen tanıma, alımı ve izni için uygulanabilir.

Fluoresein etiketli parçacıkları kullanma içinde vivo fagositoz testin bir şematik şekil 1Aile gösterilir. Sinekler takılı ventral yan aşağı Elektrik bandı bir parçası üzerinde ve dorsal gemi konumlandırıldığı, karın, ilk iki kesimi açıkça görülebilir (şekil 1B). Anahtar kaynakları deneysel hata enjeksiyon ve yordamın (şekil 1 c) adımını Imaging ortaya. Birden çok s...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Bu in vivo fagositoz tahlili, araştırmacıların yetişkin kan hücrelerinde fagositozdüzenleyen yeni genleri belirlemek için genetik ekranlar ve genom çapında ilişki çalışmaları yürütmek için izin verir. Bu deney niceldir, gerçekleşebilir ve patojen tanıma, alım ve temizliği etkileyen konak faktörleri için canlı hayvanların taranmasına uygulanabilir. Bir iğne çekmeceile ince duvarcam kılcal paralar çektikten sonra, bir mikrometre bir mikroskop altında iğne tutmak için bir mikrometre kullanın ve 100 mikrometre ucu çapı ucu kırmak için beş numara, ince nokta, paslanmaz çelik cımbız kullanın.Her sinek içine enjekte edilecek sıvı hacmini ölçmek için, PBS steril% 5 gıda boyama ile bir kılcal iğne yük ve 0.01 milimetrelik sahne mikrometre mineral yağ bir damla üzerine sıvı dışarı atmak. Mililitre parçacıkbaşına 10 mikrolitrelik 1.6 miligramı Parafilm'in küçük bir karesine dağıtın ve sıvıyı iğnenin içine çekin. İğneyi enjektör başlığına yerleştirin ve anesteziye dayalı sinekleri sineklikte belirlenen alan boyunca, havalandırma tarafını yukarı, kafaları yastığın önüne doğru yönlendirerek hizaya getirin.Şişeleri banktaki ilgili alanlara yerleştirin ve toplam 10 nanolitre partikül sağlamak için karının üst köşesindeki sinekleri beş, 100 milisaniyelik sıvı pompalarıyla enjekte edin. Her sinek enjekte edilir gibi uygun şişe içine transfer, şişe üzerinde zaman belirterek. Daha sonra, %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin ve pnömatik enjektörü, sıvıyı iğneden dışarı itmek için sabit bir hava akışını sağlamak için kapılı olarak ayarlayın.İlk enjeksiyondan 30 dakika sonra, karınlar dolana ve şişmiş olana kadar her sinek karnına Trypan Mavisi enjekte edin. Sinekleri elektrik bandı ile mikroskop kaydıraklarına monte edin, ventral tarafı aşağı, kanatları sineğin kenarına iterek onları banta sabitleyin. Daha sonra, sineğin hareket etmeyeceğine emin olmak için başı yavaşça teybin içine itin.Hemen sonra tüm sinekler güvenli, görüntü böcekler, birer birer, bir dijital kamera ve bilgisayara bağlı ters floresan mikroskobu üzerinde 25 veya 32 kez büyütme, dijital kamera için bilgisayar yazılımı kullanarak her sinek sırt gemisi odaklanarak. Ardından, pozlama süresini ve deneyler arasındaki büyütmeyi kaydedin. Floresan ölçmek için uygun bir görüntüleme analiz programı açın ve bir görüntü açın.Sırt damarının floresan yoğunluğunu ölçmek için, sırt damarının etrafına bir poligon çizin ve poligon içindeki floresan yoğunluğunu kaydetmek için Ölçü'ü seçin. Arka plan floresan yoğunluğunu belirlemek için, ilk çokgenkopyalayın ve her sinek sırt damarı bitişik bir alana taşıyın. Ardından, Ölçü'ü seçin ve arka plan alanının floresan yoğunluğunu kaydedin.Sırt damarı floresansını arka plan floresansı ile normalleştirmek için, sineklerin geri kalanının floresan yoğunluklarını ölçtükten sonra, sırt damarı floresansını arka plan floresansına bölün ve tüm sineklerin ortalama normalleştirilmiş sırt damarı floresan yoğunluğunu tek bir süzme içinde hesaplayın. Bir elektrik bandının üzerine ventral tarafı aşağı monte edildikten sonra, dorsal damarın bulunduğu karının ilk iki bölümü açıkça görülebilir. Deneysel hatanın temel kaynakları prosedürün enjeksiyon ve görüntüleme adımlarında ortaya çıkar.Birden fazla sinek enjekte etmek için aynı iğneyi kullanmak, sinek dokusu veya parçacıkları ile tıkanmasına neden olabilir. Tüm karın boyunca parlak bir şekilde yeterli Trypan Mavi floresan almayan sinekler, sırt damarının arka plan floresanlarına oranını azaltarak hayvanın gerçek floresan yoğunluk oranını düşürür. Aktif olarak hareket eden sinekler ölçülemeyen bulanık görüntüler ürettiği için, sinekler karbondioksit tarafından hareketsiz hale getirilirken fotoğraflanmalıdır.Etil metansülfonat ile tedavi sineklerin Zuker koleksiyonundan bir mutant hattı gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerfagositoz ve in vivo fagositoz testi neredeyse hiç dorsal damar floresan görüntüler, izojenik arka plan Zuker suşu ve başka bir ortak laboratuvar kontrol suş eşleştirilmiş. Sineklerin görüntülendiğinde patojen tanıma ve alımının karşılaştırılabilir aşamalarında olduğundan emin olmak için sineklerin enjekte edildiği zamanı ve sırayı takip edin. Fagositik defektlerin altında yatan moleküler mekanizmalar konfokal mikroskopi ile tek hemositler incelenerek veya floresan aktive hücre ayrıştırması sonrası veya erişkin hemositlerin manyetik boncuk izolasyonu ile belirlenebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...