Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Эта работа была поддержана американской ассоциации исследование печени заболевания Pinnacle премии (чтобы н.р.) и национальных институтов здравоохранения, национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (награды Р30 DK34933 н.р., P01 DK062041 до J.L.M.). Мы благодарим д -р Рамон Ocadiz-Руис (Мичиганский университет) за его помощь в разработке этой методологии.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Мичиганского университета.
1. Подготовка оборудования и материалов для мыши EHBD изоляции
<ol><li>Подготовить посевной средних и стиральные буфера (Таблица материало?...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Эта работа описывает поколение 3-мерной модели мыши EHBD cholangiocytes organotypic. Важные шаги в EHBDO культуры поколения включают в себя тщательное EHBD рассечение во избежание заражения клеток поджелудочной железы, поддержание стерильных условий для предотвращения бактериального и грибкового зараж...

Cholangiopathies являются неизлечимой хронической прогрессивного расстройств, которые влияют на желчных клеток, расположенных в интра - и внепеченочных желчных протоков (EHBDs)1. Некоторые cholangiopathies, как первичный склерозирующий холангит, холангиокарцинома, Билиарной атрезией и Киста холедоха, преимущественно влияет на EHBDs. Разработка терапии для cholangiopathies ограничивается ограниченное наличие доклинических моделей. Кроме того, предыдущие исследования сосредоточены на cholangiopathies, сгруппированных вместе: печень, интра- и EHBDs. Однако внутри - и EHBDs имеют собственный эмбриональное происхождение и, таким образом, следует рассматривать в качестве отдельных молекулярной патологии. Внутрипеченочных желчных протоков развиваются из внутрипеченочных протоковой пластины и черепной частью печеночная дивертикул, весь EHBDs развивать из хвостовой части печени дивертикул2. Они также полагаются на разных прародителя клеточных компартментов для взрослых гомеостаза, включая каналы Геринга внутрипеченочных желчных протоков и peribiliary желез в EHBDs2,3. Использование животных моделей для доклинических исследований ограничивается расходами и должно быть сведено к минимуму, по этическим соображениям. Таким образом упрощенный, воспроизводимость, время и экономически эффективным в пробирке модели являются весьма желательно.
Большинство предыдущих исследований cholangiopathies использованы нормальные мыши или крысы рака модели или человека холангиокарцинома клеточных линий, полученных от интра - и EHBDs4,5,6,7. Однако эти модели трансформированных клеток и не повторить, нормальный cholangiocyte биологии гомеостаза или в здоровом состоянии. Недавний прогресс в разработке моделей organotypic культуры позволил развитие 3-мерных структур из тканей различных типов, включая гепатобилиарной тканей, хотя не нормальные мыши EHBDs8,9, 10. Эти структуры «орган как» направленные на пародирование основной ткани и выращиваются в искусственной ниши, поддержки самообновления органоспецифическая стволовых/прогениторных клеток11.
«Organoid»-это широкий термин, наиболее часто описывает модели 3-мерной ткани, полученные из стволовых клеток. Organoids могут быть сгенерированы из перенесенной плюрипотентных стволовых клеток представлено эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Они также может быть создан из12органоспецифическая взрослых стволовых клеток. Некоторые cholangiocyte органоид модели были предложены в предыдущих исследований. Таким образом organoids, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток были сообщил7,9,13 и предоставить ценные, время эффективным инструментом, который позволяет для одновременной генерации различных типов клеток. Однако эти плюрипотентных стволовых клеток organoids не в полной мере отражает структуру и функциональность основного взрослого EHBD cholangiocytes.
Organoids производным от взрослых стволовых клеток человека9 и кошачьих10 печени были также предложены. Кошачий модели не широко доступны и имеют ограниченный инструмент взята для целей исследования. Кроме того эти функции печени производные взрослых стволовых клеток, полученных organoids не модель внепеченочных cholangiocytes, но скорее внутрипеченочных cholangiocytes.
EHBD органоид поколения было сообщено от человека нормальный EHBDs14 и мыши EHBD холангиокарцинома15. Однако чрезвычайно ограничен доступ к EHBD ткани человека, и organoids производным от генетических мышиных модель холангиокарцинома15 не представляют здорового cholangiocyte биологии гомеостаза и являются производными от генетически модифицированные клетки.
Для устранения ограничений плюрипотентных стволовых клеток и печени, полученных cholangiocyte органоид моделей и ограниченный доступ к ткани человека, необходимо в доклинических моделях, мы разработали модель мышиных EHBD органоид (рис. 1A). Эта рукопись описывается разработка методики для мыши EHBD-производные organoids от взрослых ткани. Эти EHBD organoids с именем EHBDOs будет важным инструментом в пробирке для изучения механизмов, лежащих в основе EHBDs cholangiocyte гомеостаза и болезней процессов, таких как cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, которые затрагивают внепеченочных желчных протоков (EHBDs), включают в себя Билиарной атрезией, первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома. Они имеют без эффективных терапевтических вариантов. Инструменты для изучения EHBD весьма ограничены. Нашей целью было разработать органоспецифическая, универсальный, взрослых стволовых клеток, доклинические cholangiocyte модели, которые могут быть легко сгенерированы от дикого типа и генетически мышей. Таким образом мы сообщаем о Роман методика разработки системы культуры органоид (EHBDO) EHBD от взрослых мыши EHBDs. Модель является экономически эффективным, могут легко анализироваться, и имеет несколько нисходящие приложения. В частности мы описываем методологии мыши EHBD изоляции и одноклеточного диссоциации, органоид культуры посвящения, распространения и долгосрочного обслуживания и хранения. Этот манускрипт также описывает EHBDO обработки для иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мРНК изобилие количественный реального времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Этот протокол имеет значительные преимущества в дополнение к производству EHBD-конкретных organoids. Использование условных среды от клеток L-WRN значительно снижает стоимость этой модели. Использование мыши EHBDs обеспечивает практически неограниченные ткани для формирования культуры, в отличие от человеческих тканей. Сгенерированный мышью EHBDOs содержат чисто населения эпителиальных клеток с маркерами эндодермы прародителя и дифференцированной желчных клетки. Культивированный organoids поддерживать однородные морфология через множественные проходы и могут быть восстановлены после долгосрочного хранения в жидком азоте. Модель позволяет для изучения желчных прародитель пролиферации клеток, можно манипулировать фармакологически и может быть создан из генетически мышей. Будущие исследования необходимы для оптимизации условий культуры с целью повысить эффективность покрытия, оценки функциональных клеток зрелости и прямой клеточная дифференцировка. Желательно также разработка совместного культуры моделей и более биологически нейтральной внеклеточного матрикса.

