Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla associazione americana per il premio di studio del fegato malattie Pinnacle (di N.R.) e il National Institutes of Health, National Institute of Diabetes e digestivo e delle malattie renali (premi P30 DK34933 di N.R., P01 DK062041 a J.L.M.). Ringraziamo il dottor Ramon Ocadiz-Ruiz (Università del Michigan) per la sua assistenza con lo sviluppo di questa metodologia.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Michigan.
1. preparazione di attrezzature e materiali per l'isolamento EHBD Mouse
<ol><li>Preparare mezzo semina e tampone di lavaggio (Tabella materiali) in 50 mL provette coniche e conservare a 4 ° C o su ghiaccio fino all'utilizzo.</li>
	<li>Istituito un tavolo chirurgico (Figura 1B). Preparare gli strumenti chirurgici ...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Questo lavoro descrive la generazione di un modello 3-dimensionale organotipiche del mouse EHBD colangiociti. Passi importanti nella generazione di cultura EHBDO includono dissezione meticolosa EHBD per evitare la contaminazione delle cellule di pancreas, mantenimento di condizioni di sterilità per evitare contaminazioni batteriche e fungine e un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione per evitare il perdita di materiale cellulare. Una stretta aderenza alle condizioni di temperatura descritto è necessaria. Ci son...

Cholangiopathies sono incurabili disordini progressivi cronici che colpiscono le cellule biliari situate in intra e dotti biliari extrahepatic (EHBDs)1. Alcuni cholangiopathies, come colangite sclerotica primaria, colangiocarcinoma, atresia biliare e le cisti del coledoco, interessano principalmente EHBDs. Sviluppo di terapie per cholangiopathies è limitato dalla disponibilità limitata di modelli preclinici. Inoltre, studi precedenti incentrato su cholangiopathies raggruppati: fegato, intra- ed EHBDs. Tuttavia, intra - ed EHBDs hanno un'origine embrionale distinta e, quindi, dovrebbe essere considerata come patologie molecolari distinte. Dotti biliari intraepatici sviluppano dalle piastre ductal intraepatiche e della parte cranica del diverticolo epatico, tutta EHBDs sviluppare da parte caudale del diverticolo epatico2. Si affidano anche compartimenti cellulari differenti progenitore per adulto omeostasi, compresi canali di Hering in dotti biliari intraepatici e ghiandole peribiliari in EHBDs2,3. Uso di modelli animali per studi preclinici è limitata dalla spesa e deve essere ridotto al minimo per motivi etici. Di conseguenza, riduzionista, riproducibile, tempo e costo-efficienti modelli in vitro sono altamente desiderabili.
Maggior parte degli studi precedente di cholangiopathies utilizzato mouse normale o modelli di ratto del cancro o colangiocarcinoma umano linee cellulari derivate da intra - ed EHBDs4,5,6,7. Tuttavia, questi sono modelli di cellule trasformate e non ripassare biologia dei colangiociti normale omeostasi o in uno stato sano. Recenti progressi nello sviluppo di modelli di coltura organotypic ha permesso lo sviluppo di strutture 3-dimensionale da diversi tipi di tessuto, compresi i tessuti di hepatobiliary, anche se non normale mouse EHBDs8,9, 10. Queste strutture di "organo-come" puntato che imita il tessuto primario e sono cresciute in una nicchia artificiale sostegno auto-rinnovamento delle cellule staminali/progenitrici di organo-specifiche cellule11.
"Organoid" è un vasto termine che più comunemente vengono descritti modelli 3-dimensionale del tessuto derivate da cellule staminali. Organoids può essere generato da riprogrammate pluripotenti le cellule staminali rappresentata da cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte. Inoltre possono essere generate da cellule staminali adulte di organo-specific12. Sono stati proposti alcuni modelli di organoid dei colangiociti in precedenti studi di ricerca. Così, organoids derivato da cellule staminali pluripotenti umane sono stati segnalati7,9,13 e fornire uno strumento efficiente di prezioso, tempo che consente la generazione simultanea di diversi tipi di cellule. Tuttavia, questi organoids derivati da cellule staminali pluripotenti non riflettono completamente la struttura e la funzionalità del primario adulto EHBD colangiociti.
