Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها الرابطة الأمريكية لمنح "الدراسة ذروة أمراض الكبد" (ل N.R.) والمعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي (جوائز P30 DK34933 N.R.، DK062041 P01 إلى J.L.M.). ونحن نشكر الدكتور رامون أوكاديز رويز (جامعة ميشيغان) لمساعدته مع تطوير هذه المنهجية.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة ميتشجان".
1-إعداد المعدات والمواد اللازمة لعزل أهبد الماوس
<ol><li>إعداد متوسطة البذر والغسيل المخزن المؤقت (جدول المواد) في 50 مل أنابيب مخروطية والاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية ?...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

ويصف هذا العمل إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد للماوس تشولانجيوسيتيس أهبد أورجانوتيبيك. وتشمل الخطوات الهامة في توليد ثقافة عبدو تشريح عبد دقيق لتفادي التلوث خلية البنكرياس، الحفاظ على ظروف معقمة لمنع التلوث البكتيرية والفطرية، والتلاعب بعناية بعد الطرد المركزي لتجنب فقدان المواد الخلوية. م...

تشولانجيوباثيس هي اضطرابات تقدمية المزمنة المستعصية التي تؤثر على خلايا الصفراوية الموجودة في داخلها والقنوات الصفراوية اكستراهيباتيك (اهبدس)1. بعض تشولانجيوباثيس، مثل التهاب الأوعية الصفراوية المصلب، cholangiocarcinoma والكبدية الصفراوية والخراجات تشوليدوتشال، يؤثر في الغالب اهبدس. تطوير علاجات تشولانجيوباثيس مقيد بمحدودية توافر نماذج الإكلينيكية. وباﻹضافة إلى ذلك، ركزت الدراسات السابقة على تشولانجيوباثيس التي تم تجميعها معا: الكبد وداخلها، واهبدس. ومع ذلك، داخل اهبدس ذات منشأ جنينية متميزة و، وبالتالي، ينبغي أن تعتبر الأمراض الجزيئي متميزة. القناة الصفراوية أحياناً وضع لوحات الأقنية أحياناً وجزء الجمجمة من رتج الكبد، ووضع اهبدس كله من الجزء والذيلية ل الكبد رتج2. كما أنها تعتمد على السلف مختلفة الخلية مقصورات للتوازن الكبار، بما في ذلك قنوات هيرينغ في القناة الصفراوية أحياناً والغدد بيريبيلياري في اهبدس2،3. استخدام نماذج حيوانية للدراسات الإكلينيكية محدود بالمصروفات وينبغي تدنية لأسباب أخلاقية. ومن ثم، اختزالية، استنساخه، الوقت وفعالة من حيث التكلفة من نماذج في المختبر مرغوب فيه للغاية.
استخدمت معظم الدراسات السابقة من تشولانجيوباثيس الماوس العادي أو نماذج سرطان الفئران، أو خطوط الخلايا البشرية cholangiocarcinoma المستمدة من داخلها واهبدس4،5،،من67. ومع ذلك، هذه نماذج خلايا المحولة ولا الخص البيولوجيا تشولانجيوسيتي العادي في التوازن، أو في حالة صحية. أتاح التقدم الذي أحرز مؤخرا في وضع نماذج الثقافة أورجانوتيبيك لتطوير هياكل ثلاثية الأبعاد من أنواع الأنسجة المختلفة، بما في ذلك أنسجة الكبد، على الرغم من أن الماوس العادية لا، اهبدس،من89 10. هذه الهياكل "مثل جهاز" تهدف إلى محاكاة الأنسجة الأولية وتزرع في مكانة مصطنعة دعم التجديد الذاتي ل الخلايا الجذعية/السلف الخاصة بالجهاز11.
"أورجانويد" مصطلح واسع أن معظم عادة يصف نماذج ثلاثية الأبعاد 3-الأنسجة المستمدة من الخلايا الجذعية. أورجانويدس يمكن أن تتولد من أعيدت برمجتها pluripotent الخلايا الجذعية ممثلة بالخلايا الجذعية الجنينية والتي يتسبب فيها الخلايا الجذعية pluripotent. كما أنها يمكن أن تتولد من الخلايا الجذعية الخاصة بالجهاز12. لقد تم اقتراح بعض نماذج أورجانويد تشولانجيوسيتي في الدراسات البحثية السابقة. وهكذا، أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية وقد تم الإبلاغ عن7،،من913 وتوفير أداة فعالة قيمة، وقت أن يسمح لجيل واحد من أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، لا تعكس هذه أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent تماما على هيكل ووظائف من الابتدائي تشولانجيوسيتيس عبد الكبار.
أورجانويدس المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية9 وكما اقترح الماكر10 الكبد. نماذج الماكر ليست متاحة على نطاق واسع وتكون محدودة عتاد أداة لأغراض الدراسة. وعلاوة على ذلك، لا نموذج تلك المستمدة من الكبد الكبار المستمدة من الخلايا الجذعية أورجانويدس تشولانجيوسيتيس اكستراهيباتيك ولكن تشولانجيوسيتيس بدلاً من ذلك أحياناً.
أبلغ عبد أورجانويد جيل من الإنسان العادي اهبدس14 والفأر عبد تشولانجيوكارسينوما15. بيد الوصول إلى الأنسجة البشرية أهبد محدودة للغاية، وأورجانويدس المستمدة من نموذج موريني وراثية cholangiocarcinoma15 لا تمثل الأحياء تشولانجيوسيتي صحية في التوازن والمشتقة من خلايا معدلة وراثيا.
لمعالجة قيود pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية والكبد تشولانجيوسيتي أورجانويد نماذج ومحدودية الوصول إلى الأنسجة البشرية اللازمة في نماذج الإكلينيكية، قمنا بتطوير نموذج أورجانويد عبد مورين (الشكل 1A). ويصف هذه المخطوطة تطوير تقنية للماوس أورجانويدس أهبد المستمدة من أنسجة البالغين. سوف تكون هذه أورجانويدس عبد اسمه ابدوس أداة هامة في المختبر لدراسة الآليات التي تقوم عليها عمليات التوازن ومرض اهبدس تشولانجيوسيتي، مثل تشولانجيوباثيس.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

