Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den amerikanske Association for undersøgelse af lever sygdomme Pinnacle award (til Nielsen) og National Institutes of Health, nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyresygdomme (awards P30 DK34933 til Nielsen, P01 DK062041 til J.L.M.). Vi takker Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) for hans hjælp til udviklingen af denne metode.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af The University of Michigan.
1. fremstilling af udstyr og materialer til mus EHBD Isolation
<ol><li>Forberede seeding medium og vask buffer (Table of Materials) i 50 mL koniske rør og holde dem ved 4 ° C eller på is indtil brug.</li>
	<li>Oprette en kirurgisk tabel (figur 1B). Forberede steriliseret kirurgiske instrumenter (<strong class="xfi...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Dette arbejde beskriver generation af en organotypic 3-dimensional model af mus EHBD cholangiocytes. Vigtigt skridt i EHBDO kultur generation omfatter omhyggelige EHBD dissektion for at undgå bugspytkirtlen celle kontaminering, vedligeholdelse i sterile forhold at undgå bakterie- og svampeinfektioner forurening og omhyggelig manipulation efter centrifugering at undgå den tab af cellulære materiale. Der kræves en nøje overholdelse af beskrevet temperaturforhold. Der er nogle begrænsninger for teknikken. EHBDs af vo...

Cholangiopathies er uhelbredelig kronisk progressive lidelser, der påvirker biliær celler beliggende i intra- og ekstrahepatisk galdeveje kanalerne (EHBDs)1. Nogle cholangiopathies, som primær skleroserende cholangitis, leverkræft, biliær atresi og choledochal cyster, påvirker overvejende EHBDs. Udviklingen af terapier for cholangiopathies er begrænset af de begrænsede mængder af prækliniske modeller. Derudover tidligere undersøgelser fokuseret på cholangiopathies grupperet sammen: lever, intra- og EHBDs. Dog intra- og EHBDs har en særskilt embryonale oprindelse og, derfor, bør betragtes som særskilte molekylære patologier. Intrahepatisk galdegangene udvikle fra intrahepatisk duktalt pladerne og den kranielle del af hepatisk divertikel, hele EHBDs udvikle sig fra den caudale del af hepatisk divertikel2. De er også afhængige af forskellige stamfader celle rum til voksen homøostase, herunder kanaler af Hering i intrahepatisk galdegangene og peribiliary kirtler i EHBDs2,3. Brug af dyremodeller for prækliniske undersøgelser er begrænset af udgift og skal være minimeret af etiske grunde. Reduktionistisk, reproducerbar, tid og omkostninger-effektiv in vitro-modeller er derfor meget ønskeligt.
De fleste tidligere undersøgelser af cholangiopathies udnyttede normal mus eller rotte kræftmodeller eller menneskelige leverkræft cellelinjer udvundet af intra- og EHBDs4,5,6,7. Men disse er modeller af transformerede celler og sammenfatte ikke normale cholangiocyte biologi på homøostase eller i en sund tilstand. De seneste fremskridt i udviklingen af organotypic kultur modeller har tilladt udvikling af 3-dimensionelle strukturer fra forskellige vævstyper, herunder hepatobiliære væv, men ikke normal mus EHBDs8,9, 10. Disse "orgel-lignende" strukturer sigter mod at efterligne primære væv og dyrkes i en kunstig niche støtte selvfornyelse orgel-specifikke stilk/stamfader celler11.
"Organoid" er en bred sigt der mest almindeligt beskriver 3-dimensionelle væv modeller fremstillet af stamceller. Organoids kan genereres fra omprogrammeret pluripotente stamceller repræsenteret af embryonale stamceller og induceret pluripotente stamceller. De kan også genereres fra orgel-specifikke voksne stamceller12. Nogle cholangiocyte organoid modeller er blevet foreslået i tidligere undersøgelser. Således organoids stammer fra humane pluripotente stamceller har været rapporteret7,9,13 og give et værdifuldt, tid effektivt værktøj, der giver mulighed for den samtidige generation af forskellige celletyper. Men disse pluripotente stamceller-afledt organoids ikke fuldt ud afspejler struktur og funktionalitet af primære voksne EHBD cholangiocytes.
