Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

この作品は、アメリカ協会 (ノーマン ・) に研究の肝疾患ピナクル賞、国立衛生研究所、国立糖尿病、消化器・腎臓病 (ノーマン ・ J.L.M. に影響するもの P01 DK062041 に P30 DK34933 賞受賞) によって支えられました。この方法論の開発と彼の援助ありがとう博士ラモン Ocadiz-ルイス (ミシガン大学)。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学によって承認されています。
1. マウス EHBD 分離用装置および材料の準備
<ol><li>播種培地と 50 mL の洗浄バッファー (材料表) の円錐管を準備し、使用するまで 4 ° c または氷の上にそれらを保ちます。</li>
	<li>手術台 (図 1 b) を設定します。滅菌外...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

この作品では、マウス EHBD 胆管の切片 3次元モデルの生成について説明します。EHBDO 文化世代の重要なステップは、膵臓細胞汚染、細菌および真菌の汚染と遠心分離を避けるために後慎重に操作を防ぐために滅菌条件の整備を避けるため細心の EHBD 郭清、細胞材料の損失。記載されている温度条件との密着が必要です。手法にいくつかの制限があります。成体マウスの EHBDs、小さな (約 1 mm の...

Cholangiopathies は、内・肝外胆管 (EHBDs)1に位置する胆管細胞に影響を与える難病の慢性進行性疾患です。原発性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道閉鎖症と総胆管の嚢胞のようないくつかの cholangiopathies は、EHBDs を主に影響します。Cholangiopathies 治療法の開発は、前臨床モデルの限られた供給によって制限されます。さらに、先行研究をまとめ cholangiopathies に焦点を当て: 肝臓、内および EHBDs。しかし、内 EHBDs 異なる胚起源を持っているし、したがって、異なる分子病態として考慮されるべき。肝内胆管は、肝膵板と肝憩室の頭蓋の一部から開発、肝憩室2の尾の部分から全体の EHBDs を開発します。彼らはまた、肝内胆管と EHBDs2,3の後腺ヘリングの運河を含む大人の恒常性の異なる前駆細胞コンパートメントに依存します。前臨床研究のための動物モデルの使用費用によって制限され、倫理的な理由のため最小限に抑える必要があります。したがって、還元、再現性のある、時間およびコスト効率の高い体外モデルは非常に望ましいです。
Cholangiopathies のほとんどの先行研究では、正常マウスまたはラット癌モデルまたは EHBDs4,5,6,7からひと胆管癌細胞の増殖を利用されています。ただし、これらは変換されたセルのモデルであり、通常 cholangiocyte 生物の恒常性や健康状態を再現できません。切片培養モデルの開発の最近の進展は、正常ではないマウス EHBDs8,9、肝胆道系組織を含む、異なる組織タイプから 3 次元構造の開発を許可しています。 10。これらの「オルガンのような"構造は主な組織模倣目的し、11臓器特異幹/前駆細胞の自己複製を支援人工ニッチで栽培されて。
「Organoid」は広範な言葉それほとんど一般幹細胞由来三次元組織モデルをについて説明します。オルガノイドをプログラムし直された多能性幹細胞は胚性幹細胞で表され、誘導多能性幹細胞から生成できます。彼らはまた臓器特異成体幹細胞12から生成できます。いくつかの cholangiocyte におけるモデルは、以前の研究で提案されている.したがって、ひと多能性幹細胞由来 organoids 報告7,9,13をされている、異なる種類の細胞を同時生成できる、貴重な時間の効率的なツールを提供します。ただし、構造と機能の主なアダルト EHBD 胆管に、完全に、これら多能性幹細胞由来 organoids は反映されません。
9の人間の成人の幹細胞から派生したオルガノイドとネコ10肝はまた提案しました。猫のモデルは広く利用可能ではないと研究用ツール装備一式が限られています。また、これら肝臓由来成人幹細胞オルガノイドむしろ肝内胆管、肝外胆管にモデル化を行います。
EHBD organoid 世代は人間普通 EHBDs14マウス EHBD 肝門部胆管癌の15から報告されました。EHBD 人体へのアクセスは非常に限られた organoids に由来する胆管細胞癌15の遺伝的マウスモデルは恒常性の生物学の健康的な cholangiocyte ではないし、遺伝子組換え細胞由来します。
多能性幹細胞と肝臓由来 cholangiocyte organoid モデルおよび前臨床モデルで必要とされる人間の組織への限られたアクセスの制限に対処するには、マウス EHBD organoid モデル (図 1 a) を開発しました。本稿では、マウス成体組織から EHBD 派生オルガノイドの技術の開発について説明します。EHBDOs の名前これら EHBD オルガノイド EHBDs cholangiocyte の恒常性と病気プロセス、cholangiopathies などの基になるメカニズムの研究のための重要な生体外のツールになります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎、胆管癌、肝外胆管 (EHBDs) に影響を与える、Cholangiopathies が含まれます。彼らは効果的な治療オプションであるないです。EHBD を検討するためのツールは非常に制限されます。私たちの目的は、野生型および遺伝子改変マウスから簡単に生成することができます臓器特異、汎用性の高い、大人の幹細胞、臨床 cholangiocyte モデルを開発することでした。したがって、成体マウス EHBDs から EHBD (EHBDO) における文化システムの開発手法について報告する.モデルはコスト効率の高い、容易に分析することができる複数のダウン ストリーム アプリケーションであり。具体的には、マウスの EHBD 分離と単一細胞解離、organoid 文化発生, 伝ぱと長期的な保守とストレージの方法論について述べる。この原稿には、リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) による免疫組織化学、蛍光顕微鏡および mRNA 豊富な定量処理 EHBDO もについて説明します。このプロトコルには、EHBD 固有オルガノイドを生産に加えて重要な利点があります。L 警告細胞馴化培地の使用このモデルのコストを大幅に削減します。EHBDs ・ マウスの使用は、人間の組織とは異なり、文化世代のほぼ無制限の組織を提供します。生成されたマウス EHBDOs 内皮前駆細胞のマーカーと上皮細胞の純粋な人口を含めるし、胆管細胞を分化します。オルガノイド培養は複数の通路を通って同種の形態を維持し、液体窒素で長期保管後回復することができます。モデル肝前駆細胞増殖に関する研究では、薬理学的、操作することができます、遺伝子組み換えマウスから生成される可能性があります。将来の研究は、めっき効率を高める機能を細胞の成熟と分化の直接評価するために培養条件を最適化するために必要です。共培養モデルともっと生物学的に中立的な細胞外マトリックスの開発も目指しています。