Organoids derivate da cellule staminali adulte del umano9 e felino10 del fegato sono stati anche proposti. Modelli di felini non sono ampiamente disponibili e hanno limitato armamentario di strumento per motivi di studio. Inoltre, questi fegato-derivate organoids derivati da cellule staminali di adulti non modellare extrahepatic colangiociti ma piuttosto intraepatico colangiociti.
Generazione di organoid EHBD è stato segnalato da umano normale EHBDs14 e mouse EHBD colangiocarcinoma15. Tuttavia, accesso ai tessuti umani EHBD è estremamente limitato e organoids derivata da un modello genetico murino di colangiocarcinoma15 non rappresentano dei colangiociti sano biologia all'omeostasi e sono derivati dalle cellule geneticamente modificate.
Per risolvere le limitazioni di pluripotent derivati da cellule staminali e fegato dei colangiociti organoid modelli e l'accesso limitato ai tessuti umani necessari in modelli preclinici, abbiamo sviluppato un modello murino di organoid EHBD (Figura 1A). Questo manoscritto descrive lo sviluppo di una tecnica per mouse organoids EHBD-derivate da tessuto adulto. Questi organoids EHBD denominato EHBDOs sarà un importante strumento in vitro per lo studio dei meccanismi alla base di EHBDs dei colangiociti omeostasi e processi di malattia, come ad esempio cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, che interessano i dotti biliari extrahepatic (EHBDs), includono atresia biliare, colangite sclerosante primitiva e colangiocarcinoma. Non hanno nessuna opzione terapeutica efficace. Strumenti per studiare EHBD sono molto limitati. Il nostro scopo era di sviluppare un modello dei colangiociti preclinici, derivati da cellule staminali organo-specifiche, versatile, adulto che può essere facilmente generato da wild type e topi geneticamente modificati. Quindi, segnaliamo sulla nuova tecnica di sviluppare un sistema di coltura EHBD organoid (EHBDO) da EHBDs di topo adulto. Il modello è costo-efficiente, in grado di essere facilmente analizzati, e ha molteplici applicazioni a valle. In particolare, descriviamo la metodologia di isolamento EHBD mouse e dissociazione singola cella, organoid cultura iniziazione, propagazione e mantenimento a lungo termine e deposito. Questo manoscritto descrive anche EHBDO elaborazione per immunoistochimica, microscopia fluorescente e quantificazione di abbondanza del mRNA da reazione a catena della polimerasi in tempo reale di trascrizione d'inversione quantitativa (qRT-PCR). Questo protocollo ha significativi vantaggi oltre a produrre organoids EHBD specifici. L'uso di un medium condizionato dalle cellule L-WRN riduce significativamente il costo di questo modello. L'uso del mouse EHBDs fornisce quasi illimitato del tessuto per la generazione di cultura, a differenza di tessuto umano. EHBDOs del mouse generati contengono una popolazione pura di cellule epiteliali con marcatori del progenitore endodermico e biliare cellule differenziate. Colta organoids mantenere omogenea morfologia attraverso passaggi multipli e possono essere recuperate dopo un lungo periodo di conservazione in azoto liquido. Il modello consente lo studio di proliferazione delle cellule progenitrici biliare, può essere manipolato farmacologicamente e può essere generato da topi geneticamente modificati. Gli studi futuri sono necessari per ottimizzare le condizioni di coltura al fine di aumentare l'efficienza di placcatura, valutare la maturità funzionale delle cellule e differenziazione cellulare diretto. Sviluppo di modelli di co-coltura e una matrice extracellulare più biologicamente neutra sono anche auspicabile.

