Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Detta arbete stöds av American Association for den studie av levern sjukdomar Pinnacle award (till Norberg) och National Institutes of Health, nationella institutet för Diabetes och mag och njursjukdomar (awards P30 DK34933 till Norberg, P01 DK062041 till J.L.M.). Vi tackar Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) för hans hjälp med utvecklingen av denna metod.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av The University of Michigan.
1. beredning av utrustning och material för mus EHBD isolering
<ol><li>Förbereda sådd medium och tvätt buffert (Tabell för material) i 50 mL koniska rör och hålla dem vid 4 ° C eller på is fram till användning.</li>
	<li>Ställa in ett operationsbord (figur 1B). Förbereda steriliserad kirur...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Detta arbete beskriver generationen av en organotypic 3-dimensionell modell av mus EHBD cholangiocytes. Viktiga steg i EHBDO kultur generation inkluderar noggranna EHBD dissekering för att undvika bukspottkörteln cell kontaminering, underhåll av sterila förhållanden att förhindra bakterie- och svampinfektioner förorening och försiktig manipulation efter centrifugeringen att undvika den förlust av cellulära material. Det krävs en nära anslutning till beskrivs temperaturförhållanden. Det finns vissa begränsn...

Cholangiopathies är obotlig kronisk progressiv störningar som påverkar biliär celler ligger i intra- och extrahepatiska gallvägar kanaler (EHBDs)1. Vissa cholangiopathies, såsom primär skleroserande kolangit, cholangiocarcinoma, biliär atresi och choledochal cystor, påverkar huvudsakligen EHBDs. Utvecklingen av behandlingar för cholangiopathies begränsas av den begränsade tillgången på prekliniska modeller. Dessutom tidigare studier fokuserat på cholangiopathies grupperade: lever, intra- och EHBDs. Dock intra- och EHBDs har en distinkt embryonala ursprung och således anses vara distinkta molekylär patologier. Intrahepatisk gallgångarna utvecklas från intrahepatisk duktal plattorna och den kraniella delen av nedsatt divertikel, hela EHBDs utvecklas från den kaudala delen av nedsatt divertikel2. De förlitar sig också på olika progenitor cell fack för vuxna homeostas, inklusive kanalerna i Hering i intrahepatisk gallgångarna och peribiliary körtlar i EHBDs2,3. Användning av djurmodeller för prekliniska studier begränsas av bekostnad och bör minimeras av etiska skäl. Därför, reduktionistiska, reproducerbara, tids och kostnadseffektiva in vitro-modeller är mycket önskvärda.
De flesta tidigare studier av cholangiopathies utnyttjade normal mus eller råtta cancer modeller eller mänskliga cholangiocarcinoma cellinjer som härstammar från intra- och EHBDs4,5,6,7. Men dessa är modeller av celler och sammanfatta inte normala cholangiocyte biologi vid homeostas eller i felfritt tillstånd. Senaste framsteg i utvecklingen av organotypic kultur modeller har tillåtit utvecklingen av 3-dimensionella strukturer från olika vävnadstyper, inklusive hepatobiliära vävnader, även om inte normal mus EHBDs8,9, 10. Dessa ”orgel-liknande” strukturer som syftar till att härma primära vävnad och odlas i en konstgjord nisch stödja självförnyelse organ-specifika stamceller/stamceller celler11.
”Organoid” är en bred term som de flesta vanligen beskriver 3-dimensionell vävnad modeller härrör från stamceller. Organoids kan genereras från omprogrammerade pluripotenta stamceller representeras av embryonala stamceller och inducerade pluripotenta stamceller. De kan också genereras från organ-specifika stamceller12. Vissa cholangiocyte organoid modeller har föreslagits i tidigare studier. Således organoids som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller har varit rapporterade7,9,13 och ge ett värdefullt, tid effektivt verktyg som möjliggör samtidig framställning av olika celltyper. Dock återspeglar dessa pluripotenta stamceller-derived organoids inte helt strukturen och funktionaliteten i primär vuxen EHBD cholangiocytes.