Organoids stammer fra voksne stamceller af den menneskelige9 og feline10 lever blev også foreslået. Feline modeller er ikke almindeligt tilgængelig og har begrænset værktøj angrebsformål henblik på studier. Desuden, disse leveren-afledte voksne stamceller-afledt organoids ikke model ekstrahepatisk cholangiocytes men snarere intrahepatisk cholangiocytes.
EHBD organoid generation blev rapporteret fra menneskers normale EHBDs14 og mus EHBD leverkræft15. Dog adgang til menneskelige EHBD væv er yderst begrænset, og organoids stammer fra en genetisk murine model af leverkræft15 repræsenterer ikke sund cholangiocyte biologi på homøostase og er afledt af genetisk modificerede celler.
For at løse begrænsningerne af pluripotente stamceller og leveren afledt cholangiocyte organoid modeller og den begrænsede adgang til humane væv i prækliniske modeller, udviklet vi en murine EHBD organoid model (figur 1A). Dette manuskript beskriver udviklingen af en teknik til mus EHBD-afledte organoids fra voksne væv. Disse EHBD organoids opkaldt EHBDOs vil være et vigtigt in vitro-værktøj til studiet af mekanismerne bag EHBDs cholangiocyte homeostase og sygdom processer, såsom cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, som påvirker ekstrahepatisk galdeveje (EHBDs), omfatter biliær atresi, primær skleroserende cholangitis og leverkræft. De har ingen effektive terapeutiske muligheder. Værktøjer til at studere EHBD er meget begrænset. Vores formål var at udvikle et orgel-specifikke, alsidig, voksne stamceller-afledt, prækliniske cholangiocyte model, der nemt kan genereres fra vildtype og gensplejsede mus. Dermed, vi rapport om den nye teknik for at udvikle en EHBD organoid (EHBDO) kultur system fra voksne mus EHBDs. Modellen er omkostningseffektiv, kunnet analyseres let, og har flere downstream programmer. Specifikt, beskrive vi metoden i mus EHBD isolation og enkelt celle dissociation, organoid kultur indledning, formering, og langsigtet vedligeholdelse og opbevaring. Dette manuskript beskriver også EHBDO behandling for immunhistokemi, fluorescerende mikroskopi og mRNA overflod kvantitering af real-time kvantitativ reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR). Denne protokol har betydelige fordele ud over producerer EHBD-specifikke organoids. Brug af en konditioneret medium fra L-WRN celler reducerer omkostningerne ved denne model. Brugen af musen EHBDs giver næsten ubegrænsede væv for kultur generation, i modsætning til humant væv. Genereret mus EHBDOs indeholde en ren population af epitelceller med markører for endodermal Stamform og differentieret biliær celler. Kulturperler organoids bevare homogene morfologi gennem flere passager og kan inddrives efter en langvarig oplagringsperiode i flydende kvælstof. Modellen giver mulighed for undersøgelse af galde stamfader celleproliferation, kan manipuleres farmakologisk og kan genereres fra gensplejsede mus. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at optimere dyrkningsbetingelserne for at øge plating effektivitet, evaluere funktionelle celle modenhed og direkte Celledifferentiering. Udvikling af fælles kultur modeller og en mere biologisk neutral ekstracellulære matrix er også ønskelig.

Vores protokol beskriver generation af mus EHBD organoids, der er vævet-specifikke og voksne stamceller-afledt. Efter at organoids er kulturperler, kan en cystisk struktur dannelse observeres så tidligt som 1 dag efter EHBD isolationen. Forurening med fibroblaster er ikke typisk iagttaget under kultur generation. EHBDO plating effektivitet er ca 2% når isoleret fra enten neonatal eller voksne (ældre end 2 måneder) mus (figur 2B). Plating effektivitet af ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Denne protokol beskriver produktion af en mus ekstrahepatisk galdegang 3-dimensionel organoid system. Disse biliær organoids kan opretholdes i kultur til at studere cholangiocyte biologi. Biliær organoids express markører for både Stamform og galde celler og er sammensat af polariseret epitelceller.

