Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse Vereniging voor de studie van lever ziekten Pinnacle award (naar N.R.) en de National Institutes of Health, nationale Instituut van Diabetes en spijsverterings- en nierziekten (awards P30 DK34933 aan N.R., P01 DK062041 aan J.L.M.). Wij danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) voor zijn hulp bij de ontwikkeling van deze methode.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. bereiding van uitrusting en materiaal voor muis EHBD isolatie
<ol><li>Bereiden seeding medium en wassen buffer (Tabel van materialen) in 50 mL conische buizen en houden hen bij 4 ° C of op ijs tot gebruik.</li>
	<li>Een chirurgische tabel (figuur 1B) instellen. Bereiden gesteriliseerde chir...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Dit werk beschrijft de generatie van een 3-dimensionaal model van de organotypic van muis EHBD cholangiocytes. Belangrijke stappen in de EHBDO cultuur generatie omvatten nauwgezet EHBD dissectie Voorkom alvleesklier cel besmetting, onderhoud van steriele omstandigheden ter voorkoming van bacteriële en schimmelinfecties besmetting en zorgvuldige manipulatie na het centrifugeren om te voorkomen dat de verlies van celmateriaal. Een nauwe aanhankelijkheid aan beschreven temperatuursomstandigheden is vereist. Er zijn enkele ...

Cholangiopathies zijn ongeneeslijke chronische progressieve aandoeningen die invloed hebben op biliaire cellen gelegen in intra- en extrahepatic biliaire leidingen (EHBDs)1. Sommige cholangiopathies, zoals acute primaire scleroserende cholangitis, cholangiocarcinoma, biliaire atresie en choledochal cysten, is hoofdzakelijk van invloed op EHBDs. Ontwikkeling van therapieën voor cholangiopathies wordt beperkt door de beperkte beschikbaarheid van preklinische modellen. Bovendien, eerdere studies gericht op cholangiopathies gegroepeerd: lever, intra- en EHBDs. Echter, intra- en EHBDs hebben een aparte embryonale oorsprong en, dus, moet worden beschouwd als afzonderlijke moleculaire pathologie. Intrahepatische galwegen ontwikkelen van de Intrahepatische ductaal platen en de craniale deel van hepatische diverticulum, de ontwikkeling van de hele EHBDs van de staartzijde van het hepatische diverticulum2. Zij vertrouwen ook op verschillende progenitor cel compartimenten voor volwassen homeostase, met inbegrip van grachten van Hering in Intrahepatische galwegen en peribiliary klieren in EHBDs2,3. Gebruik van diermodellen voor preklinische studies wordt beperkt door de kosten en moet worden geminimaliseerd om ethische redenen. Daarom zijn reductionistische, reproduceerbaar, tijd en kosten-efficiënte in-vitro modellen zeer wenselijk.
Meeste voorafgaande studies van cholangiopathies gebruikt normale muis of rat kanker modellen, of menselijke cholangiocarcinoma cellijnen afgeleid van intra- en EHBDs4,,5,,6,7. Echter, deze zijn modellen van getransformeerde cellen en doen niet recapituleren normale cholangiocyte biologie op homeostase of in een gezonde staat. Recente vooruitgang in de ontwikkeling van organotypic cultuur modellen heeft toegestaan de ontwikkeling van 3-dimensionale structuren van de verschillende weefselsoorten, met inbegrip van hepatobiliaire weefsels, hoewel niet normale muis EHBDs8,9, 10. Deze structuren "orgel-achtige" gericht op het nabootsen van primaire weefsel en worden geteeld in een kunstmatige niche ondersteuning zelf-vernieuwing van de orgel-specifieke stam/voorlopercellen cellen11.
"Organoid" is een brede term die de meeste vaak beschrijft 3-dimensionale weefsel modellen afgeleid van stamcellen. Organoids kan worden gegenereerd vanuit geherprogrammeerde pluripotente stamcellen vertegenwoordigd door embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Ze kunnen ook worden gegenereerd vanuit orgel-specifieke adulte stamcellen12. Sommige cholangiocyte organoid modellen zijn voorgesteld in vorige onderzoeken. Dus, organoids afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen zijn gerapporteerde7,9,13 en bieden een waardevolle, tijd efficiënt hulpmiddel waarmee voor gelijktijdige opwekking van verschillende celtypes. Echter komen deze pluripotente stamcel afkomstige organoids niet volledig overeen met de structuur en de functionaliteit van primaire volwassen EHBD cholangiocytes.
