Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der American Association für die Studie der Leber Krankheiten Pinnacle Award (n.r.) und die National Institutes of Health, National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen (awards P30 DK34933, n.r., P01 DK062041, J.L.M.) unterstützt. Wir danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) für seine Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung und Materialien für die Maus EHBD Isolierung
<ol><li>Bereiten Sie seeding Medium und waschen Puffer (Table of Materials) in 50 mL konische Röhrchen vor und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis bis zur Verwendung.</li>
	<li>Richten Sie eine OP-Tisch (Abb. 1 b). Bereiten Sie...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. 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Diese Arbeit beschreibt die Generation eine organotypischen 3-dimensionales Modell der Maus EHBD Cholangiocytes. Wichtige Schritte zur EHBDO Kultur Generation gehören sorgfältige EHBD Dissektion zur Vermeidung von Bauchspeicheldrüse Zelle Kontamination, Wartung von sterilen Bedingungen gegen Bakterien- und Pilzinfektionen Kontamination und sorgfältige Manipulation nach der Zentrifugierung zu vermeiden die Verlust von Zellmaterial. Eine enge Einhaltung der beschriebenen Temperaturbedingungen ist erforderlich. Es gibt ...

Cholangiopathies sind unheilbare chronische progressive Störungen, die biliären Zellen in Intra- und extrahepatische Gallenwege Kanäle (EHBDs)1betreffen. Einige Cholangiopathies, wie primäre sklerosierende Cholangitis, Gallengangskarzinom und biliären Atresie Choledochal Zysten betreffen überwiegend EHBDs. Entwicklung von Therapien für Cholangiopathies ist durch die begrenzte Verfügbarkeit von präklinischen Modellen eingeschränkt. Darüber hinaus früheren Studien konzentrierten sich auf Cholangiopathies zusammengefasst: Leber, Intra- und EHBDs. Allerdings Intra- und EHBDs haben einen ausgeprägten embryonalen Ursprung, und gilt somit als unterschiedliche molekulare Pathologien. Intrahepatischen Gallenwege entwickeln sich aus den intrahepatischen duktalen Platten und der kranialen Teil der hepatischen Divertikel, ganze EHBDs zu entwickeln, aus dem kaudalen Teil des hepatischen Divertikel2. Sie verlassen sich auch auf verschiedene Vorläuferzellen Zelle Fächer für Erwachsene Homöostase, einschließlich Kanäle von Hering in intrahepatischen Gallenwege und Peribiliary Drüsen im EHBDs2,3. Verwendung von Tiermodellen für präklinische Studien wird durch Kosten begrenzt und aus ethischen Gründen minimiert werden. Reduktionistische, reproduzierbare, Zeit und Kosten sparende in-vitro-Modelle sind daher sehr wünschenswert.
Die meisten frühere Studien von Cholangiopathies verwendete normale Maus oder Ratte Krebs Modelle oder menschlichen Gallengangskarzinom Zelllinien aus intra- und EHBDs4,5,6,7. Aber diese sind Modelle der transformierten Zellen und nicht normal Cholangiocyte Biologie Homöostase oder in einem gesunden Zustand rekapitulieren. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von organotypischen Kultur Modellen ermöglichte die Entwicklung von 3-dimensionalen Strukturen aus verschiedenen Gewebetypen, einschließlich Artischockenblättern Gewebe, obwohl nicht normale Maus EHBDs8,9, 10. Diese "Orgel-ähnlichen" Strukturen abzielen, primäre Gewebe imitiert und in eine künstliche Nische Unterstützung Selbsterneuerung der Organ-spezifischen Stamm/Stammvater Zellen11angebaut.
"Organoide" ist ein breiter Begriff, der meisten allgemein beschreibt 3-dimensionale Gewebemodelle Stammzellen abgeleitet. Organellen können aus umprogrammiert pluripotenten generiert werden Stammzellen vertreten durch embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. Sie können auch aus adulten Stammzellen organspezifischen12generiert werden. Einige Cholangiocyte organoide Modelle wurden in früheren Studien vorgeschlagen. So, Organellen, die von menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet wurden berichteten7,9,13 und sind wertvoll, Zeit effiziente Tools, die für die gleichzeitige Erzeugung von verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Diese pluripotenten Stammzelle-derived Organellen spiegeln jedoch nicht vollständig die Struktur und Funktionalität der primären adult EHBD Cholangiocytes.
