Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

이 작품은 간 질병 피나 클의 연구 상 (N.R.)에 국립 보건원, 국립 연구소의 당뇨병과 소화기를 위한 미국 협회 및 신장 질병 (N.R., J.L.M. P01 DK062041 P30 DK34933 수상)에 의해 지원 되었다. 이 방법론의 발달로 그의 도움에 감사 박사 라몬 Ocadiz-루이즈 (미시간 대학) 하 고.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 EHBD 절연 용 장비 및 재료의 준비
<ol><li>시드 매체 및 세척 버퍼 (자료 테이블) 50 ml에서 원뿔 관을 준비 하 고 그들에 게 사용까지 4 ° C에서 또는 얼음에 계속.</li>
	<li>수술 테이블 (그림 1B)를 설정 합니다. 멸 균된 수술 도?...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

이 작품의 마우스 EHBD cholangiocytes organotypic 3 차원 모델의 생성을 설명합니다. 췌 장 세포 오염, 세균 및 곰 팡이 오염 및 피하기 위해 원심 분리 후 주의 조작 방지 하기 위해 살 균 조건의 유지 보수를 방지 하려면 세심 한 EHBD 해 부를 포함 하는 EHBDO 문화 세대의 중요 한 단계는 세포질 물자의 손실입니다. 설명된 온도 조건에 가까운 준수가 필요 합니다. 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 성인 생?...

