Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקאית את פרס מחקר של פסגת מחלות הכבד (ל. נ) מכוני הבריאות הלאומיים, במכון הלאומי של סוכרת ואת העיכול ומחלות כליה (פרסים P30 DK34933 נ, DK062041 P01 כדי J.L.M.). אנו מודים ד ר רמון Ocadiz-רואיז (אוניברסיטת מישיגן) על העזרה שלו עם פיתוח מתודולוגיה זו.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת ציוד וחומרים לבידוד EHBD העכבר
<ol><li>להכין בינונית זריעה, מאגר כביסה (טבלה של חומרים) ב- 50 מ ל צינורות חרוט ולשמור אותם ב 4 ° C או על קרח עד השימוש.</li>
	<li>בצע כיוו?...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

עבודה זו מתארת את הדור של מודל תלת-ממדי organotypic של העכבר EHBD cholangiocytes. צעדים חשובים בדור תרבות EHBDO כוללים ניתוח קפדני EHBD כדי למנוע זיהום תא לבלב, תחזוקת בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום חיידקים ופטריות, מניפולציה זהיר לאחר צנטריפוגה כדי למנוע אובדן חומר הסלולר. הדבקות קרוב בתנאי טמפרטורה שתואר ...

Cholangiopathies הן הפרעות פרוגרסיבית כרונית חשוכת מרפא המשפיעים על תאים בכיס המרה ממוקם אינטרה - ו צינוריות המרה extrahepatic (EHBDs)1. Cholangiopathies מסוימים, כמו מחלת כבד כרונית חסימתית, cholangiocarcinoma, בהכנת בכיס המרה, ציסטות choledochal, משפיעים בעיקר על EHBDs. ההתפתחות של טיפולים cholangiopathies הוא מוגבל על ידי המוגבל של מודלים פרה. בנוסף, מחקרים קודמים התמקדו cholangiopathies המקובצים יחד: הכבד, אינטרה- ו EHBDs. עם זאת, אינטרה - EHBDs של מקור עובריים שונים והם יהיו, לכן, צריך להיחשב פתולוגיות מולקולרית ברורים. צינורות המרה intrahepatic להתפתח הלוחות ductal intrahepatic והחלק הגולגולת של הסעיף הכבד, EHBDs כל לפתח מן החלק סימטרית של הסעיף הכבד2. הם גם להסתמך על תאים תאים קדמון שונים הומאוסטזיס למבוגרים, כולל תעלות של הרינג צינורות המרה intrahepatic ובלוטות peribiliary2,EHBDs3. השימוש במודלים ללימודי פרה מוגבל על ידי הוצאות, צריך להיות ממוזער מסיבות מוסריות. לכן, רדיוקציוניסטי, לשחזור, זמן ומודלים במבחנה חסכוניים הן רצוי מאוד.
רוב המחקרים מוקדמת של cholangiopathies מנוצל העכבר הרגיל או עכברוש סרטן מודלים, או שורות תאים אנושיים cholangiocarcinoma נגזר אינטרה - ו6,5,4,EHBDs7. אולם, אלו הם דגמי תאים טרנספורמציה, לא מסכם את הדברים cholangiocyte נורמלי ביולוגיה או הומאוסטזה במצב בריא. התקדמות האחרונות בפיתוח מודלים של תרבות organotypic אפשרה הפיתוח של מבנים תלת-ממדי של סוגי רקמות שונות, כולל רקמות כיס המרה, למרות העכבר הרגיל לא EHBDs8,9, 10. מבנים אלה "איברים כמו" מכוון מחקה רקמות העיקרי, גדלים בנישה מלאכותי תמיכה התחדשות עצמית של תאי גזע ייחודיים/קדמון11.
"תא צורב" היא רחבה בטווח זה רוב מתאר בדרך כלל מודלים תלת-ממדי רקמות שמקורם בתאי גזע. ניתן להפיק Organoids של pluripotent מחדש תאי גזע המיוצג על-ידי תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. הם גם ניתן להפיק תאי גזע בוגרים ייחודיים12. דגמים תא צורב cholangiocyte הוצעו במחקרים קודמים של המחקר. לפיכך, organoids שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושית כבר דווח על7,9,13 ולספק כלי רב ערך, זמן יעיל המאפשר לדור בו זמנית של סוגי תאים שונים. עם זאת, אלה organoids נגזר תאי גזע pluripotent אינן משקפות באופן מלא את המבנה ואת הפונקציונליות של ראשי cholangiocytes EHBD למבוגרים.
