Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana para o estudo do fígado doenças Pinnacle award (para S.O.) e o National Institutes of Health, Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças renais (prêmios P30 DK34933 de S.O., P01 DK062041 para J.L.M.). Agradecemos o Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidade de Michigan) pela ajuda com o desenvolvimento desta metodologia.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de equipamentos e materiais para isolamento de Mouse EHBD
<ol><li>Preparar o meio de semeadura e tampão de lavagem (Tabela de materiais) em 50 mL tubos cónicos e mantê-los em 4 ° C ou em gelo até o uso.</li>
	<li>Configure uma mesa cirúrgica (figura 1B). Prepare os instrumentos cirúrgicos...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Este trabalho descreve a geração de um modelo de 3-dimensional organotypic do mouse cholangiocytes EHBD. Passos importantes na geração de cultura EHBDO incluem minuciosa dissecação de EHBD para evitar a contaminação de células do pâncreas, manutenção de condições estéreis para evitar a contaminação bacteriana e fúngica e manipulação cuidadosa após a centrifugação, para evitar o perda de material celular. Uma estreita aderência às condições descritas de temperatura é necessária. Existem alguma...

Cholangiopathies são incuráveis crônicos progressivos distúrbios que afetam as células biliares localizadas no intrae canais biliares extra-hepáticas (EHBDs)1. Alguns cholangiopathies, como Colangiocarcinoma, colangite esclerosante primária, atresia biliar e cistos coledocianos, afetam predominantemente EHBDs. Desenvolvimento de terapias para cholangiopathies é restringido pela disponibilidade limitada de modelos pré-clínicos. Além disso, estudos anteriores focada em cholangiopathies agrupados: fígado, intrae EHBDs. No entanto, intrae EHBDs têm uma origem embrionária distinta e, portanto, devem ser consideradas distintas patologias moleculares. Biliares intra-hepáticos se desenvolvem a partir das placas intra Ductais e a parte cranial do divertículo hepático, EHBDs todo desenvolvem da parte caudal do divertículo hepático2. Eles também contam com compartimentos de células progenitoras diferentes para homeostase adulto, incluindo canais de Hering em glândulas de peribiliary em EHBDs2,3e biliares intra-hepáticos. Utilização de modelos animais para estudos pré-clínicos é limitada pela despesa e deve ser minimizada por razões éticas. Portanto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-eficiente modelos in vitro são altamente desejáveis.
A maioria dos estudos prévios de cholangiopathies utilizaram rato normal ou modelos de câncer do rato ou linhas de células humanas Colangiocarcinoma derivadas intrae EHBDs4,5,6,7. No entanto, estes são modelos de células transformadas e não recapitular biologia cholangiocyte normal em homeostase ou em um estado saudável. Recentes progressos no desenvolvimento de modelos de cultura organotypic permitiu o desenvolvimento de estruturas 3-dimensional de tipos de tecido diferentes, incluindo tecidos de vilosidades, embora não normal do rato EHBDs8,9, 10. Estes "órgãos" estruturas destinadas a imitando tecido primário e são cultivadas em um nicho artificial apoiando auto-renovação de células tronco/progenitoras de órgão específico11.
"Organoides" é um amplo termo que mais comumente descreve modelos de tecido 3-dimensional derivados de células-tronco. Organoids podem ser gerados de pluripotentes reprogramadas, células-tronco representado por células-tronco embrionárias e induzido por células-tronco pluripotentes. Eles também podem ser gerados a partir de células-tronco adultas órgão específico12. Alguns modelos de organoides cholangiocyte têm sido propostos em estudos anteriores. Assim, organoids, derivados de células-tronco pluripotentes humanas têm sido relatados7,9,13 e fornecer um tempo valioso, eficiente ferramenta que permite a geração simultânea de diferentes tipos de células. No entanto, essas organoids de células-tronco derivadas de pluripotentes não refletem totalmente a estrutura e a funcionalidade do adulto primário EHBD cholangiocytes.
Organoids derivados de células-tronco adultas do humano9 e felino10 fígado também foram propostos. Modelos de felinos não estão amplamente disponíveis e limitaram o arsenal de ferramentas para fins de estudo. Além disso, estes organoids células-tronco derivadas adultos derivado de fígado não modelo cholangiocytes extra-hepática mas prefiro intra-hepática cholangiocytes.
Geração de organoides EHBD foi relatada de humano normal EHBDs14 e mouse EHBD Colangiocarcinoma15. No entanto, acesso ao tecido EHBD humano é extremamente limitado, e organoids derivados de um modelo murino genético de colangiocarcinoma15 não representam saudável cholangiocyte biologia na homeostase e são derivadas de células geneticamente modificadas.