Наш протокол описывает поколения organoids EHBD мыши, ткане- и взрослых стволовых клеток. После искусственного organoids, формирования кистозных структуры могут наблюдаться как 1 день после EHBD изоляции. Загрязнение с фибробластов не наблюдается обычно во время создания культуры...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Этот протокол описывает производства система 3-мерного органоид мыши внепеченочных желчных протоков. Эти желчных organoids может поддерживаться в культуре для изучения биологии cholangiocyte. Желчных organoids Экспресс маркеры прародителем и желчных клетки и состоят из поляризованные эпителиальных клеток.

Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Этот мурин экстрагепатический желчный проток органоидной системы может решить ограниченный доступ к доклинктической холангиопатии моделей и ограничения плюрипотентных стволовых клеток и печени полученных холангиоцитов органоидных моделей. Наша модель специфична для взрослых, дягецична, воспроизводима, а также эффективна во времени и затратах. Это будет иметь особое преимущество для лабораторий, которые не имеют доступа к человеческим тканям.Наша методика позволяет культивирование почти неограниченного количества экстрагепатических желчных протоков холангиоцитов для изучения регенерации тканей и взаимодействия клеток с клетками. Демонстрацией процедуры будет Дзюня Шиота, пост-док из моей лаборатории. Для внутрицепочной изоляции желчных протоков поместите взрослую мышь в положение на спине и откройте брюшную полость вдоль средней линии.Втягивайте печень, чтобы отдохнуть на диафрагме и используйте гемостат, чтобы мягко вытащить проксимальный двенадцатиперстной носик, чтобы выявить общий желчный проток непосредственно под хилум печени. Используйте скальпель, чтобы отделить экстрагепатический желчный проток от окружающих тканей. Холдинг проксимальный конец общего желчного протока с типсами, вскрыть проток distally чуть выше его стыка с двенадцатиперстной носиком перед вскрытием проксимального конца протока из печени.Немедленно поместите изолированный экстрагепатический желчный проток в стеклянную пластину, содержащую холодный стиральный буфер на льду, затем очистите желчный проток от окружающих тканей и фарш в 0,5-миллиметровые секции. Когда все ткани были измельчены, перенесите секции в трубку, содержащую 500 микролитров буфера диссоциации для 20-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия. В конце диссоциации, нейтрализовать буфер с 500 микролитров ледяной клеточной культуры среды и тритурировать подвеску ткани 20 раз через 18-калиберной иглы, а затем 20 раз через 20-калиберной иглы.Затем процедите полученную подвеску клетки через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку. Чтобы установить желчный органоид культуры, собирать клетки центрифугации и тщательно удалить супернатант. Повторное распределение гранул в один миллилитр ледяной, стерильный PBS и передачи клеток в 1,5-миллилитровую трубку для второй центрифугации.Resuspend промытые гранулы в 120 микролитров сликовой, ледяной подвал матрицы и пластины 40 микролитров клеток в центре каждого из трех скважин 37 градусов по Цельсию нагревается, 24-хорошо пластины, а затем поместить пластину в 37 градусов по Цельсию ткани культуры инкубатор около 15 минут. Когда цокольный матрицы затвердеет, добавить 600 микролитров 37 градусов по Цельсию посева среды для каждого задолго до возвращения пластины в инкубатор. Через три дня и каждые три дня после этого, заменить посев среды с 600 микролитров свежей органоидной культуры среды, мониторинг роста органоидов регулярно с перевернутым микроскопом.Для прохождения экстрагепатических культур желчных протоков, пипетка органоидов в каждом хорошо с 400 микролитров ледяной PBS 10 раз за задолго до передачи содержимого колодец в отдельных 1,5-миллилитровых труб. Прохождение каждой смеси через 25-калиберной иглы четыре раза, чтобы разобщить органоиды и собирать клетки центрифугации. Затем повторное покрытие клеток в цокольной матрице при соответствующем соотношении для повторного покрытия.Для длительного экстрагепатический желчный проток органоидного хранения, мыть каждый колодец органоидов с комнатной температуры PBS, не нарушая подвал матрицы капель и добавить 500 микролитров ледяной замораживания среды для каждой хорошо. Аккуратно пересаживайте органоиды и перенесите смесь в отдельные криогенные флаконы, затем поместите флаконы при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 48 часов перед передачей органоидов в азотный резервуар для длительного хранения в паровой фазе. Чтобы подготовить органоиды для встраивания парафина, замените носитель на 500 микролитров четырех градусов по Цельсию PBS и перенесите суспензию из каждого хорошо в отдельные 1,5-миллилитровые трубки, содержащие сликовую матрицу подвала.