Cholangiopathies는 내부-및 extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)1에 있는 담 즙 셀에 영향을 주는 불 치 만성 진보적인 장애. 기본 차 경화 담 관 염, cholangiocarcinoma, 담 즙이 폐쇄 증, choledochal cysts 같은 일부 cholangiopathies EHBDs에 주로 영향을 줍니다. Cholangiopathies에 대 한 치료의 개발 전 임상 모델의 제한 된 가용성에 의해 제한 됩니다. 또한, 이전 연구 cholangiopathies 그룹화에 초점: 간, 내부 및 EHBDs. 그러나, 내부-및 EHBDs 다른 배아 기원 있고, 따라서, 명료한 분자 병 리도 고려 되어야 한다. Intrahepatic 담 즙 덕트 intrahepatic ductal 접시와 간장 계실의 두개골 부분에서 개발, 전체 EHBDs 간 계실2의 꼬리 부분에서 개발. 그들은 또한 성인 항상성, intrahepatic 담 즙 덕트 및 EHBDs2,3peribiliary 동맥에서 Hering의 운하를 포함 하 여에 대 한 다른 조상 세포 구획에 의존. 전 임상 연구를 위한 동물 모델의 사용 비용에 의해 제한 하 고 윤리적인 이유로 최소화 한다. 따라서, reductionist, 재현성, 시간 및 비용 효율적인 체 외 모델은 매우 바람직하다.
Cholangiopathies의 대부분의 이전 연구 활용 일반 마우스 또는 쥐 암 모델, 또는 인간의 cholangiocarcinoma 셀 라인 내부-및 EHBDs4,5,,67에서 파생 된. 그러나,이 변형 된 세포의 모델 이며 정상적인 cholangiocyte 생물학 항상성 또는 정상 상태에서를 정리 하지 않습니다. Organotypic 문화 모델의 개발에 최근 진행 다른 조직 종류, 하지만 하지 일반 마우스 EHBDs8,9, 간담 조직를 포함 하 여 3 차원 구조의 개발을 허용 했다 10. 이러한 "기관" 구조로 기본 조직을 흉내 낸 겨냥 하 고 기관 특정 줄기/뿌리 세포11의 자기 갱신을 지 원하는 인공 틈새에서 성장 된다.
"Organoid"는 광범위 한 용어는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 파생 된 3 차원 조직 모델을 설명 합니다. Organoids 재설정된 pluripotent 줄기 세포 배아 줄기 세포로 표현 하 고 유도 만능 줄기 세포에서에서 생성 될 수 있습니다. 그들은 또한 기관 특정 성인 줄기 세포12에서 생성 될 수 있습니다. 일부 cholangiocyte organoid 모델 이전 연구에서 제안 되었습니다. 따라서, 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 보고7,,913 이었고 다른 세포 유형의 동시 세대에 대 한 수 가치, 시간 효율적인 도구를 제공. 그러나, 이러한 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 구조와 기본 성인 EHBD cholangiocytes의 기능 완벽 하 게 반영 하지 않습니다.
인간의9 의 성인 줄기 세포에서 파생 된 Organoids 그리고 고양이10 간도 제안 했다. 고양이 모델 널리 사용 되지 않으며 도구 armamentarium 연구 목적에 대 한 제한. 또한, 이러한 간 파생 성인 줄기 세포 유래 organoids extrahepatic cholangiocytes 하지만 오히려 intrahepatic cholangiocytes 모델 하지 않습니다.
EHBD organoid 세대는 인간의 정상적인 EHBDs14 와 마우스 EHBD cholangiocarcinoma15에서 보고 되었다. 그러나, 인간의 EHBD 조직에 대 한 액세스는 매우 제한 된, 그리고 cholangiocarcinoma15 의 유전자 murine 모델에서 파생 된 organoids 항상성에서 건강 한 cholangiocyte 생물학을 대표 하지 않는다 유전자 변형 세포에서 파생 됩니다.
만능 줄기 세포 및 간 파생 된 cholangiocyte organoid 모델 및 전 임상 모델에서 필요한 인간의 조직에 대 한 제한 된 액세스의 한계를 해결 하기 위해 우리는 murine EHBD organoid 모델 (그림 1A)를 개발 했다. 이 원고 마우스 성인 조직에서 EHBD 파생 된 organoids에 대 한 기술 개발을 설명합니다. EHBDOs 라는이 EHBD organoids EHBDs cholangiocyte 항상성 및 질병 과정, cholangiopathies 같은 기본 메커니즘의 연구에 대 한 중요 한 생체 외에서 도구가 될 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)에 영향을 미치는 담 즙이 폐쇄 증, 기본 차 경화 담 관 염, 및 cholangiocarcinoma 포함 됩니다. 그들은 효과적인 치료 옵션이 있다. EHBD를 공부 하는 도구는 매우 제한 됩니다. 우리의 목적은 야생 유형 및 유전자 조작된 생쥐에서 쉽게 생성 될 수 있는 기관 특정, 다목적, 성인 줄기 세포 유래, 전 임상 cholangiocyte 모델을 개발 했다. 따라서, 우리는 성인 마우스 EHBDs에서 EHBD organoid (EHBDO) 문화 시스템 개발의 새로운 기술에 보고 합니다. 모델은 비용 효율적이 고 쉽게 분석할 수 있으며 여러 다운스트림 응용 프로그램. 특히, 마우스 EHBD 절연 및 단일 세포 분리, organoid 문화 개시, 전파, 그리고 장기적인 유지 관리 및 저장의 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 EHBDO를 실시간 양이 많은 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (qRT-PCR) immunohistochemistry, 형광 현미경 검사 법, 그리고 mRNA 풍부 정량에 대 한 처리를 설명 합니다. 이 프로토콜 EHBD 특정 organoids를 생산 하는 것 외에도 중요 한 장점이 있습니다. L WRN 셀에서 조건 화 된 매체의 사용은 크게이 모델의 비용을 줄일 수 있습니다. 마우스 EHBDs 사용 하 여 거의 무제한 조직을 문화 세대, 인간의 조직 달리 합니다. 생성 된 마우스 EHBDOs endodermal 조상의 표식이 있는 상피 세포의 순수한 인구를 포함 하 고 담 즙 세포 분화. 교양된 organoids 여러 통로 통해 동일한 형태를 유지 하 고 액체 질소에는 장기 저장 후 복구할 수 있습니다. 모델 담 즙 조상 세포 증식의 연구에 대 한, 약리학, 조작할 수 있으며 유전자 조작된 생쥐에서 생성 될 수 있습니다. 미래 연구는 도금 효율을 평가 하는 기능 세포 성숙, 직접 세포 분화 배양 조건 최적화 필요 합니다. 개발 공동 문화 모델과 더 생물학적으로 중립 세포 외 매트릭스의 바람직한 있습니다.