提案プロトコルでは、組織特異的幹細胞から派生した大人は、マウス EHBD オルガノイドの世代について説明します。オルガノイド培養される後、嚢胞構造形成 EHBD 分離後 1 日も早く観測できます。通常、線維芽細胞の混入は文化の生成中には反映されません。EHBDO めっき効率は約 2% (2 か月より古い) 新生児または成人から分離されたときマウス (図 2 b<...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids 前駆細胞と胆管細胞のマーカーの表現し、偏光の上皮細胞で構成されています。

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

このマウスの肝外胆管オルガノイドシステムは、前臨床胆管障害モデルへの限定的なアクセスと多能性幹細胞および肝臓由来胆管オルガノイドモデルの限界に対処することができる。当社のモデルは、成人組織固有、還元主義者、再現性、時間とコスト効率が高いモデルです。これは、人間の組織へのアクセスを持っていない研究所に特別な利益になります.我々の技術は、組織再生および細胞間相互作用を研究するために、ほぼ無制限の数の肝外胆管胆管コリンギオサイトの培養を可能にする。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターである塩田純也です。肝内胆管分離の場合は、成体マウスをスピーヌ位置に置き、中線に沿って腹腔を開きます。肝臓を引き込んで横隔膜に置き、止まり地を使用して近位十二指腸を優しく引っ張り、肝臓のヒラムのすぐ下に共通の胆管を明らかにする。メスを使用して、肝外胆管を周囲の組織から分離します。一般的な胆管の近位端を鉗子で保持し、十二指腸との分岐点のすぐ上に遠位で管を解剖してから、肝臓から管の近位端を解剖する。分離した肝外胆管を氷上の冷たい洗浄バッファーを含むガラス板にすぐに入れ、周囲の組織から胆管を洗浄し、0.5ミリメートルの切片にミンチします。すべての組織をミンチした後、500マイクロリットルの解離バッファーを含むチューブに切片を移し、摂氏37度で20分間インキュベートします。解離の終わりに、500マイクロリットルの氷冷細胞培養培地で緩衝液を中和し、18ゲージ針を通して組織懸濁液を20回、20ゲージの針を通して20回トリチュレートする。その後、得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにフィルター処理します。胆道オルガノイド培養を確立するには、遠心分離によって細胞を収集し、上清を慎重に除去する。氷冷、滅菌PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、2番目の遠心分離のために1.5ミリリットルのチューブに細胞を移します。洗浄したペレットを120マイクロリットルの液化、氷冷地下マトリックス、プレート40マイクロリットルの細胞を37度加温した24ウェルプレートの3つの井戸の中央に再懸濁し、37度の摂氏組織培養インキュベーターに約15分間プレートを置きます。地下マトリックスが固まったら、プレートをインキュベーターに戻す前に、各ウェルに37°Cの播種培地の600マイクロリットルを加えます。3日後、その後3日ごとに、600マイクロリットルの新鮮なオルガノイド培地で播種培地を交換し、逆顕微鏡でオルガノイドの成長を定期的にモニタリングする。肝外胆管培養を通過するには、各井戸のオルガノイドを400マイクロリットルの氷冷PBSで10回ずつピペットしてから、ウェル内容物を個々の1.5ミリリットルチューブに移す。各混合物を25ゲージの針を4回通過させ、オルガノイドを解体し、遠心分離によって細胞を集める。次に、再めっきに適切な比率で基質マトリックス中の細胞を再懸濁します。