Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’Association américaine pour l’étude du foie, maladies Pinnacle prix (N.R.) et le National Institutes of Health, National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases (prix DK34933 P30 à N.R., P01 DK062041 à J.L.M.). Nous remercions le Dr Ramon Ocadiz-Ruiz (Université du Michigan) pour son aide au développement de cette méthodologie.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.
1. préparation du matériel et matériaux pour l’Isolation EHBD souris
<ol><li>Préparer les semis moyen et tampon de lavage (Table des matières) dans 50 mL tubes coniques et garder à 4 ° C ou sur la glace jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Mettre en place une table d’opération chirurgicale (Fig...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Cet ouvrage décrit la génération d’un modèle 3-dimensional organotypique de souris EHBD biliaires. Des étapes importantes dans la production de la culture EHBDO incluent la dissection méticuleuse de EHBD pour éviter la contamination de cellules de pancréas, maintien des conditions stériles pour prévenir la contamination bactérienne et fongique et manipulation prudente après centrifugation afin d’éviter la perte du matériel cellulaire. Il faut une étroite adhésion aux conditions de température décrit...

Cholangiopathies sont incurables chroniques progressive des troubles qui affectent les cellules biliaires situés intra - et les canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs)1. Certains cholangiopathies, tels que la cholangite sclérosante primitive, cholangiocarcinome, atrésie des voies biliaires et kystes cholédocien, affectent principalement EHBDs. Mise au point de thérapies pour les cholangiopathies est limitée par la disponibilité limitée des modèles précliniques. En outre, des études antérieures concentrent cholangiopathies regroupés : foie, intra- et EHBDs. Cependant, intra - et EHBDs ont une origine embryonnaire distinct et devraient donc être considérés comme des pathologies moléculaires distinctes. Voies biliaires intrahépatiques se développent à partir des plaques canalaires intrahépatiques et la partie crâniale du diverticule hépatique, EHBDs ensemble se développent à partir de la partie caudale du diverticule hépatique2. Ils comptent également sur les compartiments cellulaires différentes souches pour l’homéostasie adulte, y compris les canaux de Hering dans les voies biliaires intrahépatiques et glandes péribiliaires EHBDs2,3. Utilisation de modèles animaux pour des études précliniques est limitée par la dépense et devrait être réduite au minimum pour des raisons éthiques. Réductionniste, reproductible, temps et coût-efficace modèles in vitro sont donc hautement souhaitables.
La plupart des études préalables de cholangiopathies utilisé des souris normales ou modèles de cancer de rat ou lignées de cellules de cholangiocarcinome humain dérivées intra - et EHBDs4,5,6,7. Cependant, ceux-ci sont des modèles de cellules transformées et récapituler pas normal cholangiocyte biologie à l’homéostasie, ou dans un état sain. Les progrès récents dans l’élaboration de modèles de culture organotypique a permis le développement de structures 3D de types de tissus différents, y compris les tissus hépato-biliaire, bien que les souris normale non EHBDs8,9, 10. Ces structures en « orgue » visant à imitant le tissu principal et sont cultivés dans une niche artificielle soutenant l’auto-renouvellement des cellules de certains organes souches/progénitrices11.
« Organoïde » est un large mandat qui est plus communément décrit les modèles de tissus 3 dimensions dérivées de cellules souches. Organoïdes peut être généré de reprogrammé pluripotentes cellules souches représentée par des cellules souches embryonnaires et induit des cellules souches pluripotentes. Ils peuvent également être générés d’organe-spécifiques des cellules souches adultes12. Certains modèles d’organoïde cholangiocyte ont été proposées dans les études précédentes. Ainsi, organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines ont été déclarés7,9,13 et fournissent un outil efficace de temps précieux, qui permet la production simultanée de différents types cellulaires. Cependant, ces organoïdes de dérivés de cellules souches pluripotentes ne reflètent pas totalement la structure et les fonctionnalités de primaire adulte EHBD biliaires.
