Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av American Association for studie av lever sykdommer Pinnacle prisen (til N.R.) og National Institutes of Health, National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer (priser P30 DK34933 til N.R., P01 DK062041 til J.L.M.). Vi takker Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) for hans hjelp med utvikling av denne metoden.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Michigan.
1. utarbeidelse av utstyr og materialer for mus EHBD isolasjon
<ol><li>Forberede seeding medium og vask buffer (Tabell for materiale) i 50 mL konisk rør og holde dem i 4 ° C eller på isen før bruk.</li>
	<li>Definere en kirurgisk tabell (figur 1B). Forberede sterilisert Kirurgiske instrumenter (<strong class=...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Dette verket beskriver generering av en organotypic 3-dimensjonal modell av musen EHBD cholangiocytes. Viktige skritt i EHBDO kultur generasjon inkluderer grundig EHBD disseksjon for å unngå bukspyttkjertelen celle forurensning, vedlikehold av sterile forhold å hindre bakterier og sopp forurensning og forsiktig manipulasjon etter sentrifugering å unngå det tap av mobilnettet materiale. En nær overholdelse beskrevet temperaturer kreves. Det er noen begrensninger med teknikken. EHBDs av voksen mus er små (ca 1 mm i ...

Cholangiopathies er uhelbredelig kronisk progressiv lidelser som påvirker biliær celler i intra- og extrahepatic biliær kanaler (EHBDs)1. Noen cholangiopathies, som primær skleroserende kolangitt, cholangiocarcinoma, biliær atresia og choledochal cyster, påvirker hovedsakelig EHBDs. Utviklingen av terapi for cholangiopathies er begrenset av den begrensede tilgjengeligheten av prekliniske modeller. I tillegg tidligere studier fokuserte på cholangiopathies gruppert: leveren, intra- og EHBDs. Imidlertid intra- og EHBDs har en distinkt embryonale opprinnelse og dermed bør betraktes som ulike molekylær patologi. Intrahepatic galle kanaler utvikle fra intrahepatic ductal platene og kraniale del av hepatisk divertikkel, hele EHBDs utvikle fra caudal del av hepatisk divertikkel2. De er også avhengige av ulike stamfar celle rom for voksen homeostase, inkludert kanalene i Hering i intrahepatic galle kanaler og peribiliary kjertler i EHBDs2,3. Bruk av dyremodeller for prekliniske studier er begrenset av utgifter og bør minimaliseres etiske grunner. Derfor er reduksjonistisk, reproduserbare, tid og kostnadseffektiv i vitro modeller svært ettertraktet.
De fleste tidligere studier av cholangiopathies benyttet normal mus eller rotte kreft modeller, eller menneskelig cholangiocarcinoma cellelinjer intra - og EHBDs4,5,6,7. Men disse er modeller av transformert celler og er recapitulate ikke normal cholangiocyte biologi homeostase eller sunne. Framskritt i utviklingen av organotypic kultur modeller har tillatt utviklingen av 3-dimensjonale strukturer fra ulike vev typer, inkludert sykdommer i lever og vev, men ikke normal mus EHBDs8,9, 10. Disse "orgel-like" strukturer å etterligne primære vev og dyrkes i en kunstig nisje støtte selvtillit fornyelse organ-spesifikke stem/stamfar celler11.
"Organoid" er et bredt begrep som de fleste vanligvis beskriver 3-dimensjonale vev modeller Hentet fra stamceller. Organoids kan genereres fra omprogrammeres pluripotent stamceller representert av embryonale stamceller og indusert pluripotent stamceller. De kan også genereres fra organ-spesifikke voksen stilk celler12. Noen cholangiocyte organoid modeller har blitt foreslått i tidligere undersøkelser. Dermed organoids avledet fra menneskelige pluripotent stamceller har vært rapportert7,9,13 og gi en verdifull, tid effektivt verktøy som lar for samtidige generasjon av forskjellige celletyper. Men gjenspeiler disse pluripotent Stamcelle-avledet organoids ikke fullt strukturen og funksjonaliteten av primære voksen EHBD cholangiocytes.