Organellen von adulten Stammzellen des menschlichen9 abgeleitet und feline10 Leber wurden auch vorgeschlagen. Feline Modelle sind nicht weit verbreitet und haben begrenzte Tool Rüstzeug zu Studienzwecken. Darüber hinaus können diese Leber abgeleitet adulten Stem Cell-derived Organellen nicht extrahepatische Cholangiocytes aber eher intrahepatischen Cholangiocytes modellieren.
EHBD organoide Generation wurde von menschlichen normal EHBDs14 und Maus EHBD Gallengangskarzinom15berichtet. Allerdings Zugang zu menschlichen EHBD Gewebe ist äußerst begrenzt, und Organellen, abgeleitet von einer genetischen Mausmodell Gallengangskarzinom15 repräsentieren nicht gesund Cholangiocyte Biologie an der Homöostase und genetisch veränderten Zellen abgeleitet sind.
Um die Grenzen der pluripotenten Stammzelle - und Leber-derived Cholangiocyte organoide Modelle und des eingeschränkten Zugangs zu menschlichem Gewebe benötigt in präklinischen Modellen zu begegnen, haben wir ein EHBD organoide Mausmodell (Abbildung 1A) entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung einer Technik für Maus EHBD-abgeleitete Organellen von Erwachsenen Gewebe. Diese EHBD Organellen benannt EHBDOs werden in-vitro-Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die EHBDs Cholangiocyte Homöostase und Krankheit Prozesse, z. B. Cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, die extrahepatische Gallengänge (EHBDs) beeinflussen, gehören biliären Atresie, Primär sklerosierende Cholangitis und Gallengangskarzinom. Sie haben keine effektive therapeutische Optionen. Werkzeuge, um EHBD zu studieren, sind sehr begrenzt. Unser Ziel war es, eine Organ-spezifischen, vielseitig, Erwachsenen Stammzellen abgeleitet, präklinische Cholangiocyte Modell zu entwickeln, die leicht vom Wildtyp und gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden können. So berichten wir über die neuartige Technik der Entwicklung eines EHBD organoide (EHBDO) Kultur von Erwachsenen Maus EHBDs. Das Modell ist kostengünstig, leicht analysiert werden, und hat mehrere downstream-Anwendungen. Im einzelnen beschreiben wir die Methodik der Maus EHBD Isolation und einzelne Zelle Dissoziation, organoide Kultur Einleitung, Fortpflanzung, und langfristige Wartung und Lagerung. Dieses Manuskript beschreibt auch EHBDO Verarbeitung für Immunohistochemistry, Fluoreszenz-Mikroskopie und mRNA Fülle Quantifizierung durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses Protokoll hat deutliche Vorteile neben der Produktion von EHBD-spezifische Organellen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums aus L-WRN Zellen reduziert deutlich die Kosten für dieses Modell. Die Verwendung der Maus EHBDs bietet fast unbegrenzte Gewebe für Kultur-Generation, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe. Generierte Maus EHBDOs enthalten eine reine Bevölkerung von Epithelzellen mit Markern der endodermische Stammvater und differenzierte biliären Zellen. Kultivierte Organellen homogene Morphologie durch mehrere Gänge zu erhalten und nach längerer für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden können. Das Modell ermöglicht die Untersuchung der Gallenwege Stammvater Zellproliferation, pharmakologisch manipuliert werden und kann aus gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur Optimierung der Kulturbedingungen um Effizienzsteigerung Beschichtung, funktionale Zelle Reife und direkten Zell-Differenzierung zu bewerten. Entwicklung von Kokulturen Modellen und einer mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix sind ebenfalls wünschenswert.