Il nostro protocollo descrive la generazione di mouse EHBD organoids che sono tessuto-specifici e adulto derivati da cellule staminali. Dopo il organoids sono coltivate, una formazione di struttura cistica può essere osservata più presto 1 giorno dopo l'isolamento EHBD. Contaminazione con i fibroblasti non è osservata tipicamente durante la generazione di cultura. EHBDO efficienza di placcatura è di circa il 2% quando isolato da neonatale o adulto (età superiore a 2 mesi) topi (<stro...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Questo protocollo descrive la produzione di un sistema di 3-dimensionale organoid del mouse dei dotti biliari extrahepatic. Questi organoids biliare può essere mantenute in coltura per studiare biologia dei colangiociti. Organoids biliare esprimono marcatori di cellule progenitrici e cellule biliari e sono composte da cellule epiteliali polarizzate.

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Questo sistema organoide del condotto biliare extraepatico murino può affrontare il limitato accesso ai modelli di colangiopatie precliniche e i limiti dei modelli organoidi di cellule staminali pluripotenti e corigiociti derivati dal fegato. Il nostro modello è specifico per i tessuti adulti, riduzionista, riproducibile ed efficiente in termini di tempo e costi. Sarà di particolare beneficio per i laboratori che non hanno accesso ai tessuti umani.La nostra tecnica consente la coltivazione di un numero quasi illimitato di conlangiociti del condotto biliare extraepatico per studiare la rigenerazione dei tessuti e le interazioni cellula-cellula. A dimostrare la procedura sarà Junya Shiota, un post-doc del mio laboratorio. Per l'isolamento intraepatico del condotto biliare, posizionare il topo adulto in posizione supina e aprire la cavità addominale lungo la linea mediana.Ritrarre il fegato per riposare sul diaframma e utilizzare un emostato per estrarre delicatamente il duodeno prossimale per rivelare il condotto biliare comune immediatamente sotto l'hilum epatico. Utilizzare un bisturi per separare il condotto biliare extraepatico dai tessuti circostanti. Tenendo l'estremità prossimale del condotto biliare comune con le forcep, sezionare il condotto distally appena sopra la sua congiuntura con il duodeno prima di sezionare l'estremità prossimale del condotto dal fegato.Posizionare immediatamente il condotto biliare extraepatico isolato in una piastra di vetro contenente tampone di lavaggio freddo sul ghiaccio, quindi pulire il condotto biliare dal tessuto circostante e tritare in sezioni di 0,5 millimetri. Quando tutto il tessuto è stato tritato, trasferire le sezioni in un tubo contenente 500 microlitri di tampone di dissociazione per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della dissociazione, neutralizzare il tampone con 500 microlitri di terreno di coltura delle cellule ghiacciate e triturare la sospensione tissutale 20 volte attraverso un ago calibro 18 e quindi 20 volte attraverso un ago calibro 20.Quindi filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Per stabilire una coltura organoide biliare, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimuovere con cura il supernatante. Rimorsi il pellet in un millilitro di PBS sterile e ghiacciato e trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri per una seconda centrifugazione.Rimostrare il pellet lavato in 120 microlitri di matrice seminterrata liqueficata e ghiacciata e piastra 40 microlitri di cellule al centro di ciascuno dei tre pozzi di una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius e 24 po ', quindi posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale di 37 gradi Celsius per circa 15 minuti. Quando la matrice del seminterrato si è solidificata, aggiungere 600 microlitri di 37 gradi Celsius mezzo di semina ad ogni pozzo prima di restituire la piastra all'incubatore. Dopo tre giorni e tre giorni dopo, sostituire il mezzo di semina con 600 microlitri di mezzo di coltura organoide fresco, monitorando regolarmente la crescita organoide con un microscopio invertito.Per passare le colture extraepatiche del condotto biliare, pipettare gli organoidi in ogni pozzo con 400 microlitri di PBS ghiacciato 10 volte per pozzo prima di trasferire il contenuto del pozzo su singoli tubi da 1,5 millilitri. Passare ogni miscela attraverso un ago calibro 25 quattro volte per dissociare gli organoidi e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi rimospendare le celle nella matrice del