Organoids härrör från stamceller av mänskliga9 och felint10 lever föreslogs också. Feline modeller är inte allmänt tillgänglig och har begränsade verktyg Arsenal i studiesyfte. Dessutom dessa lever-derived vuxna stamceller-derived organoids inte modell extrahepatiska cholangiocytes men ganska intrahepatisk cholangiocytes.
EHBD organoid generation rapporterades från människans normala EHBDs14 och mus EHBD cholangiocarcinoma15. Men tillgång till mänsklig EHBD vävnad är mycket begränsad, och organoids som härrör från en genetisk murina modell av cholangiocarcinoma15 representerar inte friska cholangiocyte biologi vid homeostas och härrör från genetiskt modifierade celler.
För att lösa begränsningarna av pluripotenta stamceller - och lever-derived cholangiocyte organoid modeller och begränsad tillgång till mänskliga vävnader behövs i prekliniska modeller, utvecklat vi en murina EHBD organoid modell (figur 1A). Detta manuskript beskriver utvecklingen av en teknik för mus EHBD-derived organoids från adult vävnad. Dessa EHBD organoids med namnet EHBDOs blir en viktig in vitro-verktyg för att studera mekanismerna bakom EHBDs cholangiocyte homeostas och sjukdom processer, såsom cholangiopathies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, som påverkar extrahepatiska gallgångarna (EHBDs), inkluderar biliär atresi, primär skleroserande kolangit och cholangiocarcinoma. De har inga effektiva behandlingsalternativ. Verktyg för att studera EHBD är mycket begränsade. Vårt syfte var att utveckla en organ-specifika, mångsidig, vuxna stamceller-derived, preklinisk cholangiocyte modell som enkelt kan genereras från vildtyp och genetiskt modifierade möss. Således rapportera vi om roman tekniken för att utveckla ett EHBD organoid (EHBDO) kultur system från vuxen mus EHBDs. Modellen är kostnadseffektiva, kunna analyseras lätt, och har flera nedströms tillämpningar. Specifikt, beskriver vi metodiken av mus EHBD isolering och enda cell dissociation, organoid kultur initiering, förökning, och långsiktigt underhåll och lagring. Detta manuskript beskriver också EHBDO bearbetning för immunohistokemi, fluorescerande Mikroskopi och mRNA överflöd kvantitering av realtid kvantitativa omvänd transkription polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR). Detta protokoll har betydande fördelar förutom att producera EHBD-specifika organoids. Användning av en betingad medium från L-VARN celler minskar kostnaden för denna modell. Användningen av musen EHBDs ger nästan obegränsad vävnad för kultur generation, till skillnad från mänsklig vävnad. Genererade mus EHBDOs innehåller en ren population av epitelceller med markörer för endodermal stamceller och differentierade biliär celler. Odlade organoids upprätthålla homogen morfologi genom flera passager och kan återställas efter en långvarig lagringstid i flytande kväve. Modellen möjliggör studiet av biliär progenitor cell spridning, kan manipuleras farmakologiskt och kan genereras från genetiskt modifierade möss. Framtida studier behövs för att optimera odlingsbetingelserna för att öka effektiviteten i bordläggningen, utvärdera funktionella cell mognad och direkta celldifferentiering. Utveckling av samarbete kultur modeller och en mer biologiskt neutrala extracellulärmatrix är också önskvärt.

Våra protokollet beskriver generationen av mus EHBD organoids som är vävnadsspecifika och vuxna stamceller-derived. Efter organoids odlas, kan en cystisk struktur formation observeras så tidigt som 1 dag efter EHBD isolering. Kontaminering med fibroblaster observeras inte vanligtvis under generering av kultur. EHBDO plätering effektivitet är cirka 2% när isolerade från neonatal eller vuxen (äldre än 2 månader) möss (figur 2B). Plätering effektivi...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Det här protokollet beskriver produktionen av en mus extrahepatiska gallvägar 3-dimensionell organoid system. Dessa biliär organoids kan upprätthållas i kulturen att studera cholangiocyte biologi. Gallan organoids express markörer både stamceller och biliär celler och består av polariserade epitelceller.