우리의 프로토콜 마우스 EHBD organoids는 조직 관련 성인 줄기 세포 유래의 생성을 설명 합니다. 후에 organoids 교양, 낭 성 구조 형성 빠르면 1 일 EHBD 격리 후 관찰할 수 있습니다. 섬유 아 세포와 오염 문화 생성 하는 동안 일반적으로 관찰 하지. EHBDO 도금 효율은 약 2% (2 개월 이상) 신생아 또는 성인에서 고립 된 쥐 (그림 2B). EHBD organoids의 효율성을 도금 ?...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

이 뮤린 외형 담관 오르가노이드 시스템은 전임상 담관증 모델에 대한 제한된 접근과 다능성 줄기 세포 및 간 유래 콜린고이티테 오르가노이드 모델의 한계를 해결할 수 있습니다. 우리의 모델은 성인 조직 특정, 감소주의자, 재현 가능, 시간과 비용 효율적인. 그것은 인간의 조직에 액세스 할 수없는 실험실에 특별한 도움이 될 것입니다.우리의 기술은 조직 재생 및 세포 대 세포 상호 작용을 연구하기 위하여 외형 담관 cholangiocytes의 거의 무제한 수의 배양을 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 의사 인 주야 시오타 (Junya Shiota)가 될 것입니다. 간 내 담관 격리의 경우 성인 마우스를 척추 위치에 놓고 중간선을 따라 복강을 엽니다.횡격막에 휴식 간을 철회하고 부드럽게 간 힐룸 바로 아래 일반적인 담관을 공개하는 근위 십이지장 당기기 기 위해 hemostat을 사용합니다. 메스를 사용하여 외형 담관과 주변 조직을 분리하십시오. 집게와 일반적인 담관의 근위 끝을 잡고, 간에서 덕트의 근접 끝을 해부하기 전에 십이지장과 그 시점 바로 위에 덕트를 해부.즉시 격리 된 외형 담관을 얼음에 차가운 세척 버퍼가 들어있는 유리 접시에 넣은 다음 주변 조직에서 담관을 청소하고 0.5 밀리미터 섹션으로 다진다. 모든 조직이 다진 경우, 37섭씨에서 20분 배양을 위해 500마이크로리터의 해리 버퍼를 포함하는 튜브로 섹션을 옮기십시오. 해리의 끝에서, 얼음 차가운 세포 배양 배지의 500 마이크로 리터로 버퍼를 중화하고 18 게이지 바늘을 통해 조직 현탁액을 20 번 세례한 다음 20 게이지 바늘을 통해 20 회.그런 다음 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 생성된 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 필터링합니다. 담즙 오르간 배양을 설정하려면 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 얼음 감기, 멸균 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 두 번째 원심분리를 위해 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.세척된 펠릿을 액화, 얼음 차가운 지하 매트릭스 120마이크로리터로 재차 중단하고 40마이크로리터의 세포를 37도의 3개의 우물 의 중심으로 한 다음, 약 15분 동안 37도의 섭씨 조직 배양 배양에 접시를 놓습니다. 지하 매트릭스가 고화되면 플레이트를 인큐베이터로 되돌리기 전에 각 양에 섭씨 37도의 마이크로리터 600개를 첨가합니다. 그 후 3일마다 파종 배지를 신선한 오르가노이드 배양 배지의 600 마이크로리터로 교체하여 오르가노이드 성장을 정기적으로 반전된 현미경으로 모니터링한다.외형 담관 배양을 통과하기 위해, 각 우물의 오르가노이드를 400 마이크로리터의 얼음-차가운 PBS 10회로 피펫한 후 우물 내용을 개별 1.5 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 25 게이지 바늘을 통해 각 혼합물을 4번 통과하여 오르가노이드를 분리하고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 그런 다음 다시 도금에 적합한 비율로 지하 매트릭스의 세포를 다시 일시 중단합니다.