Para lidar com as limitações dos modelos organoides cholangiocyte de células-tronco e fígado-derivadas de pluripotentes e o acesso limitado aos tecidos humanos necessários em modelos pré-clínicos, desenvolvemos um modelo murino de organoides EHBD (figura 1A). Este manuscrito descreve o desenvolvimento de uma técnica para mouse organoids EHBD-derivado de tecido adulto. Estes organoids EHBD chamados EHBDOs será uma importante ferramenta in vitro para o estudo dos mecanismos subjacentes EHBDs cholangiocyte homeostase e doença de processos, tais como cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, que afectam os ductos biliares extra-hepáticas (EHBDs), incluem atresia biliar, colangite esclerosante primária e colangiocarcinoma. Eles não têm nenhuma opção terapêutica eficaz. Ferramentas para estudar EHBD são muito limitadas. Nosso objetivo foi desenvolver um modelo de órgão específico, versátil, adulto pré-clínicos, células-tronco derivadas de cholangiocyte que pode ser facilmente gerado de tipo selvagem e camundongos geneticamente modificados. Assim, relatamos a nova técnica de desenvolvimento de um sistema de cultura de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de rato adulto. O modelo é custo-eficiente, capaz de ser prontamente analisadas, e tem múltiplas aplicações a jusante. Especificamente, descrevemos a metodologia de isolamento de EHBD de rato e dissociação de célula única, iniciação de cultura organoides, propagação e manutenção a longo prazo e armazenamento. Este manuscrito também descreve EHBDO processamento de imuno-histoquímica, microscopia fluorescente e quantificação de abundância de mRNA pela reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa transcrição reversa (qRT-PCR). Este protocolo tem vantagens significativas, além de produzir organoids EHBD específicos. O uso de um meio condicionado de células L-WRN reduz significativamente o custo deste modelo. O uso do mouse EHBDs fornece tecido quase ilimitado para geração de cultura, ao contrário de tecido humano. EHBDOs rato gerado contêm uma população pura de células epiteliais com marcadores de endodermal progenitor e biliares células diferenciadas. Organoids cultivadas manter homogénea morfologia através de múltiplas passagens e podem ser recuperados após um período de armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido. O modelo permite o estudo da proliferação das células progenitoras biliar, pode ser manipulado farmacologicamente e pode ser gerado a partir de camundongos geneticamente modificados. Futuros estudos são necessários para otimizar as condições de cultura a fim de aumentar a eficiência do chapeamento, avaliar a maturidade funcional celular e diferenciação celular direto. Desenvolvimento de modelos de co-cultura e uma matriz extracelular mais biologicamente neutro também são desejáveis.

Nosso protocolo descreve a geração de organoids EHBD de rato que são específicos para tecidos e células-tronco derivadas de adulto. Depois que os organoids são cultivadas, uma formação de estrutura cística pode ser observada logo em 1 dia após o isolamento do EHBD. Contaminação com fibroblastos não é tipicamente observada durante a geração de cultura. EHBDO, chapeamento de eficiência é de aproximadamente 2% quando isolado de neonatal ou adultos (mais de 2 meses) ratos (<...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Este protocolo descreve a produção de um sistema de 3-dimensional organoides biliar extra-hepática do mouse. Estes organoids biliares podem ser mantidas em cultura para estudar Biologia cholangiocyte. Organoids biliares expressar marcadores do progenitor e células biliares e são compostos de células epiteliais polarizadas.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Este sistema organoide do ducto biliar biliar de murina extraheptica pode abordar o acesso limitado a modelos de cholangiopatias pré-clínicos e as limitações de células-tronco pluripotentes e modelos organoides de colangiocito derivados do fígado. Nosso modelo é específico de tecido adulto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-benefício. Será de benefício especial para laboratórios que não têm acesso a tecidos humanos.Nossa técnica permite a colheita de um número quase ilimitado de colangiocitos extraháticos do ducto biliar para estudar a regeneração tecidual e as interações célula-célula. Demonstrando o procedimento será Junya Shiota, uma pós-doutora do meu laboratório. Para o isolamento do ducto biliar intraháptico, coloque o camundongo adulto em uma posição supina e abra a cavidade abdominal ao longo da linha média.Retraia o fígado para descansar no diafragma e use um hemostato para puxar suavemente o duodeno proximal para revelar o ducto biliar comum imediatamente abaixo do hilum do fígado. Use um bisturi para separar o ducto biliar extrahático dos tecidos circundantes. Segurando a extremidade proximal do ducto biliar comum com fórceps, disseque o duto distally logo acima de sua conjuntura com o duodeno antes de dissecar a extremidade proximal do duto do fígado.Coloque imediatamente o ducto biliar extraháptico isolado em uma placa de vidro contendo tampão de lavagem frio no gelo, depois limpe o ducto biliar do tecido circundante e pica-se em seções de 0,5 milímetros. Quando todo o tecido tiver sido picado, transfira as seções para um tubo contendo 500 microliters de tampão de dissociação para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da dissociação, neutralize o tampão com 500 microliters de cultura de células geladas média e tritura a suspensão do tecido 20 vezes através de uma agulha de calibre 18 e, em seguida, 20 vezes através de uma agulha de calibre 20.Em seguida, filtrar a suspensão celular resultante através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um tubo de 50 milímetros. Para estabelecer