Unser Protokoll beschreibt die Generation der Maus EHBD Organellen, die gewebespezifische und Erwachsenen Stammzellen abgeleitet sind. Nachdem die Organellen kultiviert werden, kann eine zystische Struktur Formation bereits 1 Tag nach der EHBD Isolation beobachtet werden. Kontamination mit Fibroblasten wird in der Regel nicht während Kultur Generation beobachtet. EHBDO Beschichtung Effizienz beträgt ca. 2 % Wenn Sie isoliert von Neugeborenen oder Erwachsenen (älter als 2 Monate) Mäuse...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Dieses murine extrahepatische Gallengang-Organoidsystem kann den begrenzten Zugang zu präklinischen Cholangiopathienmodellen und die Grenzen von pluripotenten Stammzell- und Leber-abgeleiteten Cholangiocyten-Organoidmodellen adressieren. Unser Modell ist erwachsenengewebespezifisch, reduktionistisch, reproduzierbar und zeit- und kosteneffizient. Es wird für Laboratorien von besonderem Nutzen sein, die keinen Zugang zu menschlichen Geweben haben.Unsere Technik ermöglicht die Kultivierung einer nahezu unbegrenzten Anzahl von extrahepatischen Gallengangscholangiozyten, um die Geweberegeneration und Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Demonstriert wird das Verfahren von Junya Shiota, einem Post-Doc aus meinem Labor. Für intrahepatische GallengangIsolierung, legen Sie die erwachsene Maus in eine Supine-Position und öffnen Sie die Bauchhöhle entlang der Mittellinie.Ziehen Sie die Leber zurück, um auf dem Zwerchfell zu ruhen und verwenden Sie ein Hämostat, um das proximale Zwölffingerdarm sanft zu ziehen, um den gemeinsamen Gallengang direkt unter dem Leberhilum zu offenbaren. Verwenden Sie ein Skalpell, um den extrahepatischen Gallengang von den umgebenden Geweben zu trennen. Halten Sie das proximale Ende des gemeinsamen Gallengangs mit Zangen, sezieren Sie den Kanal distal direkt über seinem Punkt mit dem Zwölffingerdarm, bevor das proximale Ende des Kanals aus der Leber seziert wird.Den isolierten extrahepatischen Gallengang sofort in eine Glasplatte mit Kaltwaschpuffer auf Eis legen, dann den Gallengang aus dem umgebenden Gewebe reinigen und in 0,5-Millimeter-Abschnitte zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Abschnitte in ein Rohr mit 500 Mikroliter Dissoziationspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Neutralisieren Sie am Ende der Dissoziation den Puffer mit 500 Mikrolitere eiskaltem Zellkulturmedium und trituieren Sie die Gewebesuspension 20 Mal durch eine 18-Spur-Nadel und dann 20-mal durch eine 20-Spur-Nadel.Filtern Sie dann die resultierende Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Um eine gallenförmige Organoidkultur zu etablieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalten, sterilen PBS wieder auf und übertragen Sie die Zellen für eine zweite Zentrifugation in ein 1,5-Milliliter-Rohr.Setzen Sie das gewaschene Pellet in 120 Mikrolitervergoldung, eiskalte Kellermatrix und Platte 40 Mikroliter Zellen in die Mitte von drei Brunnen einer 37 Grad Celsius erwärmten, 24-Well-Platte, dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius Gewebekultur-Inkubator für etwa 15 Minuten. Wenn die Kellermatrix erstarrt ist, fügen Sie 600 Mikroliter 37 Grad Celsius Saatmedium zu jedem Brunnen hinzu, bevor Sie die Platte zum Inkubator zurückgeben. Ersetzen Sie nach drei Tagen und danach alle drei Tage das Aussaatmedium durch 600 Mikroliter frisches organoides Kulturmedium und überwachen Sie das Organoidwachstum regelmäßig mit einem invertierten Mikroskop.Um die extrahepatischen Gallengangskulturen zu durchdringen, pipette die Organoide in jedem Brunnen mit 400 Mikrolitere eiskaltem PBS 10 mal pro Brunnen, bevor der Brunneninhalt in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren übertragen wird. Durcheine jede Mischung viermal durch eine 25-Spur-Nadel, um die Organoide zu dissoziieren und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie dann die Zellen in der Kellermatrix mit dem entsprechenden Verhältnis für die Neubeschichtung wieder aus.Für eine langfristige extrahepatische Gallengang-Organoidlagerung, waschen Sie jeden Brunnen von Organoiden mit Raumtemperatur PBS, ohne die KellermatrixTropfen zu stören und fügen Sie 500 