Organoids שמקורם בתאי גזע בוגרים של האדם9 , חתולים10 הכבד הוצעו גם. מודלים של חתולים אינם זמינים באופן נרחב, יש מוגבל כלי armamentarium למטרות מחקר. יתר על כן, אלה הכבד-derived מבוגרים נגזר תאי גזע organoids לא מודל extrahepatic cholangiocytes אבל cholangiocytes intrahepatic למדי.
EHBD תא צורב דור דווח בין אדם נורמלי EHBDs14 ו העכבר EHBD cholangiocarcinoma15. עם זאת, גישה EHBD-רקמה אנושית מוגבלת מאד ולאחר organoids נגזר מודל מאתר גנטי של cholangiocarcinoma15 אינם מייצגים הביולוגיה cholangiocyte בריא הומאוסטזיס נגזרים מתאי מהונדס גנטית.
כדי לטפל המגבלות של pluripotent תאי הגזע ואת הכבד-נגזר cholangiocyte תא צורב מודלים וגישה מוגבלת ברקמות אנושיות צורך במודלים פרה, פיתחנו מודל תא צורב EHBD מאתר (איור 1 א'). כתב יד זה מתאר את ההתפתחות של טכניקה עבור העכבר נגזר EHBD organoids מרקמות למבוגרים. אלה organoids EHBD בשם EHBDOs יהיה כלי במבחנה חשוב בחקר המנגנונים שבבסיס EHBDs cholangiocyte הומאוסטזיס ומחלות תהליכים, כגון cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, אשר משפיעים על צינורות המרה extrahepatic (EHBDs), כוללים בהכנת בכיס המרה, מחלת כבד כרונית חסימתית ו- cholangiocarcinoma. להם אין אפשרויות טיפולית יעילה. כלים ללמוד EHBD מוגבלים מאוד. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל ייחודיים, תכליתי למבוגרים, תאי גזע, נגזר, פרה cholangiocyte זה ניתן להפיק בקלות של פראי סוג ועכברים מהונדסים גנטית. לפיכך, אנו מדווחים על הטכניקה הרומן של פיתוח מערכת תרבות תא צורב (EHBDO) EHBD מ- EHBDs העכבר למבוגרים. המודל הוא חסכוניים, מסוגל בקלות להיות מנותח, ויש לו מספר יישומים במורד הזרם. באופן ספציפי, אנו מתארים את המתודולוגיה של העכבר EHBD בידוד, דיסוציאציה תא בודד, חניכה תרבות תא צורב, הפצת, ואת תחזוקה לטווח הארוך ואחסון. כתב יד זה מתאר גם EHBDO עיבוד אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של mRNA שפע כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית-PCR). פרוטוקול זה יש יתרונות משמעותיים בנוסף לייצור organoids EHBD ספציפיים. השימוש במדיום ממוזגים מתאי L-WRN מפחית באופן משמעותי את העלות של מודל זה. השימוש העכבר EHBDs מספק רקמות כמעט בלתי מוגבל לדור תרבות, בניגוד רקמה אנושית. העכבר שנוצר EHBDOs להכיל אוכלוסיה טהור של תאים אפיתל עם סמנים של קדמון endodermal והוא הבדיל תאים בכיס המרה. Organoids בתרבית לשמור על מורפולוגיה הומוגנית דרך מעברים מרובים, ניתן לשחזר לאחר אחסון לטווח ארוך של חנקן נוזלי. המודל מאפשר לחקר התפשטות תאים קדמון בכיס המרה, ניתן לטפל בנושא פרמקולוגית, וכן עלול להיווצר מתוך עכברים מהונדסים גנטית. מחקרים עתידיים נחוצים כדי למטב את תרבות תנאים על מנת להגביר את היעילות יופיצ, להעריך תא פונקציונלי בגרות ולאחר ישירה תאית התמיינות. פיתוח מודלים של תרבות משותפת, מטריצה חוץ-תאית נייטרלי יותר ביולוגית הם גם רצוי.