Organoids stammer fra voksen stilk celler av menneskelig9 og feline10 leveren ble foreslått. Feline modeller er ikke allment tilgjengelig, og har begrenset verktøyet armamentarium for øyemed. Videre er modell ikke disse lever-avledet voksen Stamcelle-avledet organoids extrahepatic cholangiocytes men heller intrahepatic cholangiocytes.
EHBD organoid generasjon ble rapportert fra menneskelige normal EHBDs14 og mus EHBD cholangiocarcinoma15. Imidlertid tilgang til menneskelig EHBD vev er svært begrenset, og organoids fra en genetisk murine modell cholangiocarcinoma15 representerer ikke sunt cholangiocyte biologi ved homeostase og er avledet fra genetisk endret celler.
For å løse begrensningene for pluripotent stamceller - og lever-avledet cholangiocyte organoid modeller og begrenset tilgang til menneskelig vev behov i preklinisk modeller, utviklet vi en murine EHBD organoid modell (figur 1A). Dette manuskriptet beskriver utviklingen av en teknikk for mus EHBD-avledet organoids fra voksen vev. Disse EHBD organoids kalt EHBDOs vil være et viktig i vitro verktøy for studiet av mekanismene bak EHBDs cholangiocyte homeostase og sykdom prosesser, for eksempel cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, som påvirker extrahepatic galle kanaler (EHBDs), inkluderer biliær atresia, primær skleroserende kolangitt og cholangiocarcinoma. De har ingen effektiv behandlingsalternativer. Verktøy for å studere EHBD er svært begrenset. Vårt formål var å utvikle en organ-spesifikke, allsidig, voksen Stamcelle-avledet, preklinisk cholangiocyte modell som lett kan genereres fra vill type og genmodifiserte mus. Derfor rapportere vi om teknikken for å utvikle en EHBD organoid (EHBDO) kultur-systemet fra voksen mus EHBDs. Modellen er kostnadseffektiv, kunne analyseres lett, og har flere nedstrøms programmer. Spesielt beskrive vi metodikk musen EHBD isolasjon og enkelt celle dissosiasjon, organoid kultur innvielsen, overføring, og langsiktig vedlikehold og lagring. Dette manuskriptet beskriver også EHBDO behandling for immunohistochemistry og fluorescerende mikroskopi mRNA overflod kvantifisering av sanntids kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR). Denne protokollen har betydelige fordeler i tillegg til å produsere EHBD-spesifikke organoids. Bruk av et betinget medium fra L-ADV celler reduserer kostnadene for denne modellen. Bruk av mus EHBDs gir nesten ubegrensede vev kultur generasjon, i motsetning til menneskelig vev. Genererte musen EHBDOs inneholder rene innbyggere epitelceller med markører for endodermal stamfar og differensiert biliær celler. Kultivert organoids opprettholde homogen morfologi gjennom flere passasjer og kan gjenopprettes etter en langsiktig lagringsperiode i flytende nitrogen. Modellen muliggjør studiet av biliær stamfar celle spredning, kan manipuleres farmakologisk, og kan genereres fra genmodifiserte mus. Fremtidige studier for å optimere oppdrettsforholdene for å øke plating effektivitet, evaluere funksjonelle celle modenhet og direkte celledifferensiering. Utvikling av co kultur modeller og en mer biologisk nøytral ekstracellulær matrix er også ønskelig.

Våre protokollen beskriver generering av musen EHBD organoids som er vev-spesifikke og voksen Stamcelle-avledet. Etter at organoids er kultivert, kan en cystisk struktur formasjon observeres så tidlig som en dag etter EHBD isolasjon. Forurensning med fibroblaster er ikke vanligvis observert under kultur generasjon. EHBDO plating effektiviteten er ca 2% når isolert fra neonatal eller voksen (eldre enn to måneder) mus (figur 2B). Kontaktflate effektiviteten...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Denne protokollen beskriver produksjon av en mus extrahepatic galle duct 3-dimensjonale organoid system. Disse biliær organoids kan vedlikeholdes i kultur å studere cholangiocyte biologi. Biliær organoids express markører for både stamfar og biliær celler og består av polarisert epitelceller.