Organoids afgeleid van adulte stamcellen van het menselijke9 en katachtige10 lever werden ook voorgesteld. Katachtige modellen zijn niet overal verkrijgbaar en hebben beperkte hulpprogramma arsenaal voor studiedoeleinden. Deze lever afkomstige volwassen stamcel afkomstige organoids doen bovendien niet extrahepatic cholangiocytes maar eerder Intrahepatische cholangiocytes model.
EHBD organoid generatie werd gemeld uit menselijke normale EHBDs14 en muis EHBD cholangiocarcinoma15. Echter toegang tot menselijke weefsels EHBD is zeer beperkt, en organoids afgeleid van een genetische lymfkliertest model van cholangiocarcinoma15 vertegenwoordigen niet gezond cholangiocyte biologie aan homeostase en zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde cellen.
Om de beperkingen van pluripotente stamcel - en lever-afgeleide cholangiocyte organoid modellen en de beperkte toegang tot menselijke weefsels, in preklinische modellen nodig, ontwikkelden we een lymfkliertest EHBD organoid model (figuur 1A). Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een techniek voor muis EHBD afkomstige organoids uit volwassen weefsel. Deze EHBD organoids genaamd EHBDOs zal een belangrijk in vitro instrument zijn voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de EHBDs cholangiocyte homeostase en ziekte processen, zoals cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, die gevolgen hebben voor extrahepatic galwegen (EHBDs), bevatten biliaire atresie, acute primaire scleroserende cholangitis en cholangiocarcinoma. Ze hebben geen effectieve therapeutische opties. Hulpmiddelen om te studeren EHBD zijn zeer beperkt. Ons doel was het ontwikkelen van een orgel-specifieke, veelzijdig, volwassen stamcel-afgeleid, preklinische cholangiocyte model dat gemakkelijk kan worden gegenereerd vanuit wild type en genetisch gemodificeerde muizen. Dus rapporteren wij over de nieuwe techniek van de ontwikkeling van een EHBD organoid (EHBDO) cultuur systeem van volwassen muis EHBDs. Het model is kostenefficiënt, kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd, en heeft meerdere downstream toepassingen. Specifiek, beschrijven we de methodologie van muis EHBD isolatie en eencellige dissociatie, organoid cultuur initiatie, voortplanting, en op lange termijn onderhoud en opslag. Dit manuscript wordt ook beschreven EHBDO verwerking voor immunohistochemistry, fluorescent microscopie en mRNA overvloed kwantificatie door real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR). Dit protocol heeft belangrijke voordelen naast EHBD-specifieke organoids produceren. Het gebruik van een geconditioneerde medium uit L-WRN cellen aanzienlijk vermindert de kosten van dit model. Het gebruik van de muis EHBDs biedt bijna onbeperkte weefsel voor cultuur generatie, in tegenstelling tot menselijk weefsel. Gegenereerde muis EHBDOs bevatten een zuivere bevolking van epitheliale cellen met markeringen van endodermal voorlopercellen en gedifferentieerde biliaire cellen. Gekweekte organoids handhaven van homogene morfologie door meerdere passages en kunnen worden hersteld na een langdurige opslagperiode in vloeibare stikstof. Het model staat voor de studie van biliaire progenitor celproliferatie, farmacologisch kan worden gemanipuleerd en kan worden gegenereerd op basis van genetisch gemodificeerde muizen. Toekomstige studies zijn nodig om het optimaliseren van de kweekomstandigheden om efficiëntie van de beplating, evalueren functionele cel volwassenheid, en directe celdifferentiatie. Ontwikkeling van co cultuur modellen en een meer biologisch neutraal extracellulaire matrix zijn ook wenselijk.

