Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana para el estudio del hígado enfermedades Pinnacle Premio (N.R.) y los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (premios DK34933 P30 a N.R., DK062041 P01 a J.L.M.). Agradecemos al Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidad de Michigan) por su ayuda con el desarrollo de esta metodología.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. preparación de equipos y materiales para el aislamiento de EHBD de ratón
<ol><li>Preparar el medio de siembra y tampón de lavado (Tabla de materiales) en 50 mL tubos cónicos y mantenerlos a 4 ° C o en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Establecer una mesa de cirugía (figura 1B). Preparar los in...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Este trabajo describe la generación de un modelo de 3 dimensiones organotypic de ratón cholangiocytes EHBD. Pasos importantes en la generación de cultura EHBDO incluyen la disección meticulosa de EHBD para evitar la contaminación de células de páncreas, mantenimiento de condiciones estériles para evitar la contaminación bacteriana y fúngica y manipulación cuidadosa después de la centrifugación para evitar la pérdida de material celular. Se requiere una adhesión estrecha a las condiciones de temperatura des...

Cholangiopathies son incurables crónica trastornos progresivos que afectan las células biliares en intra y conductos biliares extrahepáticos (EHBDs)1. Algunos cholangiopathies, como colangitis primaria esclerosante, colangiocarcinoma, atresia biliar y quistes coledocales, afectan predominante a EHBDs. Desarrollo de terapias de cholangiopathies está restringida por la limitada disponibilidad de modelos preclínicos. Además, estudios previos enfocados cholangiopathies agrupados: hígado, intra y EHBDs. Sin embargo, intra - y EHBDs tienen un origen embrionario distinto y, por lo tanto, deben considerarse como patologías moleculares distintas. Conductos biliares intrahepáticos se convierten de las placas ductales intrahepáticas y la parte craneal del divertículo hepático, todo EHBDs se convierten de la parte caudal del divertículo hepático2. También cuentan con compartimientos de célula progenitora diferente para homeostasis del adulto, incluyendo los canales de Hering en conductos biliares intrahepáticos y glándulas peribiliary en EHBDs2,3. Uso de modelos animales para estudios preclínicos es limitado por gastos y debe reducirse al mínimo por razones éticas. Por lo tanto, reduccionista, tiempo, reproducible y costo-eficientes modelos in vitro son altamente deseables.
Mayoría de los estudios previa de cholangiopathies utilizados normal del ratón o rata cáncer modelos o colangiocarcinoma humana líneas de células derivadas de intra - y EHBDs4,5,6,7. Sin embargo, estos son los modelos de las células transformadas y no recapitular cholangiocyte normal biología en homeostasis o en un estado saludable. Recientes avances en el desarrollo de modelos de cultura organotypic ha permitido el desarrollo de estructuras 3-dimensionales de tipos de diferentes tejidos, incluyendo tejidos Hepatobiliar, aunque no normal del ratón EHBDs8,9, 10. Estos "órganos" estructuras destinadas a mímico primario del tejido y se cultivan en un nicho artificial apoyando la auto-renovación de las células progenitoras de órgano-específica11.
"Organoide" es un amplio término que más comúnmente se describe modelos de 3 dimensiones del tejido derivados de células madre. Organoides pueden generarse de reprogramadas pluripotentes células madre había representada por las células madre embrionarias e inducida por células madre pluripotentes. También puede generarse a partir de las células madre órgano-específicas12. Se han propuesto algunos modelos de organoide de cholangiocyte en anteriores estudios. Así, organoides derivados de células madre pluripotentes humanas han sido reportados7,9,13 y proporcionan una herramienta eficiente de valioso, tiempo que permite la generación simultánea de diferentes tipos de células. Sin embargo, estos organoides derivados de células madre pluripotentes no reflejan plenamente la estructura y funcionalidad de primaria adultos cholangiocytes EHBD.
Organoides derivan de las células madre adultas de la humana9 y felino10 hígado también fueron propuestos. Modelos felinos no están ampliamente disponibles y tienen un limitado arsenal de herramienta para fines de estudio. Por otra parte, estos organoides de derivados de células madre adultas de derivados hígado no modelo cholangiocytes extrahepática pero cholangiocytes algo intrahepática.
Generación de organoide EHBD informó de humano normal EHBDs14 y ratón EHBD colangiocarcinoma15. Sin embargo, acceso a tejido EHBD humano es extremadamente limitado, y organoides derivados de un modelo murino genético de colangiocarcinoma15 no representan biología de cholangiocyte saludable en homeostasis y se derivan de las células genéticamente modificadas.