Generasjon av Organoids fra mus Extrahepatic galle kanaler

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Dette murine ekstrahepatiske gallegangorganoidsystemet kan adressere begrenset tilgang til prekliniske kolangiopatier modeller og begrensningene av pluripotent stamcelle og leveravledede kolangiocytt organoid modeller. Vår modell er voksenvevsspesifikk, reduksjonist, reproduserbar og tid og kostnadseffektiv. Det vil være til spesiell fordel for laboratorier som ikke har tilgang til menneskelig vev.Vår teknikk gjør det mulig å kultere et nesten ubegrenset antall ekstrahepatiske gallegangs cholangiocytes å studere vevregenerering og celle-til-celle interaksjoner. Å demonstrere prosedyren vil være Junya Shiota, en post-doc fra laboratoriet mitt. For intrahepatisk gallegangsisolering, legg den voksne musen i liggende stilling og åpne bukhulen langs midtlinjen.Trekk leveren tilbake for å hvile på membranen og bruk en hemostat for å forsiktig trekke proksimal tolvfingertarmen for å avsløre den vanlige gallekanalen rett under leveren hilum. Bruk en skalpell for å skille den ekstrahepatiske gallekanalen fra det omkringliggende vevet. Holder den proksimale enden av den vanlige gallekanalen med tang, dissekere kanalen distally like over juncture med tolvfingertarmen før dissekere den proksimale enden av kanalen fra leveren.Plasser umiddelbart den isolerte ekstrahepatiske gallekanalen i en glassplate som inneholder kald vaskebuffer på is, og rengjør deretter gallekanalen fra det omkringliggende vevet og hakke i 0,5 millimeter seksjoner. Når alt vevet er hakket, overfører du seksjonene til et rør som inneholder 500 mikroliter dissosiasjonsbuffer for en 20-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av dissosiasjonen nøytraliser bufferen med 500 mikroliter iskalde cellekulturmedium og triturat vevsopphenget 20 ganger gjennom en 18-gauge nål og deretter 20 ganger gjennom en 20-gauge nål.Deretter filtrerer du den resulterende cellesuspensjonen gjennom en 70-mikrometercellesil i et 50-milliliter rør. For å etablere en galleorganoid kultur, samle cellene ved sentrifugering og fjern forsiktig supernatanten. Resuspend pellet i en milliliter iskald, steril PBS og overføre cellene til en 1,5-milliliter rør for en andre sentrifugering.Resuspend vasket pellet i 120 mikroliter av flytende, iskald kjeller matrise og plate 40 mikroliter celler i midten av hver av tre brønner av en 37 grader Celsius-oppvarmet, 24-brønns plate, deretter plassere platen i en 37 grader Celsius vev kultur inkubator i ca 15 minutter. Når kjellermatrisen har størknet, legg til 600 mikroliter på 37 grader Celsius såing medium til hver godt før du returnerer platen til inkubatoren. Etter tre dager og hver tredje dag deretter, erstatte seeding medium med 600 mikroliter av frisk organoid kultur medium, overvåking organoid vekst regelmessig med et omvendt mikroskop.For å passere de ekstrahepatiske gallekanalkulturene, pipette organoidene i hver brønn med 400 mikroliter iskalde PBS 10 ganger per brønn før du overfører brønninnholdet til individuelle 1,5-milliliter rør. Pass hver blanding gjennom en 25-gauge nål fire ganger for å dissosiere organoidene og samle cellene ved sentrifugering. Deretter gjenbruke cellene i kjelleren matrise på riktig forhold for re-plating.For langsiktig ekstrahepatisk gallegang organoid lagring, vask hver brønn av organoider med romtemperatur PBS uten å forstyrre kjelleren matrise dråper og legge til 500 mikroliter iskald frysing medium til hver brønn. Gjenoppstår forsiktig organoidene og overfør blandingen til individuelle kryogene hetteglass, og plasser deretter hetteglassene ved minus 80 grader Celsius i 48 timer før organoidene overføres til en nitrogentank for langvarig lagring i en dampfase. For å forberede organoider for parafininnbygging, erstatt mediet med 500 mikroliter på fire grader Celsius PBS og overføre suspensjonen fra hver brønn til individuelle 1,5-milliliter rør som inneholder flytende kjellermatrise.Samle organoider ved sentrifugering og bruk en