تشولانجيوباثيس، التي تؤثر على القناة الصفراوية اكستراهيباتيك (اهبدس)، تتضمن الكبدية الصفراوية والتهاب الأوعية الصفراوية المصلب cholangiocarcinoma. لديهم لا الخيارات العلاجية الفعالة. أدوات لدراسة عبد محدودة جداً. وكان هدفنا وضع نموذج تشولانجيوسيتي المستمدة من الخلايا الجذعية، والاكلينيكية الخاصة بالجهاز، وتنوعاً، والكبار التي يمكن إنشاؤها بسهولة من نوع البرية والفئران المهندسة وراثيا. وهكذا، نحن تقرير عن تقنية الرواية من وضع نظام ثقافة عبد أورجانويد (عبدو) من اهبدس الماوس الكبار. هذا النموذج فعالة من حيث التكلفة، وقادرة على سهولة تحليلها، ولها تطبيقات متعددة المتلقين للمعلومات. على وجه التحديد، يمكننا وصف المنهجية للماوس عبد العزلة والانفصال من خلية مفردة وبدء الثقافة أورجانويد، والدعوة، والصيانة على المدى الطويل وتخزين. كما توضح هذه المخطوطة اهبدو معالجة إيمونوهيستوتشيميستري ومجهر فلوري كوانتيتاتيون وفرة مرناً بالنسخ العكسي الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرت-PCR). هذا البروتوكول له مزايا كبيرة بالإضافة إلى إنتاج أورجانويدس عبد على حدة. استخدام وسيلة مكيفة من الخلايا L-تحذير يقلل كثيرا من تكلفة هذا النموذج. ويوفر استخدام الماوس اهبدس الأنسجة غير محدود تقريبا لتوليد ثقافة، خلافا للأنسجة البشرية. ابدوس الماوس الذي تم إنشاؤه يحتوي على عدد سكان نقية من الخلايا الظهارية مع علامات السلف اندوديرمال ومتباينة الخلايا الصفراوية. أورجانويدس مثقف الحفاظ على مورفولوجيا متجانسة من خلال ممرات متعددة، ويمكن استردادها بعد فترة تخزين طويلة الأجل في النتروجين السائل. هذا النموذج يسمح لدراسة انتشار الخلايا السلف الصفراوية ويمكن التلاعب بها عقاقيري، ويمكن إنشاؤها من الفئران المهندسة وراثيا. الدراسات المستقبلية مطلوبة لتحسين ظروف الثقافة من أجل زيادة الكفاءة والطلاء، وتقييم نضج الخلايا الوظيفية، وتمايز الخلية مباشرة. تطوير نماذج الثقافة المشتركة ومصفوفة محايدة أكثر بيولوجيا الخلية أيضا مرغوب فيه.