Para hacer frente a las limitaciones de pluripotent derivadas de células madre y hígado cholangiocyte organoide modelos y el acceso limitado a los tejidos humanos en modelos preclínicos, hemos desarrollado un modelo murino de organoide EHBD (figura 1A). Este manuscrito describe el desarrollo de una técnica para ratón organitas EHBD derivadas de tejido adulto. Estos organoides EHBD llamados EHBDOs será una importante herramienta en vitro para el estudio de los mecanismos subyacentes a EHBDs cholangiocyte homeostasis y enfermedad procesos como cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, que afectan a los conductos biliares extrahepáticos (EHBDs), incluyen la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria y colangiocarcinoma. No tienen ninguna opciones terapéuticas eficaces. Herramientas para el estudio de EHBD son muy limitadas. Nuestro propósito fue desarrollar un modelo de cholangiocyte preclínicos, derivadas de células madre órgano-específicas, versátil, adultos que se puede generar fácilmente de tipo salvaje y de ratones modificados genéticamente. Así, nos informe sobre la nueva técnica de desarrollo de un sistema de cultivo de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de ratón adulto. El modelo es costo-eficiente, capaz de ser analizado fácilmente, y tiene múltiples usos aguas abajo. Específicamente, se describe la metodología de aislamiento de EHBD de ratón y disociación unicelular, organoide cultura iniciación, propagación y mantenimiento a largo plazo y almacenamiento. Este manuscrito también describe EHBDO procesamiento por inmunohistoquímica, microscopía fluorescente y cuantificación de abundancia del mRNA por reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo tiene ventajas significativas además de producir organoides específicos EHBD. El uso de un medio condicionado de las células L-AVS reduce significativamente el costo de este modelo. El uso del ratón EHBDs proporciona tejido casi ilimitado para la generación de cultura, a diferencia de los tejidos humanos. EHBDOs ratón generados contienen una población pura de células epiteliales con marcadores del progenitor endodérmico y biliares células diferenciadas. Organoides cultivadas mantienen morfología homogénea a través de múltiples pasos y pueden ser recuperados después de un período de almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. El modelo permite el estudio de la proliferación celular biliar del progenitor, se puede manipular farmacológicamente y puede generarse a partir de ratones modificados genéticamente. Se necesitan futuros estudios para optimizar las condiciones de cultivo con el fin de aumentar la eficiencia de la galjanoplastia, evaluar la madurez funcional de la célula y diferenciación celular directa. Desarrollo de modelos de co-cultivo y una matriz extracelular biológicamente más neutral son también deseables.

Nuestro protocolo describe la generación de ratón EHBD organoides que son específicas de tejido y derivados de la célula de vástago del adulto. Después de los organoides se cultivan, la formación de una estructura enquistada puede observarse tan pronto como 1 día después del aislamiento de EHBD. Contaminación con fibroblastos no se observa normalmente durante la generación de cultura. EHBDO eficacia de la galjanoplastia es aproximadamente el 2% cuando están aisladas de neonata...

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Este sistema organoide de conductos biliares extrahepático murino puede abordar el acceso limitado a los modelos de colangiopatías preclínicos y las limitaciones de las células madre pluripotentes y los modelos organoides de colangiocito derivados del hígado. Nuestro modelo es específico de tejido adulto, reduccionista, reproducible y de tiempo y costo y rentable. Será de especial beneficio para los laboratorios que no tienen acceso a los tejidos humanos.Nuestra técnica permite el cultivo de un número casi ilimitado de colangiocitos extrahepáticos de los conductos biliares para estudiar la regeneración tisular y las interacciones de célula a célula. Demostrando el procedimiento estará Junya Shiota, un post-doc de mi laboratorio. Para el aislamiento intrahepático del conducto biliar, coloque el ratón adulto en una posición supina y abra la cavidad abdominal a lo largo de la línea media.Retirar el hígado para descansar sobre el diafragma y utilizar un hemostat para tirar suavemente del duodeno proximal para revelar el conducto biliar común inmediatamente debajo del hilo hepático. Usa un bisturí para separar el conducto biliar extrahepático de los tejidos circundantes. Sosteniendo el extremo proximal del conducto biliar común con fórceps, disecciona el conducto distalmente justo por encima de su coyuntura con el duodeno antes de diseccionar el extremo proximal del conducto del hígado.Coloque inmediatamente el conducto biliar extrahepático aislado en una placa de vidrio que contenga un tampón de lavado en frío sobre hielo, luego limpie el conducto biliar del tejido circundante y miga en secciones de 0,5 milímetros. Cuando todo el tejido haya sido picado, transfiera las secciones a un tubo que contenga 500 microlitros de tampón de disociación para una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la disociación, neutralice el tampón con 500 microlitros de medio de cultivo de células heladas y triturar la suspensión de tejido 20 veces a través de una aguja de calibre 18 y luego 20 veces a través de una aguja de calibre 20.Luego filtre la suspensión celular resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Para establecer un cultivo organoide biliar, recoja las células por centrifugación y retire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro de PBS estéril