uma cultura organoide biliar, coletar as células por centrifugação e remover cuidadosamente o supernatante. Resuspenque a pelota em um mililitro de PBS gelado e estéril e transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro para uma segunda centrifugação.Resuspenja a pelota lavada em 120 microliters de matriz de porão liquefeito e gelada e placa de 40 microliters de células no centro de cada um dos três poços de uma placa de 37 graus Celsius aquecida, 24-well, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual de 37 graus Celsius por cerca de 15 minutos. Quando a matriz do porão se solidificar, adicione 600 microlitadores de 37 graus Celsius semeando meio a cada poço antes de devolver a placa à incubadora. Após três dias e a cada três dias depois, substitua o meio de semeadura por 600 microlitros de meio de cultura organoide fresco, monitorando o crescimento organoide regularmente por um microscópio invertido.Para passar as culturas extrahepépticas do ducto biliar, pipeta os organoides em cada poço com 400 microliters de PBS gelado 10 vezes por poço antes de transferir o conteúdo do poço para tubos individuais de 1,5 mililitro. Passe cada mistura através de uma agulha de calibre 25 quatro vezes para dissociar os organoides e coletar as células por centrifugação. Em seguida, resuspende as células na matriz do porão na proporção apropriada para re-chapeamento.Para armazenamento organoide de ducto biliar extrahepático de longo prazo, lave cada poço de organoides com PBS de temperatura ambiente sem perturbar as gotas da matriz do porão e adicione 500 microliters de meio de congelamento gelado a cada poço. Levemente resuspenque os organoides e transfira a mistura em frascos criogênicos individuais, em seguida, coloque os frascos a menos 80 graus Celsius por 48 horas antes de transferir os organoides para um tanque de nitrogênio para armazenamento a longo prazo em uma fase de vapor. Para preparar os organoides para incorporação de parafina, substitua o meio por 500 microlitres de quatro graus Celsius PBS e transfira a suspensão de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro contendo matriz de porão liquefeito.Colete os organoides por centrifugação e use uma ponta de pipeta P1000 modificada para remover cuidadosamente os supernantes sem perturbar as pelotas. Em seguida, adicione um mililitro de gelo frio, 4% paraformaldeído aos organoides para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua o fixador por um mililitro de PBS de temperatura ambiente para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente e lave os organoides por centrifugação três vezes.Após a última lavagem, resuspenja os organoides em um mililitro de 30% de etanol para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por uma incubação de cinco minutos em um mililitro de 70% de etanol à temperatura ambiente. Ao final da incubação de 70% de etanol, recolham os organoides por centrifugação e resuspensem os organoides em um mililitro de 100% etanol por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação de 100% de etanol, o gel de processamento de amostras de calor em um micro-ondas por 20 segundos ou até liquefeito, e adiciona 50 microliters do gel liquefeito a cada tubo de organoides.Coloque os tubos no gelo até que o gel de processamento da amostra seja solidificado e transfira a gota de organoides de cada tubo para entre as almofadas azuis de esponja em uma fita para processamento adicional no embedrador de parafina. Coloque o em um processador de tecido programado por 15 minutos por etapa e, em seguida, se sectionia os organoides incorporados à parafina em gel de processamento de amostras a quatro micrômetros por seção para coloração e análise imunohistoquímica de acordo com os protocolos padrão. A eficiência do revestimento organoide do ducto biliar extrahático é de aproximadamente 2% quando isolada de camundongos neonatais ou adultos.Após a segunda passagem, a eficiência de revestimento de organoides extrahêgicos do ducto biliar derivados de camundongos adultos aumenta para 11% e permanece estável. A maioria dos organoides demonstra uma morfologia cística em todas as passagens com organoides irregulares raros. Os organoides atingem um pico de crescimento de cinco a sete dias, após os quais começam a acumular detritos intraluminais e se deterioram.Portanto, para a manutenção da cultura organoide, os organoides devem ser divididos a cada sete a dez dias. Quando analisados com imunofluorescência, organoides extrahepáticos do ducto biliar consistem em uma população pura de células epiteliais marcadas por E-cadherina. As células organoides também demonstram marcadores de células progenitoras biliares, bem como marcadores de diferenciação biliar.É importante ressaltar que uma alta porcentagem de células organoides possuem um cílio primário marcado por tubulina alfa acetilada, que é uma característica de cholangiocitos normais e sugere uma polarização celular organoide apropriada. É necessária uma adesão próxima à condição de temperatura descrita. Dissecção meticulosa do ducto biliar evita contaminação celular do pâncreas.A perda de material celular pode ser evitada por manipulação cuidadosa após centrifugação. Esses organoides podem ser usados como modelos pré-clínicos, geneticamente e farmacologicamente manipulados, ou usados para testar drogas e os efeitos de agentes infecciosos. Este método pode ser usado por laboratórios que querem aproveitar modelos de camundongos geneticamente modificados para estudar melhor os mecanismos da biologia do cholangiocito.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Geração de organoides pulmonares 3D inteiros de células-tronco pluripotentes induzidas para modelagem da biologia e doença do desenvolvimento pulmonar

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...