Generation av Organoids från mus extrahepatiska gallgångarna

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Detta murine extrahepatic gallgången organoid system kan ta itu med den begränsade tillgång till prekliniska kollangiopathies modeller och begränsningarna av pluripotenta stamceller och lever-härledda kolangiocyte organoid modeller. Vår modell är vuxen-vävnadsspecifik, reduktionistisk, reproducerbar, och tid och kostnadseffektiv. Det kommer att vara till särskild nytta för laboratorier som inte har tillgång till mänskliga vävnader.Vår teknik gör det möjligt för odling av ett nästan obegränsat antal extrahepatic gallgången cholangiocytes att studera vävnad regenerering och cell-till-cell interaktioner. Demonstrera förfarandet kommer att Junya Shiota, en post-doc från mitt laboratorium. För intrahepatisk gallgången isolering, placera den vuxna musen i ryggläge och öppna bukhålan längs mittlinjen.Dra tillbaka levern för att vila på membranet och använd en hemostat för att försiktigt dra det proximala tolvfingertarmen för att avslöja den gemensamma gallgången omedelbart under leverns hilum. Använd en skalpell för att separera den extrahepatiska gallgången från de omgivande vävnaderna. Hålla den proximala änden av den gemensamma gallgången med tlyckor, dissekera kanalen distalt strax ovanför dess tidpunkt med tolvfingertarmen innan dissekera proximala änden av kanalen från levern.Placera omedelbart den isolerade extrahepatiska gallgången i en glasplatta som innehåller kall tvättbuffert på is, rengör sedan gallgången från den omgivande vävnaden och färsen i 0,5-millimeters sektioner. När all vävnad har finhackats, överför sektionerna till ett rör som innehåller 500 mikroliter av dissociationsbuffert för en 20-minuters inkubation vid 37 grader Celsius. I slutet av dissociationen, neutralisera bufferten med 500 mikroliter av iskall cellkultur medium och triturate vävnaden suspensionen 20 gånger genom en 18-gauge nål och sedan 20 gånger genom en 20-gauge nål.Filtrera sedan den resulterande cellupphängningen genom en 70-mikrometercellsil till ett 50-milliliterrör. För att etablera en gallvägsorganoid kultur, samla in cellerna genom centrifugeringen och försiktigt ta bort supernatanten. Resuspend pelleten i en milliliter av iskall, steril PBS och överföra cellerna till en 1,5-milliliter rör för en andra centrifuger.Resuspend den tvättade pelleten i 120 mikroliter av liquified, iskall källare matris och platta 40 mikroliter celler i mitten av var och en av tre brunnar av en 37 grader Celsius-uppvärmd, 24-brunn tallrik, sedan placera plattan i en 37 grader Celsius vävnad kultur inkubator i ca 15 minuter. När källaren matrisen har stelnat, tillsätt 600 mikroliter av 37 grader Celsius sådd medium till varje brunn innan du returnerar plattan till inkubatorn. Efter tre dagar och var tredje dag därefter, ersätta såddmediet med 600 mikroliter av färskt organoid odlingsmedium, övervakning av organoidtillväxten regelbundet med ett inverterat mikroskop.För att passage de extrahepatic gallgången kulturer, pipettera organoiderna i varje brunn med 400 mikroliter av iskalla PBS 10 gånger per brunn innan överföring av brunnen innehållet till enskilda 1,5-milliliter rör. Passage varje blandning genom en 25-gauge nål fyra gånger för att dissociate organoiderna och samla cellerna genom centrifugeringen. Sedan återanvänder cellerna i källaren matris vid lämpligt förhållande för omplätering.För långsiktig extrahepatisk gallgången organoid lagring, tvätta varje brunn av organoider med rumstemperatur PBS utan att störa källaren matris droppar och tillsätt 500 mikroliter av iskallt frysmedium till varje brunn. Försiktigt återanvända organoider och överföra blandningen till enskilda kryogena injektionsflaska, sedan placera injektionsflaskan på minus 80 grader Celsius i 48 timmar innan de överförs organoider till en kvävetank för långsiktig lagring i en ångfas. För att förbereda organoiderna för paraffininbäddning, byt ut mediet mot 500 mikroliter av fyra grader Celsius PBS och överför suspensionen från varje brunn in i enskilda 1,5-milliliterrör som