y helado y transferir las células a un tubo de 1,5 mililitros para una segunda centrifugación.Resuspender el pellet lavado en 120 microlitros de matriz de sótano licuado, helado y placa 40 microlitros de células en el centro de cada uno de los tres pozos de una placa de 37 grados Celsius calentada, 24 pozos, luego coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejido de 37 grados Celsius durante unos 15 minutos. Cuando la matriz del sótano se haya solidificado, agregue 600 microlitros de 37 grados Celsius medio de siembra a cada pozo antes de devolver la placa a la incubadora. Después de tres días y cada tres días a partir de entonces, reemplace el medio de siembra por 600 microlitros de medio de cultivo organoide fresco, monitoreando el crecimiento organoide regularmente con un microscopio invertido.Para pasar los cultivos extrahepáticos del conducto biliar, pipetee los organoides de cada pozo con 400 microlitros de PBS helado 10 veces por pozo antes de transferir el contenido del pozo a tubos individuales de 1,5 mililitros. Pasar cada mezcla a través de una aguja de calibre 25 cuatro veces para disociar los organoides y recoger las células por centrifugación. A continuación, resuspender las celdas en la matriz del sótano en la proporción adecuada para el re-ensaquipción.Para el almacenamiento de organoides de conductos biliares extrahepáticos a largo plazo, lave cada pozo de organoides con PBS a temperatura ambiente sin alterar las caídas de la matriz del sótano y agregue 500 microlitros de medio de congelación helada a cada pozo. Resuspender suavemente los organoides y transferir la mezcla a viales criogénicos individuales, luego colocar los viales a menos 80 grados Celsius durante 48 horas antes de transferir los organoides a un tanque de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo en una fase de vapor. Para preparar los organoides para la incrustación de parafina, sustituya el medio por 500 microlitros de cuatro grados Celsius PBS y transfiera la suspensión de cada pozo a tubos individuales de 1,5 mililitros que contengan matriz sótano licuada.Recoger los organoides por centrifugación y utilizar una punta de pipeta P1000 modificada para eliminar cuidadosamente los sobrenadantes sin perturbar los pellets. Luego agregue un mililitro de hielo frío, 4%paraformaldehído a los organoides para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, reemplace el fijador por un mililitro de PBS a temperatura ambiente para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente y lave los organoides por centrifugación tres veces.Después del último lavado, resuspendir los organoides en un mililitro de 30%etanol para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación de cinco minutos en un mililitro de 70% etanol a temperatura ambiente. Al final de la incubación del 70%etanol, recoger los organoides por centrifugación y resuspender los organoides en un mililitro de 100%etanol durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación del 100% de etanol, el gel de procesamiento de muestras de calor en un microondas durante 20 segundos o hasta que esté licuado, y agregue 50 microlitros del gel liquificado a cada tubo de organoides.Coloque los tubos sobre hielo hasta que el gel de procesamiento de la muestra se solidifie y transfiera la gota de organoides de cada tubo entre las almohadillas de esponja azules en un cassette para su posterior procesamiento en el embedder de parafina. Coloque el cassette en un procesador de tejidos programado durante 15 minutos por paso, luego se sectione los organoides incrustados en parafina en gel de procesamiento de muestras a cuatro micrómetros por sección para la tinción inmunohistoquímica y el análisis de acuerdo con los protocolos estándar. La eficiencia extrahepática del revestimiento organoide de las vías biliares es de aproximadamente el 2% cuando se aísla de ratones neonatales o adultos.Después del paso dos, la eficiencia de chapado de organoides extrahepáticos del conducto biliar derivados de ratones adultos aumenta al 11% y permanece estable. La mayoría de los organoides demuestran una morfología quística en todos los pasajes con organoides irregulares raros. Los organoides alcanzan un pico de crecimiento de cinco a siete días, después de lo cual comienzan a acumular escombros intraluminales y se deterioran.Por lo tanto, para el mantenimiento del cultivo organoide, los organoides deben dividirse cada siete a 10 días. Cuando se analizan con inmunofluorescencia, los organoides extrahepáticos del conducto biliar consisten en una población pura de células epiteliales marcadas por E-cadherina. Las células organoides también muestran marcadores de células progenitoras biliares, así como marcadores de diferenciación biliar.Es importante destacar que un alto porcentaje de células organoides poseen un cilium primario marcado por la alfa Tubulina acetilada, que es una característica de los colangiocitos normales y sugiere una polarización de células organoides apropiada. Se requiere una estrecha adherencia a la condición de temperatura descrita. La disección meticulosa de los conductos biliares evita la contaminación de las células del páncreas.La pérdida de material celular se puede evitar mediante una manipulación cuidadosa después de la centrifugación. Estos organoides se pueden utilizar como modelos preclínicos, manipulados genética y farmacológicamente, o utilizados para probar fármacos y los efectos de agentes infecciosos. Este método puede ser utilizado por laboratorios que quieren aprovechar los modelos de ratón modificados genéticamente para estudiar más a fondo los mecanismos de la biología del colangiocito.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...