modifisert P1000 pipettespiss for å forsiktig fjerne supernativa uten å forstyrre pellets. Tilsett deretter en milliliter iskald, 4% paraformaldehyd til organoidene for en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius. Neste morgen, erstatt fikseringsmiddelet med en milliliter romtemperatur PBS for en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur og vask organoidene ved sentrifugering tre ganger.Etter den siste vasken, resuspend organoider i en milliliter på 30% etanol for en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur, etterfulgt av en fem minutters inkubasjon i en milliliter på 70% etanol ved romtemperatur. På slutten av 70% etanol inkubasjon, samle organoider ved sentrifugering og resuspend organoider i en milliliter på 100% etanol i fem minutter ved romtemperatur. På slutten av 100% etanol inkubasjon, varmeprøvebehandling gel i en mikrobølgeovn i 20 sekunder eller til flytende, og legge til 50 mikroliter av den flytende gel til hvert rør av organoider.Legg rørene på is til prøvebehandlingsgelen er størknet og overfør dråpe organoider fra hvert rør til mellom de blå svampputene i en kassett for videre behandling i parafininnbyggingen. Plasser kassetten i en vevsprosessor programmert i 15 minutter per trinn, og del deretter parafin-innebygde organoider i prøvebehandlingsgelen ved fire mikrometer per seksjon for immunohistokjemisk farging og analyse i henhold til standardprotokoller. Ekstrahepatisk gallegang organoid plating effektivitet er ca 2%når isolert fra enten neonatal eller voksne mus.Etter passasje to øker platingeffektiviteten til ekstrahepatiske gallegangsorganoider avledet fra voksne mus til 11%og forblir stabil. Flertallet av organoider viser en cystisk morfologi gjennom alle passasjer med sjeldne uregelmessige organoider. Organoidene når en veksttopp på fem til syv dager, hvor etter hvilke de begynner å samle intraluminalt rusk og forverres.Derfor, for vedlikehold av organoidkulturen, bør organoidene deles hver syv til 10 dager. Når analysert med immunofluorescence, ekstrahepatiske gallegang organoider består av en ren populasjon av epitelceller preget av E-kaderin. Organoidceller viser også markører for gallestamtamceller samt markører for galledilatering.Viktigere, en høy prosentandel av organoide celler har en primær cilium preget av acetylated alfa Tubulin, som er en funksjon av normale kolangiocytter og foreslår en passende organoid celle polarisering. Nær overholdelse av den beskrevne temperaturtilstanden er nødvendig. Omhyggelig gallegangsdeksjon forhindrer bukspyttkjertelcellekontaminering.Tap av cellulært materiale kan unngås ved forsiktig manipulering etter sentrifugering. Disse organoider kan brukes som prekliniske modeller, genetisk og farmakologisk manipulert, eller brukes til å teste narkotika og effekten av smittsomme stoffer. Denne metoden kan brukes av laboratorier som ønsker å dra nytte av genmodifiserte musemodeller for å studere mekanismene for kolangiocyttbiologi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescensanalyse Farging av Muse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generering av IPSC-avledet menneskelige hjerne Organoids til Model Tidlig nevrologiske lidelser

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestemme galle duct tetthet i musen Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av flercellede Human Primary livmor Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generasjon av Mosaic Mammary Organoids ved differensial trypsinisering

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ekstra cellulær matrisebasert og ekstra cellulær matrix-fri generasjon av murine testikkel organoider

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generering og kultur av lingual organoider avledet fra voksen mus smak stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generering av 3D Hele lungeorganoider fra induserte pluripotente stamceller for modellering av lungeutviklingsbiologi og sykdom

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...