Name: generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Bu eser çalışma karaciğer hastalıkları Pinnacle Ödülü (için N.R.) ve ulusal sağlık enstitüleri, diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim için Amerikan Derneği ve böbrek hastalıkları (P30 DK34933 N.R., P01 DK062041 J.L.M. için Ödülleri) tarafından desteklenmiştir. Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Michigan Üniversitesi) geliştirme Bu metodoloji ile onun yardım için teşekkür.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), The University of Michigan tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması fare EHBD yalıtım için malzeme ve tesisatlar
<ol><li>Tohumlama orta ve çamaşır arabellek (Tablo reçetesi) 50 mL konik tüpler hazırlamak ve kadar kullanmak 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bir cerrahi masa (şekil 1B) kurun. Steril cerrahi aletler (<strong class="xfi...

<ol>
	<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem/Progenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration.">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).</li><li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice.">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li><li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats.">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li><li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium.">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li><li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes.">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis.">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li><li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+the+Wild+West+of+Organoids,+Enteroids,+and+Mini-Guts.">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+bile+ducts.">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids.">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands.">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li><li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice.">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li><li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+formation+and+secretion.">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li><li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tree+stem/progenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts:+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages.">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable?.">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?.</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li></ol>

Bu eser fare EHBD cholangiocytes bir organotypic 3 boyutlu model nesil açıklar. EHBDO kültür üretimi önemli adımlardan dahil pankreas hücresi kirlenmesini, bakteriyel ve mantar kirlenme ve sonra Santrifüjü önlemek için dikkatli işleme önlemek için steril koşulları bakımından önlemek için çok titiz EHBD diseksiyon hücresel malzeme kaybı. Açıklanan sıcaklık koşullarında yakın bir bağlılık gereklidir. Teknik bazı sınırlamalar vardır. EHBDs yetişkin fareler küçük (yaklaşık 1 mm ça...

Cholangiopathies içi - ve extrahepatic safra kanalları (EHBDs)1bulunan safra hücrelerini etkiler tedavi edilemez kronik ilerici bozuklukları vardır. Birincil sklerozan kolanjit, cholangiocarcinoma, safra atrezi ve choledochal kistleri, gibi bazı cholangiopathies ağırlıklı olarak EHBDs etkiler. Cholangiopathies için tedavilerin geliştirilmesi Preklinik modellerin sınırlı kullanılabilirliğe tarafından sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, önceki çalışmalarda birlikte gruplandırılmış cholangiopathies üzerinde duruldu: karaciğer, içi- ve EHBDs. Ancak, içi - ve EHBDs ayrı bir embriyonik kökenli ve, böylece, farklı moleküler patolojiler düşünülmelidir. İntrahepatic duktal plakaları ve hepatik divertikülü kafatası parçası intrahepatic safra kanalları geliştirmek, hepatik divertikülü2Kaudal kısmından tüm EHBDs geliştirmek. Onlar farklı progenitör hücre bölmeleri yetişkin Homeostazı, intrahepatic safra kanalları ve peribiliary bezleri EHBDs2,3Hering Kanallar dahil olmak üzere için güvenirler. Hayvan modelleri kullanımını preklinik Etütler gider tarafından sınırlı ve etik nedenlerle indirilmelidir. Bu nedenle, indirgemeci, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet-etkin tüp bebek modelleri son derece arzu edilir.
Cholangiopathies en önceki çalışmaları normal fare ya da sıçan kanser modelleri, ya da insan cholangiocarcinoma hücre satır içi - ve EHBDs4,5,6,7elde kullanılmaktadır. Ancak, bu dönüştürülmüş hücrelerin modelleri ve normal cholangiocyte Biyoloji homeostazı veya sağlıklı bir devlet özetlemek değil. Organotypic kültür modelleri gelişiminde son ilerleme 3 boyutlu yapıları gelişimi normal fare rağmen EHBDs8,9hepatobiliary dokular, dahil olmak üzere farklı doku türlerinden izin verdi, 10. Bu "organ gibi" yapılar birincil doku taklit eden amaçlı ve öz-organ özgü kök/progenitor hücreler11yenilenmesi destekleyen yapay bir niş içinde yetişir.
"Organoid" olan bir geniş terim bu en yaygın kök hücrelerden elde edilen 3 boyutlu doku modelleri açıklar. Organoids programlanmış pluripotent kök hücreler embriyonik kök hücreleri tarafından temsil ve pluripotent kök hücreler indüklenen oluşturulabilir. Bunlar da organ özgü erişkin kök hücreler12den oluşturulabilir. Bazı cholangiocyte organoid modelleri önceki araştırma çalışmalarında önerilmiştir. Böylece, insan pluripotent kök hücrelerden türetilmiş organoids bildirilen7,9,13 olmuştur ve farklı hücre tipleri aynı anda oluşturmak için olanak sağlayan değerli, zaman verimli araç sağlar. Ancak, birincil yetişkin EHBD cholangiocytes işlevselliğini ve yapısını bu pluripotent kök hücre kaynaklı organoids tam olarak yansıtmıyor.
Organoids insan9 yetişkin kök hücrelerden türetilmiş ve kedi10 karaciğer de önerdi. Kedi modelleri yaygın olarak mevcut değildir ve aracı armamentarium çalışma amacıyla sınırlı sahip. Ayrıca, bu karaciğer kaynaklı yetişkin kök hücre kaynaklı organoids extrahepatic cholangiocytes ama çok intrahepatic cholangiocytes model değil.
EHBD organoid üretimi insan normal EHBDs14 ve fare EHBD cholangiocarcinoma15bildirildi. Ancak, insan EHBD doku erişim son derece sınırlıdır ve cholangiocarcinoma15 bir genetik fare modelinden türetilmiş organoids sağlıklı cholangiocyte Biyoloji Homeostazı, temsil etmez ve genetiği değiştirilmiş hücrelerden türetilir.
Pluripotent kök hücre ve karaciğer türetilmiş cholangiocyte organoid modelleri ve insan dokulara preklinik modellerinde gerekli sınırlı erişim sınırlamaları gidermek amacıyla geliştirdiğimiz bir fare EHBD organoid model (şekil 1A). Bu el yazması bir tekniği için fare EHBD elde edilen organoids yetişkin dokusundan gelişimi anlatılmaktadır. EHBDOs adlı bu EHBD organoids EHBDs cholangiocyte homeostazı ve hastalık gibi süreçlerini cholangiopathies altında yatan mekanizmaları incelenmesi için önemli bir tüp bebek araç olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="798">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN cell culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:104px;">1%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10437-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:104px;">50 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">125 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Amphotericin B&#160;</td>
			<td style="width:104px;">6.25 &#181;g/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15290-018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid culture medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">L-WRN Conditioned medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-3276</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:104px;">1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">100 U/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td>
			<td style="width:104px;">10 mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B27</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">N2</td>
			<td style="width:104px;">10 &#181;l/mL</td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Organoid seeding medium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organoid culture medium&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:104px;">50 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">PMG8041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td>
			<td style="width:104px;">100 ng/mL</td>
			<td style="width:170px;">PeproTech</td>
			<td style="width:118px;">100-26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:250</td>
			<td style="width:170px;">Abcam</td>
			<td style="width:118px;">ab53119</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:200</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-20095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit</td>
			<td style="width:104px;">1:2000</td>
			<td style="width:170px;">DSRB</td>
			<td style="width:118px;">F109-D12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin antibody, Goat</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:118px;">sc-31020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetylated &#945;-tubulin antibody, Mouse</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21206</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">594 labeled anti-goat, Donkey IgG</td>
			<td style="width:104px;">1:1000</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-11058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b</td>
			<td style="width:104px;">1:500</td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">A-21144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash Wnt reporter assay</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">TopFlash HEK293 cell line</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">CRL-1573</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Luciferase Assay Kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">25300054</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">15250061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Additional materials and reagents</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;"></td>
			<td style="width:118px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Basement matrix, phenol free Matrigel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">CORNING</td>
			<td style="width:118px;">356237</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Dissociation buffer, Accutase</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Gibco</td>
			<td style="width:118px;">A1110501</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell culture freezing medium, Recovery</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">12648010</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Cell strainer (70 &#181;m, steriled)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">22363548</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">15596026</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Specimen processing gel, HistoGel</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Universal mycoplasma detection kit</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">ATCC</td>
			<td style="width:118px;">30-1012K</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">05-408-129</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">24 well plate</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:118px;">CC7682-7524</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:118px;">14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse E800</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Biotium</td>
			<td style="width:118px;">30003-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Necropsy tray</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:170px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-814-61</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of organoids from mouse extrahepatic bile ducts