장기 외형 담관 오르가노이드 저장을 위해, 지하 매트릭스 방울을 방해하지 않고 실온 PBS로 오르가노이드의 각 우물을 세척하고 각 우물에 얼음 차가운 냉동 매체의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 유기체를 부드럽게 다시 분리하고 혼합물을 개별 극저온 바이알로 옮긴 다음, 유기체를 증기 상에서 장기 저장하기 위해 질소 탱크로 전송하기 전에 48시간 동안 비아알을 영하 80도의 섭씨에서 놓습니다. 파라핀 포함을 위한 오르가노이드를 준비하려면 배지를 섭씨 4도의 500 마이크로리터로 교체하고 액화 된 지하 매트릭스를 포함하는 개별 1.5 밀리리터 튜브로 각 우물에서 서스펜션을 전송하십시오.원심분리에 의해 오르가노이드를 수집하고 수정된 P1000 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네티츠를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 1 밀리리터의 얼음 추위, 4%의 파라포름알데히드를 오가노이드에 추가하여 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양을 합니다. 다음 날 아침, 실온 PBS의 1 밀리리터로 고정을 교체하고 실온에서 5 분 인큐베이션을 하고 오르가노이드를 원심 분리로 세 번 세척하십시오.마지막 세척 후, 실온에서 5 분 배양에 대한 30 %의 1 밀리리터에 오르가노이드를 다시 중단하고 실온에서 70 %의 에탄올의 1 밀리리터에서 5 분 인큐베이션이 있습니다. 70%에탄올 인큐베이션이 끝나면 원심분리로 오르가노이드를 수집하고 실온에서 5분 동안 1밀리리터1밀리리터로 오르가노이드를 재중단합니다. 100% 에탄올 인큐베이션의 끝에서, 20초 동안 또는 액화될 때까지 전자레인지에 젤을 가열하고, 각 오르가노이드 튜브에 액화 젤 50 마이크로리터를 추가합니다.시편 처리 젤이 고화될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓고 파라핀 임베드더에서 추가 처리를 위해 카세트의 파란색 스폰지 패드 사이로 각 튜브에서 오르가노이드 방울을 전달합니다. 카세트를 단계당 15분 동안 프로그래밍된 티슈 프로세서에 넣은 다음 표준 프로토콜에 따라 면역 조직화학 염색 및 분석을 위해 섹션당 4마이크로미터로 시편 처리 젤에 파라핀 임베디드 오르가노이드를 섹션으로 배치합니다. 엑스트라간 담관 기관도금 효율은 신생아 또는 성인 마우스로부터 분리될 때 약 2%입니다.2항 후, 성인 마우스에서 유래한 외형 담관 오르노이드의 도금 효율이 11%로 증가하여 안정적으로 유지됩니다. 오르가노이드의 대다수는 희귀 불규칙한 오르가노이드를 가진 모든 통로에 걸쳐 낭포성 형태를 보여줍니다. 오르가노이드는 5~7일 만에 성장 피크에 도달하여 장루 잔해를 축적하고 악화되기 시작합니다.따라서 오르가노이드 배양의 유지를 위해 오르가노이드는 7~10일마다 분할되어야 한다. 면역 형광으로 분석할 때, 엑스트라간 담관 오르가노이드는 E-cadherin에 의해 표시된 상피 세포의 순수한 인구로 이루어져 있습니다. Organoid 세포는 또한 담즙 전구 세포의 마커뿐만 아니라 담즙 분화의 마커를 보여줍니다.중요 한 것은, 오르가노이드 세포의 높은 백분율은 아세틸화 알파 Tubulin에 의해 표시 된 기본 실륨을 소유, 이는 정상적인 cholangiocytes의 특징이며 적절 한 오르가노이드 세포 편광을 제안. 설명된 온도 조건에 대한 닫기 준수가 요구된다. 세심한 담관 해부는 췌장 세포 오염을 방지합니다.세포 물질의 손실은 원심 분리 후 주의 깊은 조작에 의해 피할 수 있습니다. 이 오르가노이드는 전임상 모델로 사용될 수 있습니다, 유전및 약리학적으로 조작, 또는 약물과 전염성 에이전트의 효과를 테스트하는 데 사용. 이 방법은 담랑고이트 생물학의 기전을 추가로 연구하기 위하여 유전자 변형된 마우스 모형을 이용하려는 실험실에서 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

연구

발생학

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

마우스 간에서 담관 밀도 결정

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...