Organoïdes dérivées de cellules souches adultes de l' humain9 et féline10 du foie ont également été proposées. Féline de modèles ne sont pas largement disponibles et ont limité la panoplie d’outil à des fins d’étude. En outre, ces organoïdes de dérivés de cellules souches adultes provenant du foie ne pas poser biliaires extrahépatiques mais biliaires intrahépatiques plutôt.
Génération d’organoïde EHBD humaine normale EHBDs14 et la souris EHBD cholangiocarcinome15a été signalée. Cependant, l’accès pour les tissus humains de EHBD est extrêmement limité et organoïdes dérivés d’un modèle murin de cholangiocarcinome15 ne représentent pas de biologie cholangiocyte sain à l’homéostasie et proviennent de cellules génétiquement modifiées.
Pour pallier les lacunes des pluripotentes dérivées de cellules souches et de foie cholangiocyte organoïde modèles et l’accès limité aux tissus humains nécessaires dans les modèles précliniques, nous avons développé un modèle murin d’organoïde EHBD (Figure 1 a). Ce manuscrit décrit le développement d’une technique pour souris organoïdes EHBD dérivées de tissus adultes. Ces organoïdes EHBD nommés EHBDOs sera un outil important in vitro pour l’étude des mécanismes sous-jacents à l’EHBDs cholangiocyte l’homéostasie et maladie processus, tels que cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, d’affecter des canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs), incluent l’atrésie des voies biliaires, la cholangite sclérosante primitive et cholangiocarcinome. Ils n’ont aucune option thérapeutique efficace. Outils pour étudier les EHBD sont très limitées. Notre but était d’élaborer un modèle de certains organes, polyvalent, adulte cholangiocyte de cellules souches dérivées, précliniques qui peut être facilement généré de type sauvage et des souris génétiquement modifiées. Ainsi, nous présentons la nouvelle technique de mettre au point un système de culture organoïde (EHBDO) EHBD de EHBDs de souris adulte. Le modèle est rentable, capable de doser facilement, et a de multiples applications en aval. Plus précisément, nous décrivons la méthodologie d’isolement EHBD souris et dissociation cellulaire unique, initiation de culture organoïde, propagation et maintenance à long terme et stockage. Ce manuscrit a aussi décrit EHBDO traitement pour immunohistochimie, microscopie fluorescente et quantification d’abondance ARNm en chaîne par polymérase quantitative en temps réel de la transcription inverse (qRT-PCR). Ce protocole a des avantages significatifs en plus de produire EHBD spécifique organoïdes. L’utilisation d’un milieu conditionné de cellules L-AVT réduit significativement le coût de ce modèle. L’utilisation de souris EHBDs fournit presque illimitée de tissus pour la production de la culture, à la différence des tissus humains. EHBDOs souris générés contiennent une population pure de cellules épithéliales avec des marqueurs de progéniteurs endodermiques et différencient de cellules biliaires. Organoïdes cultivées maintiennent morphologie homogène à travers les passages multiples et peuvent être récupérés après une longue période de stockage dans l’azote liquide. Le modèle permet l’étude de la prolifération des cellules progénitrices biliaire, peut être manipulé sur le plan pharmacologique et peut être généré à partir des souris génétiquement modifiées. Les études à venir sont nécessaires pour optimiser les conditions de culture afin d’accroître l’efficacité de l’électrodéposition, d’évaluer la maturité fonctionnelle cellulaire et la différenciation cellulaire directe. Développement de modèles de culture mixte et une matrice extracellulaire plus biologiquement neutre sont également souhaitables.

Notre protocole décrit la génération de souris EHBD organoïdes qui sont spécifiques des tissus et cellules souches dérivées d’adulte. Après que les organoïdes sont cultivées, une formation des structures kystiques peut être observée dès 1 jour après l’isolement du EHBD. Contamination par les fibroblastes n’est pas typiquement observée pendant la génération de la culture. EHBDO efficacité de placage est environ 2 % lorsqu’il est isolé depuis néonatale ou adulte ...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Ce protocole décrit la production d’une souris biliaires extrahépatiques organoïde 3-dimensions. Ces organoïdes biliaires peuvent être maintenues en culture pour étudier la biologie cholangiocyte. Organoïdes biliaires expriment des marqueurs des cellules biliaires et géniteur et sont composées de cellules épithéliales polarisées.