長期にわたる肝外胆管オルガノイド貯蔵のために、地下マトリックスの低下を妨げずに室温PBSでオルガノイドの各井戸を洗浄し、各井戸に500マイクロリットルの氷冷凍結培地を加える。オルガノイドを穏やかに再中断し、混合物を個々の極低温バイアルに移し、バイアルをマイナス80度で48時間置き、オルガノイドを窒素タンクに移して蒸気相で長期保存します。パラフィン埋め込み用のオルガノイドを準備するには、培地を摂氏4度の500マイクロリットルに置き換え、各ウェルから液化基質マトリックスを含む個々の1.5ミリリットルチューブに懸濁液を移します。遠心分離によってオルガノイドを収集し、慎重にペレットを邪魔することなく上清を除去するために、修正されたP1000ピペットチップを使用しています。その後、氷冷の1ミリリットル、4%パラホルムアルデヒドをオルガノイドに加え、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、固定剤を室温で5分間のインキュベーションのために室温PBSの1ミリリットルに置き換え、遠心分離によってオルガノイドを3回洗浄する。最後の洗浄後、オルガノイドを30%エタノールの1ミリリットルで室温で5分間インキュベーションし、続いて室温で70%エタノールの1ミリリットルで5分間のインキュベーションを行います。70%エタノールインキュベーションの終わりに、遠心分離によってオルガノイドを収集し、室温で5分間100%エタノールの1ミリリットルでオルガノイドを再懸濁する。100%エタノールインキュベーションの終わりに、電子レンジで20秒間または液化するまで加熱検体処理ゲルを、オルガノイドの各チューブに50マイクロリットルの液化ゲルを加えた。試料処理ゲルが固まるまでチューブを氷の上に置き、パラフィン埋め込み機でさらに処理するためにカセットの青いスポンジパッドの間に各チューブからオルガノイドの滴を移します。カセットを1ステップあたり15分間プログラムされた組織プロセッサに入れ、標準的なプロトコルに従って免疫組織化学的染色および分析のために、検体処理ゲル中のパラフィン埋め込まれたオルガノイドをセクションあたり4マイクロメートルで切り離します。肝外胆管オルガノイドめっきの効率は、新生児または成体マウスのいずれかから単離した場合、約2%である。2回通過後、成体マウス由来の肝外胆管オルガノイドのめっき効率は11%に増加し、安定したままである。オルガノイドの大部分は、まれな不規則なオルガノイドを有するすべての箇所全体で嚢胞形態を示す。オルガノイドは5〜7日で成長ピークに達し、その後、内膜破片の蓄積を開始し、悪化する。したがって、オルガノイド培養の維持のために、オルガノイドは7〜10日ごとに分割されるべきである。免疫蛍光で分析すると、肝外胆管オルガノイドは、E-カドヘリンによってマークされた上皮細胞の純粋な集団からなる。オルガノイド細胞はまた、胆道前駆細胞のマーカーと同様に胆道分化のマーカーを示す。重要なことに、オルガノイド細胞の割合が高いのは、アセチル化アルファチューブリンによってマークされた一次シリウムを有し、これは正常な胆管球の特徴であり、適切なオルガノイド細胞分極化を示唆している。記載された温度条件への近い付着が必要である。細心の注意を払った胆管解離は膵臓細胞の汚染を防ぐ。遠心分離後の慎重な操作により、細胞材料の損失を回避できます。これらのオルガノイドは、前臨床モデルとして使用することができ、遺伝的および薬理学的に操作され、または薬物および感染性薬剤の効果を試験するために使用される。この方法は、遺伝子組み換えマウスモデルを利用して、コリンギオライト生物学のメカニズムをさらに研究したいラボで使用することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

マウス肝臓における胆管密度の決定

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...