Ons protocol beschrijft de generatie van muis EHBD organoids die weefsel-specifieke en volwassen stamcel-afgeleide. Nadat de organoids worden gekweekt, kan een cystic Structuurformatie zo spoedig 1 dag na de EHBD-isolatie worden waargenomen. Besmetting met fibroblasten meestal niet wordt nageleefd tijdens het genereren van de cultuur. EHBDO plating efficiëntie is ongeveer 2% wanneer geïsoleerd van neonatale of volwassen (ouder dan 2 maanden) muizen (figuur 2B</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Dit protocol beschrijft de productie van een muis extrahepatic gal 3-dimensionale organoid kanaalsysteem. Deze biliaire organoids kan worden gehandhaafd in cultuur te bestuderen van cholangiocyte biologie. Biliaire organoids express markers van voorlopercellen zowel biliaire cellen en zijn samengesteld uit gepolariseerde epitheliale cellen.

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Dit murine extrahepatische galkanaal organoïde systeem kan de beperkte toegang tot preklinische cholangiopathieën modellen en de beperkingen van pluripotente stamcel en lever-afgeleide cholangiocyte organoïde modellen aan te pakken. Ons model is specificeerbaar, reductionistisch, reproduceerbaar en tijd- en kostenefficiënt. Het zal van bijzonder nut zijn voor laboratoria die geen toegang hebben tot menselijke weefsels.Onze techniek maakt het mogelijk om een bijna onbeperkt aantal extrahepatische galbuizencholangiocyten te kweken om weefselregeneratie en cel-naar-cel interacties te bestuderen. Het aantonen van de procedure zal Junya Shiota zijn, een post-doc uit mijn laboratorium. Voor intrahepatische galkanaalisolatie plaatst u de volwassen muis in een supinepositie en opent u de buikholte langs de middellijn.Trek de lever in om op het middenrif te rusten en gebruik een hemostat om voorzichtig de proximale twaalfvingerige darm te trekken om het gemeenschappelijke galkanaal direct onder het levergevest te onthullen. Gebruik een scalpel om de extrahepatische galbuis te scheiden van de omliggende weefsels. Houd het proximale uiteinde van de gemeenschappelijke galbuis met tangen, ontleden het kanaal distaal net boven het kruispunt met de twaalfvingerige darm voordat ontleden het proximale uiteinde van het kanaal uit de lever.Plaats onmiddellijk de geïsoleerde extrahepatische galbuis in een glasplaat met koude wasbuffer op ijs, maak vervolgens de galbuis van het omliggende weefsel schoon en hak in 0,5 millimeter secties. Wanneer al het weefsel is gehakt, breng de secties in een buis met 500 microliters van dissociatie buffer voor een 20-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Neutraliseer aan het einde van de dissociatie de buffer met 500 microliters ijskoud celkweekmedium en trituraat de weefselsuspensie 20 keer via een naald van 18 meter en vervolgens 20 keer door een naald van 20 meter.Vervolgens filter de resulterende cel suspensie door een 70-micrometer cel zeef in een 50-milliliter buis. Om een galorganoïde cultuur vast te stellen, verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder zorgvuldig de supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter ijskoude, steriele PBS en breng de cellen naar een 1,5-milliliter buis voor een tweede centrifugatie.Resuspend de gewassen pellet in 120 microliter van vloeibaar, ijskoude kelder matrix en plaat 40 microliter van cellen in het midden van elk van de drie putten van een 37 graden Celsius opgewarmde, 24-well plaat, dan plaats de plaat in een 37 graden Celsius weefsel cultuur incubator voor ongeveer 15 minuten. Wanneer de kelder matrix is gestold, voeg 600 microliter van 37 graden Celsius zaaien medium aan elke goed voor de terugkeer van de plaat naar de incubator. Na drie dagen en om de drie dagen daarna, vervang het zaaimedium door 600 microliters van vers organoïde cultuurmedium, waarbij de organoïde groei regelmatig wordt gecontroleerd met een omgekeerde microscoop.Om de extrahepatische galkanaalculturen door te geven, pipette de organoïden in elke put met 400 microliter ijskoude PBS 10 keer per goed alvorens de putinhoud over te brengen naar individuele 1,5-milliliter buizen. Passage elk mengsel door een 25-gauge naald vier keer om de organoïden te scheiden en het verzamelen van de