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Ce système organoïde extrahépatique de choe murine peut adresser l’accès limité aux modèles précliniques de cholangiopathies et aux limitations des modèles organoïdes pluripotents de cellules souches et de cholangiocytes hépatiques. Notre modèle est spécifique aux tissus adultes, réductionniste, reproductible, et le temps et rentable. Il sera ux pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux tissus humains.Notre technique permet la culture d’un nombre presque illimité de cholangiocytes extrahépatiques des canaux biliaires pour étudier la régénération des tissus et les interactions cellule à cellule. Junya Shiota, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour l’isolement intrahépatique des canaux biliaires, placez la souris adulte dans une position supine et ouvrez la cavité abdominale le long de la ligne médiane.Rétractez le foie pour se reposer sur le diaphragme et utilisez un hémstat pour tirer doucement le dudénodum proximal pour révéler le canal biliaire commun immédiatement au-dessous de l’hilum de foie. Utilisez un scalpel pour séparer le canal biliaire extrahépatique des tissus environnants. Tenant l’extrémité proximale du canal biliaire commun avec des forceps, disséquez le conduit distally juste au-dessus de sa jonction avec le duodène avant de disséquer l’extrémité proximale du conduit du foie.Placez immédiatement le canal biliaire extrahépatique isolé dans une plaque de verre contenant un tampon de lavage à froid sur la glace, puis nettoyez le canal biliaire du tissu environnant et hachez-le en sections de 0,5 millimètre. Lorsque tout le tissu a été haché, transférer les sections dans un tube contenant 500 microlitres de tampon de dissociation pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la dissociation, neutraliser le tampon avec 500 microlitres de culture cellulaire glacée moyenne et triturer la suspension tissulaire 20 fois à travers une aiguille de calibre 18, puis 20 fois à travers une aiguille de calibre 20.Filtrez ensuite la suspension cellulaire résultante à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Pour établir une culture organoïde biliaire, recueillir les cellules par centrifugation et enlever soigneusement le supernatant. Resuspendez la pastille en un millilitre de PBS stérile et glacé et transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre pour une deuxième centrifugation.Resuspendez la pastille lavée dans 120 microlitres de matrice de sous-sol liquéfiée et glacée et plaquez 40 microlitres de cellules au centre de chacun des trois puits d’une plaque de 37 degrés Celsius réchauffée et 24 puits, puis placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Lorsque la matrice du sous-sol s’est solidifiée, ajouter 600 microlitres de 37 degrés Celsius de milieu d’ensemencement à chaque puits avant de retourner la plaque à l’incubateur. Après trois jours et tous les trois jours par la suite, remplacer le milieu d’ensemencement par 600 microlitres de milieu de culture organoïde frais, en surveillant la croissance organoïde régulièrement avec un microscope inversé.Pour passer les cultures extrahépatiques des canaux biliaires, pipette les organoïdes dans chaque puits avec 400 microlitres de PBS glacé 10 fois par puits avant de transférer le contenu du puits à des tubes individuels de 1,5 millilitre. Passer chaque mélange à travers une aiguille de calibre 25 quatre fois pour dissocier les organoïdes et recueillir les cellules par centrifugation. Puis résuspendez les cellules dans la matrice du sous-sol au rapport approprié pour le re-placage.Pour le stockage extrahépatique à long terme des organoïdes des canaux biliaires, lavez chaque puits d’organoïdes avec du PBS à température ambiante sans déranger les gouttes de matrice du sous-sol et ajoutez 500 microlitres de milieu de congélation glacé à chaque puits. Resuspendez doucement les organoïdes et transférez le mélange dans des flacons cryogéniques individuels, puis placez les flacons à moins 80 degrés Celsius pendant 48 heures avant de transférer les organoïdes dans un réservoir d’azote pour