Generation af Organoids fra mus ekstrahepatisk galdeveje

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Denne murine ekstrahepatiske galdegang organoid system kan løse den begrænsede adgang til prækliniske cholangiopathies modeller og begrænsningerne af pluripotente stamceller og lever-afledte cholangiocyt organoid modeller. Vores model er voksen-vævsspecifikke, reduktionistiske, reproducerbare og tids- og omkostningseffektive. Det vil være til særlig gavn for laboratorier, der ikke har adgang til humant væv.Vores teknik gør det muligt at dyrke et næsten ubegrænset antal ekstrahepatiske galdegang cholangiocytter til at studere væv regenerering og celle-til-celle interaktioner. Demonstration af proceduren vil være Junya Shiota, en post-doc fra mit laboratorium. For intrahepatisk galdegang isolation, placere den voksne mus i en liggende position og åbne bughulen langs midterlinjen.Træk leveren tilbage til at hvile på mellemgulvet og bruge en hæmostat til forsigtigt at trække den proksimale duodenum at afsløre den fælles galdegang umiddelbart under leveren hilum. Brug en skalpel til at adskille den ekstrahepatiske galdegang fra det omgivende væv. Holde den proksimale ende af den fælles galdegang med spån, dissekere kanalen distally lige over sin skillevej med duodenum før dissekere den proksimale ende af kanalen fra leveren.Umiddelbart placere den isolerede ekstrahepatiske galdegang i en glasplade, der indeholder kold vask buffer på is, derefter rense galdegang fra det omgivende væv og hakkekød i 0,5-millimeter sektioner. Når alt vævet er hakket, overføres sektionerne til et rør, der indeholder 500 mikroliter dissociation buffer til en 20-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Ved afslutningen af dissociationen neutraliseres bufferen med 500 mikroliter iskold cellekulturmedium, og vævssuspensionen tritureres 20 gange gennem en 18-gauge nål og derefter 20 gange gennem en 20-gauge nål.Derefter filtreres den resulterende celleaffjedring gennem en 70-mikrometercelles si i et 50-milliliterrør. For at etablere en galdeorganoid kultur, indsamle cellerne ved centrifugering og forsigtigt fjerne supernatant. Pelletsuspendrer pelletet op igen i en milliliter iskold, steril PBS, og cellerne overføres til et 1,5 milliliterrør til endnu en centrifugering.Resuspend den vaskede pellet i 120 mikroliter af flydende, iskold kælder matrix og plade 40 mikroliter af celler i midten af hver af tre brønde af en 37 grader Celsius-opvarmet, 24-brønd plade, derefter placere pladen i en 37 grader Celsius væv kultur inkubator i ca 15 minutter. Når kælderen matrix har størknet, tilsæt 600 mikroliter af 37 grader Celsius såning medium til hver godt før du returnerer pladen til inkubatoren. Efter tre dage og hver tredje dag derefter erstattes såningsmediet med 600 mikroliter af frisk organoidkulturmedium, hvilket regelmæssigt overvåger organoidvæksten med et omvendt mikroskop.For at passage af de ekstrahepatiske galdegangskulturer pipettes organoiderne i hver brønd med 400 mikroliter iskold PBS 10 gange pr. god tid, før brøndindholdet overføres til individuelle 1,5 milliliterrør. Passage hver blanding gennem en 25-gauge nål fire gange for at adskille organoids og indsamle cellerne ved centrifugering. Derefter resuspend cellerne i kælderen matrix på passende forhold for re-plating.For langsigtet ekstrahepatisk galdegang organoid opbevaring, vaske hver brønd af organoids med stuetemperatur PBS uden at forstyrre kælderen matrix dråber og tilføje 500 mikroliter af iskold frysning medium til hver brønd. Forsigtigt resuspendere organoider og overføre blandingen til individuelle kryogene hætteglas, derefter placere hætteglassene på minus 80 grader Celsius i 48 timer, før overførsel af organoids til en nitrogen tank til langtidsopbevaring i en dampfase. For at forberede organoids til paraffin indlejring, erstatte mediet med 500 mikroliter på fire grader Celsius PBS og overføre