פרוטוקול שלנו מתאר את הדור של העכבר EHBD organoids רקמות ספציפיות, מבוגר נגזר תאי גזע. לאחר organoids מתורבתים, ניתן לצפות מוקדם ככל 1 יום לאחר הבידוד EHBD צורה מבנה פיברוזיס. זיהום עם fibroblasts לא נצפית בדרך כלל בעת יצירת תרבות. EHBDO יופיצ יעילות הוא כ 2% כאשר מבודד neonatal או למבוגרים (שגילם חוד...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

מערכת אורגנואידית צינור מרה חוץ-פתולוגית זו יכולה לטפל בגישה המוגבלת למודלים של כולנגיופתיות פרה-קליניות ולמגבלות של תאי גזע פלוריפוטנטיים ומודלים אורגנואידים של צ'ולנגיוציטה שמקורם בכבד. המודל שלנו הוא ספציפי לרקמות למבוגרים, רדוקציוניסטי, ניתן לשחזור, ותזמן וחסכוני. זה יהיה לתועלת מיוחדת למעבדות כי אין גישה לרקמות אנושיות.הטכניקה שלנו מאפשרת culturing של מספר כמעט בלתי מוגבל של cholangiocytes צינור המרה extrahepatic ללמוד התחדשות רקמות אינטראקציות תא לתא. הפגנת ההליך תהיה ג'וניה שיוטה, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. לבידוד צינור המרה ההפוכות, מניחים את העכבר הבוגר בתווית על-חושית ופתיחת חלל הבטן לאורך קו האמצע.יש לחזור בכבד כדי לנוח על הסרעפת ולהשתמש בהמוסטט כדי למשוך בעדינות את התריסום הפרוקסימלי כדי לחשוף את צינור המרה הנפוץ מיד מתחת לעצם הכבד. השתמש אזמל כדי להפריד את צינור המרה extrahepatic מן הרקמות שמסביב. מחזיק את הקצה הפרוקסימלי של צינור המרה המשותף עם מלקחיים, לנתח את הצינור distally ממש מעל הצומת שלה עם התריסיון לפני לנתח את הקצה הפרוקסימלי של הצינור מהכבד.מיד מניחים את צינור המרה החוץ-עורי המבודד לתוך צלחת זכוכית המכילה חיץ כביסה קר על קרח, ולאחר מכן לנקות את צינור המרה מן הרקמה שמסביב טחון לתוך 0.5 מילימטר חלקים. כאשר כל הרקמה כבר טחון, להעביר את החלקים לתוך צינור המכיל 500 microliters של חיץ דיסוציאציה עבור דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדיסוציאציה, לנטרל את החיץ עם 500 microliters של תאים קרים כקרח תרבות בינונית triturate השעיית הרקמה 20 פעמים דרך מחט 18 מד ולאחר מכן 20 פעמים דרך מחט 20 מד.ואז לסנן את ההשעיה התא וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר. כדי להקים תרבות אורגנואידית מרה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות להסיר את supernatant. תבזבזו מחדש את גלולת גלולה במיליליטר אחד של PBS קר כקרח, סטרילי ולהעביר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה שנייה.תן שוב את גלולת שטף ב 120 microliters של מטריצת מרתף נזילות, קר כקרח צלחת 40 microliters של תאים למרכז של כל שלוש בארות של 37 מעלות צלזיוס מחומם, צלחת 24 היטב, ולאחר מכן למקם את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס רקמת תרבות החממה במשך כ 15 דקות. כאשר מטריצת המרתף התגבשה, מוסיפים 600 מיקרוליטרים של 37 מעלות צלזיוס זורעים בינוניים לכל באר לפני שמחזירים את הצלחת לאנקובטור. לאחר שלושה ימים וכל שלושה ימים לאחר מכן, החלף את מדיום הזריעה ב-600 מיקרוליטרים של מדיום תרבות אורגנואידית טרייה, וניטור צמיחת האורגנואידים באופן קבוע במיקרוסקופ הפוך.כדי לעבור את תרבות צינור המרה יוצאות התכלית, פיפטה האורגנואידים בכל באר עם 400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח 10 פעמים ל הבאר לפני העברת תכולת הבאר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר. מעבר כל תערובת דרך מחט 25-מד ארבע פעמים כדי לנתק את האורגנואידים ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים במטריצת המרתף ביחס המתאים ל ציפוי מחדש.