لدينا بروتوكول وصف جيل أورجانويدس عبد الماوس الخاصة بالانسجة والكبار المستمدة من الخلايا الجذعية. بعد تستزرع في أورجانويدس، وتشكيل هيكل الكيسي يمكن ملاحظة لها في أقرب وقت بعد أن عزلة أهبد يوم 1. التلوث مع الليفية لا يحترم عادة خلال جيل الثقافة. عبدو تصفيح الكفاءة هو حوال?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

ويصف هذا البروتوكول إنتاج نظام ثلاثي الأبعاد أورجانويد القناة الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس. يمكن الاحتفاظ بهذه أورجانويدس الصفراوية في الثقافة لدراسة البيولوجيا تشولانجيوسيتي. التعبير عن علامات للسلف والخلايا الصفراوية الصفراوية أورجانويدس وتتكون من الخلايا الظهارية الاستقطاب.

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

هذا مورين خارج القناة الصفراوية القناة الجهازية النظام يمكن معالجة الوصول المحدود إلى نماذج قبل الظهر cholangiopathies والقيود المفروضة على الخلايا الجذعية متعددة القدرات والكبد المستمدة من نماذج الجهازية cholangiocyte. نموذجنا هو البالغين الأنسجة محددة، الاختزال، استنساخ، والوقت وفعالة من حيث التكلفة. وسيكون له فائدة خاصة للمختبرات التي لا يمكن الوصول إلى الأنسجة البشرية.يسمح أسلوبنا زراعة عدد غير محدود تقريبا من cholangiocycytes القناة الصفراوية خارج القناة لدراسة تجديد الأنسجة والتفاعلات من خلية إلى خلية. إثبات الإجراء سيكون جونيا شيوتا، طبيبة ما بعد الدكتوراه من مختبري. بالنسبة لعزل القناة الصفراوية داخل الجسم، ضع الفأر البالغ في موضع الضم وفتح تجويف البطن على طول خط الوسط.سحب الكبد للراحة على الحجاب الحاجز واستخدام الهيموستات لسحب بلطف الاثني عشر القريبة للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة مباشرة تحت هيلوم الكبد. استخدم مشرط لفصل القناة الصفراوية خارج الجسم عن الأنسجة المحيطة. عقد الطرف القريب من القناة الصفراوية المشتركة مع ملقط، تشريح القناة distally فقط فوق منعطفها مع الاثني عشر قبل تشريح الطرف القريب من القناة من الكبد.ضع القناة الصفراوية الخارجية المعزولة على الفور في لوحة زجاجية تحتوي على عازلة الغسيل البارد على الجليد ، ثم قم بتنظيف القناة الصفراوية من الأنسجة المحيطة وينخرم في أقسام 0.5 ملليمتر. عندما تم مفرم جميع الأنسجة، ونقل المقاطع إلى أنبوب يحتوي على 500 ميكرولترات من العازلة للتفكك لمدة 20 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الانفصام، تحييد العازلة مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة ثقافة الخلايا المتوسطة triturate تعليق الأنسجة 20 مرة من خلال إبرة 18 قياس ومن ثم 20 مرة من خلال إبرة 20 قياس.ثم قم بتصفية تعليق الخلية الناتجة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. لإقامة ثقافة الجهاز الصفراوية، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإزالة بعناية ناطور. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من الجليد الباردة، برنامج تلفزيوني عقيم ونقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر للطرد المركزي الثاني.Resuspend بيليه غسلها في 120 microliters من السيل، والجليد الباردة مصفوفة الطابق السفلي ولوحة 40 ميكرولترات من الخلايا في وسط كل من ثلاثة آبار من 37 درجة مئوية الدافئة، 24 جيدا لوحة، ثم وضع لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. عندما مصفوفة الطابق السفلي قد توطدت، إضافة 600 ميكرولترات من 37 درجة مئوية البذور المتوسطة لكل بئر قبل إعادة لوحة إلى الحاضنة. بعد ثلاثة أيام وكل ثلاثة أيام بعد ذلك، استبدال المتوسطة البذر مع 600 ميكرولترات من وسط الثقافة العضوية الطازجة، ورصد النمو العضوي بانتظام مع المجهر المقلوب.لتمرير الثقافات القناة الصفراوية خارج الكبد، ماصة organoids في كل بئر مع 400 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني 10 مرات في البئر قبل نقل محتويات البئر إلى أنابيب 1.5 ملليلتر الفردية. مرور كل خليط من خلال إبرة 25 قياس أربع مرات لتفكك organoids وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة تعليق الخلايا في مصفوفة الطابق السفلي في نسبة مناسبة لإعادة الطلاء.