innehåller liquified basement matrix.Samla ihop organoiderna genom centrifugeringen och använd en modifierad P1000-pipettspets för att försiktigt ta bort supernatanterna utan att störa pelletsen. Tillsätt sedan en milliliter iskall, 4%paraformaldehyd till organoiderna för en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius. Nästa morgon, ersätta fixativet med en milliliter av rumstemperatur PBS för en fem minuters inkubation vid rumstemperatur och tvätta organoiderna genom centrifugeringen tre gånger.Efter den sista tvätten, resuspend organoiderna i en milliliter av 30%etanol för en fem minuters inkubation vid rumstemperatur, följt av en fem minuters inkubation i en milliliter av 70%etanol vid rumstemperatur. Vid slutet av den 70%etanol inkubation, samla in organoiderna genom centrifugeringen och resuspend organoiderna i en milliliter av 100%etanol i fem minuter vid rumstemperatur. I slutet av 100%etanol inkubation, värme provbearbetning gel i en mikrovågsugn i 20 sekunder eller tills liquified, och tillsätt 50 mikroliter av den liquified gel till varje rör av organoider.Placera rören på is tills preparatet bearbetning gel stelnat och överföra droppe av organoider från varje rör till mellan de blå svamp kuddar i en kassett för vidare bearbetning i paraffin embedder. Placera kassetten i en vävnadsbehandlare programmerad i 15 minuter per steg, dela sedan upp paraffinininbäddade organoiderna i preparatbearbetningsgel vid fyra mikrometer per sektion för immunhistokemisk färgning och analys enligt standardprotokoll. Extrahepatic galla trumman organoider plätering effektivitet är cirka 2%när isolerade från antingen neonatal eller vuxna möss.Efter passage två ökar pläteringseffektiviteten hos extrahepatiska gallgångsorganoider som härrör från vuxna möss till 11%och förblir stabil. Majoriteten av organoider visar en cystic morfologi i alla passager med sällsynta oregelbundna organoider. Organoiderna når en tillväxttopp på fem till sju dagar, varefter de börjar ackumulera intraluminal skräp och försämras.Därför, för underhåll av den organoida kulturen, bör organoiderna delas upp var sjunde till 10:e dag. När analyseras med immunofluorescens, extrahepatic galla trumman organoider består av en ren population av epitelceller som kännetecknas av E-cadherin. Organoid celler visar också markörer för gallans stamceller stamceller samt markörer för gallans differentiering.Viktigt, en hög andel av organoid celler har en primär cilium präglas av acetylerade alpha Tubulin, som är ett inslag i normala kolangiocyter och föreslår en lämplig organoid cell polarisering. Nära följsamhet till det beskrivna temperaturtillståndet krävs. Noggrann gallgångsdesekt förhindrar bukspottkörtelcellskontaminering.Förlusten av cellmaterial kan undvikas genom noggrann manipulation efter centrifugeringen. Dessa organoider kan användas som prekliniska modeller, genetiskt och farmakologiskt manipulerade, eller användas för att testa läkemedel och effekterna av smittämnen. Denna metod kan användas av laboratorier som vill dra nytta av genetiskt modifierade musmodeller för att ytterligare studera mekanismerna i kolangiocyte biologi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ kultur och Hela Mount immunofluorescensfärgning av Mus Wolffian kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestämning av gallgången densitet i mus levern

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av Multicellulära humana primära Endometrieorganoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generation av Mosaic Mammary Organoids av differentialtrypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Extra Cellular Matrix-baserade och extra cellulära Matrix-Free Generation av Murine Testikelorganoider

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generation och kultur av linguala organoider som härrör från vuxna mussmak stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generation av 3D Hela Lungorganoider från inducerade pluripotenta stamceller för modellering av lungutvecklingsbiologi och sjukdom

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...