לאחסון ארוך טווח של צינור מרה חוץ-פתיל, יש לשטוף כל באר של אורגנואידים עם PBS בטמפרטורת החדר מבלי להפריע למטריצת המרתף ולהוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיום מקפיא קר כקרח לכל באר. יש לעכל בעדינות את האורגנואידים ולהעביר את התערובת לבקבוקונים קריוגניים בודדים, ולאחר מכן מניחים את הבקבוקונים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני העברת האורגנואידים למיכל חנקן לאחסון ארוך טווח בשלב האדים. כדי להכין את האורגנואידים להטמיע פרפין, החלף את המדיום ב-500 מיקרוליטרים של ארבע מעלות צלזיוס PBS והעבר את המתלים מכל באר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר המכילים מטריצת מרתף נזילות.לאסוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ולהשתמש קצה פיפטה P1000 שונה כדי להסיר בזהירות את supernatants מבלי להפריע כדורי. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של קרח קר, 4% paraformaldehyde לאורגנואידים עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, החלף את התיקון עם מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר PBS עבור דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה שלוש פעמים.לאחר הכביסה האחרונה, יש להתרכך באורגנואידים במיליליטר אחד של 30% אתנול עבור דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות במיליליטר אחד של 70% אתנול בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה 70%אתנול, לאסוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה resuspend האורגנואידים במיליליטר אחד של 100% אתנול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה 100%אתנול, דגימת חום עיבוד ג'ל במיקרוגל במשך 20 שניות או עד נזול, ולהוסיף 50 microliters של ג'ל נזול לכל צינור של אורגנואידים.מניחים את הצינורות על קרח עד שג'ל עיבוד הדגימה מתמצק ומעבירים את טיפת האורגנואידים מכל צינור בין רפידות הספוג הכחולות בקלטת לעיבוד נוסף בהטבעת הפרפין. מניחים את הקלטת במעבד רקמות מתוכנת במשך 15 דקות לכל צעד, ולאחר מכן לקטע את האורגנואידים מוטבע פרפין בג'ל עיבוד דגימה בארבעה מיקרומטרים לכל קטע עבור כתמים אימונוהיסטוכימיים וניתוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. יעילות ציפוי צינור המרה יוצאת הרפאים היא כ-2% כאשר היא מבודדת מעכברים יילודים או מעכברים בוגרים.לאחר מעבר שני, יעילות ציפוי של אורגנואידים צינור מרה extrahepatic נגזר עכברים בוגרים עולה ל 11%ונשאר יציב. רוב האורגנואידים מדגימים מורפולוגיה ציסטיק לאורך כל המעברים עם אורגנואידים לא סדירים נדירים. האורגנואידים מגיעים לשיא צמיחה של חמישה עד שבעה ימים, ולאחר מכן הם מתחילים לצבור פסולת תוך-אלומיניום ומתדרדרים.לכן, לשמירה על תרבות האורגנואידים, יש לפצל את האורגנואידים כל שבעה עד עשרה ימים. כאשר מנותחים עם immunofluorescence, אורגנואידים צינור מרה extrahepatic מורכב מאוכלוסייה טהורה של תאי אפיתל מסומן על ידי E-cadherin. תאים אורגנואידיים גם להדגים סמנים של תאים מולדים המרה, כמו גם סמנים של בידול המרה.חשוב לציין, אחוז גבוה של תאים אורגנואידים יש סיליום ראשוני מסומן על ידי אצטילאט אלפא Tubulin, שהוא תכונה של cholangiocytes נורמלי ומציע קיטוב תא אורגנואיד מתאים. נדרשת הקפדה צמודה על תנאי הטמפרטורה המתוארים. ניתוח צינור המרה המוקפד מונע זיהום בתאי הלבלב.אובדן של חומר הסלולר ניתן להימנע על ידי מניפולציה זהירה לאחר צנטריפוגה. אורגנואידים אלה יכולים לשמש מודלים פרה-קליניים, גנטית ופרמקולוגית מניפולציה, או משמש לבדיקת תרופות ואת ההשפעות של סוכנים זיהומיות. שיטה זו יכולה לשמש מעבדות שרוצות לנצל מודלים עכבר מהונדסים גנטית כדי להמשיך לחקור את המנגנונים של ביולוגיה cholangiocyte.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...