لتخزين القناة الصفراوية خارج المدى، يغسل كل بئر من organoids مع PBS درجة حرارة الغرفة دون إزعاج قطرات مصفوفة الطابق السفلي وإضافة 500 ميكرولترات من الجليد الباردة تجميد المتوسطة لكل بئر. إعادة بناء الأعضاء بلطف ونقل الخليط إلى قوارير مبردة فردية، ثم ضع القنينات في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل نقل الأعضاء إلى خزان النيتروجين لتخزين على المدى الطويل في مرحلة بخار. لإعداد organoids embedding البارافين، استبدال المتوسطة مع 500 ميكرولتردات من أربع درجات مئوية PBS ونقل التعليق من كل بئر إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر تحتوي على مصفوفة الطابق السفلي المسال.جمع organoids عن طريق الطرد المركزي واستخدام تلميح P1000 ماصة معدلة لإزالة بعناية عظمى دون إزعاج الكريات. ثم إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة، 4٪ شبه شكلي إلى organoids لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، استبدل التثبيت بميليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة PBS لاحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل الأعضاء عن طريق الطرد المركزي ثلاث مرات.بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق organoids في ملليلتر واحد من 30٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة، تليها حضانة لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. في نهاية 70٪ من حضانة الإيثانول، وجمع organoids عن طريق الطرد المركزي و resuspend organoids في ملليلتر واحد من 100٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية 100٪ من حضانة الإيثانول، وحرارة عينة معالجة هلام في الميكروويف لمدة 20 ثانية أو حتى السيل، وإضافة 50 ميكرولترات من هلام السيل إلى كل أنبوب من organoids.ضع الأنابيب على الجليد حتى يتم ترسيخ هلام معالجة العينة ونقل قطرة organoids من كل أنبوب إلى ما بين منصات الإسفنج الزرقاء في كاسيت لمزيد من المعالجة في تضمين البارافين. ضع الكاسيت في معالج الأنسجة المبرمج لمدة 15 دقيقة لكل خطوة ، ثم قسم العضوية المضمروسة في هلام معالجة العينات في أربعة ميكرومتر لكل قسم من أجل التلطيخ الكيميائي المناعي والتحليل وفقًا للبروتوكولات القياسية. خارج الكبدية القناة الصفراوية كفاءة الطلاء الجهازي هو ما يقرب من 2٪عندما معزولة عن الفئران إما حديثي الولادة أو الكبار.بعد مرور اثنين، وكفاءة الطلاء من organoids القناة الصفراوية خارج الجسم المشتقة من الفئران الكبار يزيد إلى 11٪، وتبقى مستقرة. غالبية organoids تظهر مورفولوجيا الكيسية في جميع أنحاء جميع الممرات مع organoids نادرة غير منتظمة. وتصل العضيات إلى ذروة النمو في خمسة إلى سبعة أيام، وبعد ذلك تبدأ في تراكم الحطام داخل الالوان وتتدهور.لذلك ، للحفاظ على الثقافة العضوية ، يجب تقسيم الأعضاء كل سبعة إلى 10 أيام. عندما يتم تحليلها مع الفلوروس المناعي ، تتكون العضوية الصفراوية خارج القناة من مجموعة نقية من الخلايا الظهارية التي تتميز بـ E-cadherin. تظهر الخلايا العضوية أيضًا علامات خلايا السلف الصفراوية وكذلك علامات التمايز الصفراوي.الأهم من ذلك، نسبة عالية من الخلايا العضوية تمتلك سيليوم الأولية التي تميزت أسيتيلات ألفا Tubulin، وهو سمة من سمات cholangiocytes العادية ويقترح الاستقطاب الخلايا العضوية المناسبة. مطلوب الالتزام الوثيق بحالة درجة الحرارة الموصوفة. تشريح القناة الصفراوية الدقيقة يمنع تلوث خلايا البنكرياس.يمكن تجنب فقدان المواد الخلوية عن طريق التلاعب الدقيق بعد الطرد المركزي. ويمكن استخدام هذه العضيات كنماذج قبل الفحص، يتم التلاعب بها وراثياً ودوائياً، أو استخدامها لاختبار المخدرات وآثار العوامل المعدية. يمكن استخدام هذه الطريقة من قبل المختبرات التي ترغب في الاستفادة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لمواصلة دراسة آليات بيولوجيا cholangiocyte.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

تحديد كثافة القناة الصفراوية في كبد الفأر

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

جيل من الأرغن مامري الفسيفساء عن طريق التربسينات التفاضلية

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

جيل وثقافة Organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

جيل من 3D الجهازيات الرئة الكاملة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لنمذجة البيولوجيا التنموية الرئة والمرض

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...