un stockage à long terme dans une phase de vapeur. Pour préparer les organoïdes à l’intégration de la paraffine, remplacez le milieu par 500 microlitres de quatre degrés Celsius PBS et transférez la suspension de chaque puits en tubes individuels de 1,5 millilitre contenant la matrice de sous-sol liquéfiée.Recueillir les organoïdes par centrifugation et utiliser une pointe de pipette P1000 modifiée pour enlever soigneusement les supernatants sans déranger les granulés. Ajoutez ensuite un millilitre de glace, 4% de paraformaldéhyde aux organoïdes pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez le fixatif par un millilitre de PBS à température ambiante pour une incubation de cinq minutes à température ambiante et lavez les organoïdes par centrifugation trois fois.Après le dernier lavage, resuspendez les organoïdes en un millilitre de 30 % d’éthanol pour une incubation de cinq minutes à température ambiante, suivie d’une incubation de cinq minutes en un millilitre de 70 % d’éthanol à température ambiante. À la fin de l’incubation de 70 % d’éthanol, recueillir les organoïdes par centrifugation et resuspendre les organoïdes en un millilitre de 100 % d’éthanol pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation 100% éthanol, chauffer le gel de traitement des échantillons au micro-ondes pendant 20 secondes ou jusqu’à ce qu’il soit liquéfié, et ajouter 50 microlitres du gel liquéfié à chaque tube d’organoïdes.Placez les tubes sur la glace jusqu’à ce que le gel de traitement de l’échantillon soit solidifié et transférez la goutte d’organoïdes de chaque tube entre les tampons d’éponge bleus dans une cassette pour un traitement ultérieur dans l’ensefant de paraffine. Placez la cassette dans un processeur de tissu programmé pendant 15 minutes par étape, puis sectionnez les organoïdes incorporés paraffine dans le gel de traitement des échantillons à quatre micromètres par section pour la coloration et l’analyse immunohistochimiques selon les protocoles standard. L’efficacité extrahepatic de placage organoïde de canal biliaire est approximativement 2%lorsqu’elle est isolée des souris néonatales ou adultes.Après le passage deux, l’efficacité de placage des organoïdes extrahépatiques de cholagisme dérivés des souris adultes augmente à 11% et reste stable. La majorité des organoïdes démontrent une morphologie cystique dans tous les passages avec des organoïdes irréguliers rares. Les organoïdes atteignent un pic de croissance de cinq à sept jours, après quoi ils commencent à accumuler des débris intraluminaux et se détériorent.Par conséquent, pour le maintien de la culture organoïde, les organoïdes doivent être divisés tous les sept à dix jours. Une fois analysés avec l’immunofluorescence, les organoïdes extrahepatic de cholagisme se composent d’une population pure des cellules épithéliales marquées par E-cadherin. Les cellules organoïdes démontrent également des marqueurs des cellules progénitrices biliaires aussi bien que des marqueurs de différenciation biliaire.Fait important, un pourcentage élevé de cellules organoïdes possèdent un cilium primaire marqué par l’alpha tubuline acétylated, qui est une caractéristique des cholangiocytes normaux et suggère une polarisation appropriée de cellules organoïdes. Une observance étroite de l’état de température décrit est nécessaire. La dissection méticuleuse des canaux biliaires prévient la contamination des cellules du pancréas.La perte de matériel cellulaire peut être évitée par une manipulation minutieuse après centrifugation. Ces organoïdes peuvent être utilisés comme modèles précliniques, manipulés génétiquement et pharmacologiquement, ou utilisés pour tester les médicaments et les effets des agents infectieux. Cette méthode peut être utilisée par les laboratoires qui veulent tirer parti des modèles de souris génétiquement modifiés pour étudier plus avant les mécanismes de la biologie des cholangiocytes.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Génération et culture d’organoïdes linguals dérivés de cellules souches du goût de souris adultes

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...