cellen door middel van centrifugatie. Dan resuspend de cellen in keldermatrix bij de aangewezen verhouding voor het opnieuw beplating.Voor langdurige extrahepatische galkanaalorganoïde opslag, was elke put van organoïden met kamertemperatuur PBS zonder verstoring van de kelder matrix druppels en voeg 500 microliters van ijskoud freezing medium aan elke put. Voorzichtig resuspend de organoïden en breng het mengsel in individuele cryogene flesjes, dan plaats de flesjes op min 80 graden Celsius gedurende 48 uur voor de overdracht van de organoïden naar een stikstoftank voor langdurige opslag in een dampfase. Om de organoïden voor te bereiden op paraffine inbedding, vervang het medium met 500 microliters van vier graden Celsius PBS en breng de suspensie van elke put in individuele 1,5-milliliter buizen met vloeibaar kelder matrix.Verzamel de organoïden door centrifugatie en gebruik een aangepaste P1000 pipettip om de supernatants zorgvuldig te verwijderen zonder de pellets te storen. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude, 4%paraformaldehyde toe aan de organoïden voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, vervang het fixatief met een milliliter kamertemperatuur PBS voor een vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur en was de organoïden door centrifugatie drie keer.Na de laatste wasbeurt, resuspend de organoïden in een milliliter van 30%ethanol voor een vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur, gevolgd door een vijf minuten incubatie in een milliliter van 70%ethanol bij kamertemperatuur. Verzamel aan het einde van de 70%ethanol incubatie de organoïden door centrifugatie en roep de organoïden vijf minuten bij kamertemperatuur opnieuw op in één milliliter ethanol van 100%. Aan het einde van de 100% ethanol incubatie, warmte specimen verwerking gel in een magnetron gedurende 20 seconden of tot vloeibaar, en voeg 50 microliter van de vloeibaar gel aan elke buis van organoïden.Plaats de buizen op ijs totdat de monsterverwerkingsgel is gestold en breng de druppel organoïden van elke buis naar tussen de blauwe sponspads in een cassette voor verdere verwerking in de paraffineinvent. Plaats de cassette in een weefselprocessor die gedurende 15 minuten per stap is geprogrammeerd en verdeel vervolgens de paraffine-embedded organoïden in specimen processing gel op vier micrometer per sectie voor immunohistochemische kleuring en analyse volgens standaardprotocollen. Extrahepatische galkanaal organoïde beplating efficiëntie is ongeveer 2%wanneer geïsoleerd van neonatale of volwassen muizen.Na passage twee neemt de beplatingsefficiëntie van extrahepatische galkanaalorganoïden afkomstig van volwassen muizen toe tot 11% en blijft stabiel. De meerderheid van de organoïden tonen een cystische morfologie in alle passages met zeldzame onregelmatige organoïden. De organoïden bereiken een groeipiek op vijf tot zeven dagen, waarna ze intraluminale puin beginnen op te hopen en verslechteren.Daarom moeten de organoïden voor het behoud van de organoïdecultuur om de zeven tot tien dagen worden gesplitst. Wanneer geanalyseerd met immunofluorescentie, extrahepatische galkanaal organoïden bestaan uit een zuivere populatie van epitheliale cellen gekenmerkt door E-cadherine. Organoïde cellen tonen ook markers van galverervercellen evenals markers van galdifferentiatie.Belangrijk is dat een hoog percentage organoïde cellen een primair cilium bezit dat wordt gekenmerkt door geacetyleerde alfa Tubulin, wat een kenmerk is van normale cholangiocyten en een geschikte organoïde celpolarisatie suggereert. Nauwe naleving van de beschreven temperatuur is vereist. Nauwgezete galwegendissectie voorkomt bodemverontreiniging van de alvleeskliercel.Het verlies van cellulair materiaal kan worden vermeden door zorgvuldige manipulatie na centrifugatie. Deze organoïden kunnen worden gebruikt als preklinische modellen, genetisch en farmacologisch gemanipuleerd, of gebruikt om drugs en de effecten van infectieuze stoffen te testen. Deze methode kan worden gebruikt door laboratoria die willen profiteren van genetisch gemodificeerde muismodellen om de mechanismen van cholangiocyte biologie verder te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...