Соберите органоиды путем центрифугации и используйте модифицированный наконечник пипетки P1000, чтобы тщательно удалить супернатанты, не нарушая гранулы. Затем добавьте один миллилитр ледяного, 4%paraformaldehyde к органоидам для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро замените фиксатор на один миллилитр комнатной температуры PBS на пятиминутную инкубацию при комнатной температуре и помойте органоиды центрифугой в три раза.После последней стирки, повторно органоидов в один миллилитр 30% этанола для пятиминутной инкубации при комнатной температуре, а затем пятиминутной инкубации в один миллилитр 70%этанола при комнатной температуре. В конце инкубации 70% этанола, собирать органоиды центрифугации и повторно органоидов в один миллилитр 100% этанола в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце 100% инкубации этанола, тепла образца обработки геля в микроволновой печи в течение 20 секунд или до liquified, и добавить 50 микролитров ликовидного геля для каждой трубки органоидов.Поместите трубки на лед до тех пор, пока гель для обработки образцов не затвердеет и не перенесите каплю органоидов из каждой трубки между синими губчатыми прокладками в кассету для дальнейшей обработки в парафиновом встраиваемом. Поместите кассету в тканевой процессор, запрограммированный на 15 минут в шаг, а затем раздел парафин-встроенных органоидов в образец обработки геля на четыре микрометра в разделе для иммуногистохимического окрашивания и анализа в соответствии со стандартными протоколами. Экстрагепатический желчный проток органоидного покрытия эффективность составляет около 2%, когда изолированы от новорожденных или взрослых мышей.После прохождения два, покрытие эффективность экстрагепатических желчных протоков органоидов, полученных из взрослых мышей увеличивается до 11% и остается стабильным. Большинство органоидов демонстрируют кистозную морфологию во всех проходах с редкими нерегулярными органоидами. Органоиды достигают пика роста в пять-семь дней, после чего они начинают накапливать внутрисветовой мусор и ухудшаться.Поэтому для поддержания органоидной культуры органоиды следует расщепать каждые семь-десять дней. При анализе с помощью иммунофлюоресценции внегепатические органоиды желчных протоков состоят из чистой популяции эпителиальных клеток, отмеченных Е-кадерином. Органоидные клетки также демонстрируют маркеры желчных клеток-предшественников, а также маркеры желчной дифференциации.Важно отметить, что высокий процент органоидных клеток обладают первичным цилием, отмеченным ацетилированной альфа-тубулином, который является особенностью нормальных холангиоцитов и предполагает соответствующую поляризацию органоидных клеток. Требуется тесная приверженность описанной температуре. Тщательное рассечение желчных протоков предотвращает загрязнение клеток поджелудочной железы.Потери клеточного материала можно избежать путем тщательных манипуляций после центрифугации. Эти органоиды могут быть использованы в качестве доклинических моделей, генетически и фармакологически манипулировать, или использоваться для тестирования наркотиков и эффекты инфекционных агентов. Этот метод может быть использован лабораториями, которые хотят воспользоваться генетически модифицированными моделями мыши для дальнейшего изучения механизмов биологии холангиоцитов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Генерация IPSC, полученные из органоидов человеческого мозга Модели раннего развития нервной системы Расстройства

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Определение плотности bile Duct в мышечной печени

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Поколение мозаичных органоидов дифференциальной трипсинизации

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Дополнительные сотовые матрицы на основе и экстра сотовой матрицы свободного поколения Murine яичка органоидов

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Генерация и культивация лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослой мыши

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Генерация 3D-органоидов цельных легких из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для моделирования биологии и болезней развития легких

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...