Mikroliter eiskaltes Gefriermedium zu jedem Brunnen hinzu. Die Organoide vorsichtig wieder aufhängen und die Mischung in einzelne kryogene Fläschchen übertragen, dann die Fläschchen 48 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius platzieren, bevor die Organoide zur Langzeitlagerung in einer Dampfphase in einen Stickstofftank übertragen werden. Um die Organoide für die Paraffineinbettung vorzubereiten, ersetzen Sie das Medium durch 500 Mikroliter vier Grad Celsius PBS und übertragen Sie die Suspension von jedem Brunnen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren mit verflüssigter Kellermatrix.Sammeln Sie die Organoide durch Zentrifugation und verwenden Sie eine modifizierte P1000 Pipettenspitze, um die Überräube sorgfältig zu entfernen, ohne die Pellets zu stören. Dann fügen Sie einen Milliliter eiskalte, 4%Paraformaldehyd zu den Organoiden für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen die Fixierung durch einen Milliliter Raumtemperatur PBS für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur ersetzen und die Organoide dreimal durch Zentrifugation waschen.Nach der letzten Wäsche die Organoide in einem Milliliter 30% Ethanol für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder aufsetzen, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation in einem Milliliter 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Am Ende der 70%ethanol Inkubation die Organoide durch Zentrifugation sammeln und die Organoide in einem Milliliter 100% Ethanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur wieder aussetzen. Am Ende der 100%ethanol Inkubation, Wärme Probe Verarbeitung Gel in einer Mikrowelle für 20 Sekunden oder bis verflüssigt, und fügen Sie 50 Mikroliter des Liquifizierten Gelzuleines zu jeder Röhre von Organoiden.Legen Sie die Röhren auf Eis, bis das Probenverarbeitungsgel erstarrt ist, und übertragen Sie den Tropfen der Organoide von jedem Rohr auf die blauen Schwammpolster in einer Kassette zur Weiterverarbeitung im Paraffin-Einbau. Legen Sie die Kassette in einen 15 Minuten pro Schritt programmierten Gewebeprozessor und abschnitten Sie dann die paraffineingebetteten Organoide in Probenverarbeitungsgel mit vier Mikrometern pro Abschnitt für immunhistochemische Färbung und Analyse nach Standardprotokollen. Extrahepatische Gallengang organoide Beschichtung Effizienz ist etwa 2%, wenn von neonatalen oder erwachsenen Mäusen isoliert.Nach Durchgang zwei erhöht sich die Beschichtungseffizienz von extrahepatischen Gallengangsorganoiden, die von erwachsenen Mäusen abgeleitet wurden, auf 11% und bleibt stabil. Die Mehrheit der Organoide zeigt eine zystische Morphologie in allen Passagen mit seltenen unregelmäßigen Organoiden. Die Organoide erreichen einen Wachstumsgipfel von fünf bis sieben Tagen, danach beginnen sie, sich intraluminale Ablagerungen anzusammeln und verschlechtern sich.Daher sollten die Organoide zur Aufrechterhaltung der Organoidkultur alle sieben bis zehn Tage geteilt werden. Bei der Analyse mit Immunfluoreszenz bestehen extrahepatische Gallenkanal-Organoide aus einer reinen Population von Epithelzellen, die durch E-Cadherin gekennzeichnet sind. Organoide Zellen zeigen auch Marker von Gallenvorläuferzellen sowie Marker der Gallendifferenzierung.Wichtig ist, dass ein hoher Prozentsatz organoider Zellen ein primäres Cilium besitzt, das durch acetyliertes Alpha Tubulin gekennzeichnet ist, was ein Merkmal normaler Cholangiocyten ist und eine geeignete organoide Zellpolarisation nahelegt. Eine enge Einhaltung des beschriebenen Temperaturzustandes ist erforderlich. Eine sorgfältige Gallengangssektion verhindert eine Kontamination der Bauchspeicheldrüsenzellen.Der Verlust von zellulärem Material kann durch sorgfältige Manipulation nach zentrifugieren vermieden werden. Diese Organoide können als präklinische Modelle verwendet werden, genetisch und pharmakologisch manipuliert, oder verwendet werden, um Medikamente und die Auswirkungen von Infektionserregern zu testen. Diese Methode kann von Laboren verwendet werden, die genetisch veränderte Mausmodelle nutzen möchten, um die Mechanismen der Cholangiozytenbiologie weiter zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...