suspensionen fra hver brønd i individuelle 1,5-milliliter rør, der indeholder flydende kælder matrix.Opsaml organoiderne ved centrifugering, og brug en modificeret P1000 pipettespids til forsigtigt at fjerne supernatanterne uden at forstyrre pellets. Derefter tilsættes en milliliter iskold, 4% paraformaldehyd til organoiderne for en overnatning inkubation ved fire grader Celsius. Næste morgen udskiftes fikseringsstilleren med en milliliter rumtemperatur PBS i fem minutters inkubation ved stuetemperatur, og organoiderne vaskes ved centrifugering tre gange.Efter den sidste vask opspjænges organoiderne igen i en milliliter 30%ethanol i en fem minutters inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af en fem minutters inkubation i en milliliter 70% ethanol ved stuetemperatur. Ved afslutningen af 70% ethanol inkubation, indsamles organoider ved centrifugering og resuspenderede organoider i en milliliter 100% ethanol i fem minutter ved stuetemperatur. Ved afslutningen af 100% ethanol inkubation, varme prøve behandling gel i en mikrobølgeovn i 20 sekunder eller indtil flydende, og tilsæt 50 mikroliter af den flydende gel til hvert rør af organoider.Rørene anbringes på is, indtil prøven forarbejdningsgelen er størknet, og dråben af organoider overføres fra hvert rør til mellem de blå svampepuder i en kassette til videre behandling i paraffintegrering. Kassetten sættes i en vævsprocessor, der er programmeret i 15 minutter pr. trin, og del derefter paraffinindreducerede organoider i prøvebehandlingsgelen ved fire mikrometer pr. sektion for immunhisemisk farvning og analyse i henhold til standardprotokollerne. Ekstrahepatisk galdegang organoid plating effektivitet er ca 2%, når isoleret fra enten neonatal eller voksne mus.Efter passage to, plating effektivitet ekstrahepatiske galdegang organoider stammer fra voksne mus stiger til 11% og forbliver stabil. De fleste organoider demonstrerer en cystisk morfologi i alle passager med sjældne uregelmæssige organoider. Organoiderne når et væksttoppe på fem til syv dage, hvorefter de begynder at akkumulere intraluminalt snavs og forringes.Derfor, for vedligeholdelse af organoid kultur, bør organoids opdeles hver syv til 10 dage. Når analyseret med immunfluorescens, ekstrahepatiske galdegang organoider består af en ren population af epitelceller præget af E-cadherin. Organoid celler viser også markører for galdeprogenitor celler samt markører for galde differentiering.Vigtigere er det, en høj procentdel af organoid celler besidder en primær cilium præget af acetyleret alpha Tubulin, som er en funktion af normale cholangiocytter og tyder på en passende organoid celle polarisering. Tæt overholdelse af den beskrevne temperaturtilstand er påkrævet. Omhyggelig galdegang dissektion forhindrer bugspytkirtelcelleforurening.Tab af cellulært materiale kan undgås ved omhyggelig manipulation efter centrifugering. Disse organoider kan bruges som prækliniske modeller, genetisk og farmakologisk manipuleret, eller bruges til at teste narkotika og virkningerne af infektiøse stoffer. Denne metode kan bruges af laboratorier, der ønsker at drage fordel af genetisk modificerede musemodeller til yderligere at studere mekanismerne i cholangiocyt biologi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestemmelse galdegang tæthed i muse leveren

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generation af Mosaic Mammary Organoids af Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ekstra Cellulær Matrix-baseret og ekstra cellulær matrix-fri generation af Murine testikel organoider

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generation og kultur af lingualorganoider afledt af voksne musesmag stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generation af 3D hele lungeorganoider fra inducerede pluripotente stamceller til modellering af lungeudviklingsbiologi og sygdom

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...