seminterrato al rapporto appropriato per la ri-placcatura.Per la conservazione organoide del condotto biliare extraepatico a lungo termine, lavare ogni pozzo di organoidi con PBS a temperatura ambiente senza disturbare le gocce della matrice del seminterrato e aggiungere 500 microlitri di mezzo gelido ghiacciato ad ogni pozzo. Rimostrare delicatamente gli organoidi e trasferire la miscela in singole fiale criogeniche, quindi posizionare le fiale a meno 80 gradi Celsius per 48 ore prima di trasferire gli organoidi in un serbatoio di azoto per lo stoccaggio a lungo termine in una fase di vapore. Per preparare gli organoidi per l'incorporamento della paraffina, sostituire il mezzo con 500 microlitri di quattro gradi Celsius PBS e trasferire la sospensione da ogni pozzo in singoli tubi da 1,5 millilitri contenenti matrice seminterrata liquefatta.Raccogliere gli organoidi per centrifugazione e utilizzare una punta di pipetta P1000 modificata per rimuovere con cura i supernatanti senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo, paraformaldeide al 4% agli organoidi per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, sostituire il fissatore con un millilitro di PBS a temperatura ambiente per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e lavare gli organoidi con centrifugazione tre volte.Dopo l'ultimo lavaggio, resuspend gli organoidi in un millilitro di 30% di etanolo per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, seguita da un'incubazione di cinque minuti in un millilitro di 70% di etanolo a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione del 70% di etanolo, raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione e rimosorne gli organoidi in un millilitro di etanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione al 100% di etanolo, il gel di lavorazione del campione di calore in un forno a microonde per 20 secondi o fino a quando non viene liquefatto e aggiungere 50 microlitri del gel liquefatto a ciascun tubo di organoidi.Posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando il gel di lavorazione del campione non viene solidificato e trasferire la goccia di organoidi da ciascun tubo a tra i cuscinetti di spugna blu in una cassetta per un'ulteriore lavorazione nell'incorporatore di paraffina. Posizionare la cassetta in un processore tissutale programmato per 15 minuti per passaggio, quindi sessare gli organoidi incorporati nella paraffina nel gel di lavorazione del campione a quattro micrometri per sezione per la colorazione e l'analisi immunoistochimica secondo protocolli standard. L'efficienza di placcatura organoide del condotto biliare extraepatico è di circa il 2% se isolata da topi neonatale o adulto.Dopo il secondo passaggio, l'efficienza di placcatura degli organoidi del condotto biliare extraepatico derivati da topi adulti aumenta all'11% e rimane stabile. La maggior parte degli organoidi dimostra una morfologia cistica in tutti i passaggi con rari organoidi irregolari. Gli organoidi raggiungono un picco di crescita da cinque a sette giorni, dopo di che iniziano ad accumulare detriti intraluminali e si deteriorano.Pertanto, per il mantenimento della coltura organoide, gli organoidi devono essere divisi ogni sette-10 giorni. Se analizzati con immunofluorescenza, gli organoidi del condotto biliare extraepatico consistono in una popolazione pura di cellule epiteliali marcate da E-cadherina. Le cellule organoidi dimostrano anche marcatori di cellule progenitrici biliari e marcatori di differenziazione biliare.È importante sottolineare che un'alta percentuale di cellule organoidi possiede un cilio primario segnato da alfa tubulina acetilata, che è una caratteristica dei normali corilangiociti e suggerisce un'appropriata polarizzazione delle cellule organoidi. È necessaria una stretta aderenza alla condizione di temperatura descritta. La meticolosa dissezione del condotto biliare previene la contaminazione delle cellule del pancreas.La perdita di materiale cellulare può essere evitata con un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione. Questi organoidi possono essere usati come modelli preclinici, geneticamente e farmacologicamente manipolati, o utilizzati per testare farmaci e gli effetti degli agenti infettivi. Questo metodo può essere utilizzato da laboratori che vogliono sfruttare modelli di topi geneticamente modificati per studiare ulteriormente i meccanismi della biologia dei conlangiociti.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...