Cholangiopathies, extrahepatic safra kanalları (EHBDs) etkileyen, safra atrezi, Birincil sklerozan kolanjit ve cholangiocarcinoma içerir. Onlar etkili tedavi seçeneği var. EHBD eğitim araçları çok sınırlıdır. Bizim amacımız kolayca vahşi türü ve genetik fareler üretilen bir organ özgü, çok yönlü, Yetişkin kök hücre kaynaklı, preklinik cholangiocyte modeli geliştirmekti. Böylece, biz yetişkin fare EHBDs bir EHBD organoid (EHBDO) kültür sisteminden geliştirme roman tekniği rapor. Modelin maliyet-etkin, kolayca çözümlenmesi mümkün olduğunu ve birden çok akış yönündeki uygulama alanı vardır. Özellikle, fare EHBD yalıtım ve tek hücre ayrılma, organoid kültür başlatılması, yayma ve uzun vadeli bakım ve depolama yöntemi açıklanmaktadır. Bu makale ayrıca immünhistokimya, floresan mikroskopi ve mRNA bereket Nefelometri için gerçek zamanlı nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından işleme EHBDO açıklar. Bu iletişim kuralının EHBD özgü organoids üreten ek olarak önemli avantajlar vardır. L-UYR hücrelerden şartına bir orta kullanımı önemli ölçüde bu model maliyetini azaltır. Fare EHBDs kullanımı insan dokusu aksine kültür üretimi için neredeyse sınırsız doku sağlar. Oluşturulan fare EHBDOs endodermal progenitör işaretleri saf nüfusuyla epitel hücresi içeren ve safra hücreleri ayrıştırılan. Kültürlü organoids birden çok pasajlar ile homojen Morfoloji korumak ve bir uzun vadeli depolama süresi sıvı azot sonra elde edilebilir. Model safra progenitör hücre çoğalması için çalışma sağlar, farmakolojik manipüle edilebilir ve genetik fareler oluşturulabilir. Gelecekteki çalışmalar Kültür koşulları kaplama verimliliği artırmak, işlevsel hücre olgunluk ve doğrudan hücre farklılaşması değerlendirmek için en iyi duruma getirmek için ihtiyaç vardır. Ortak kültür modeller ve daha biyolojik olarak tarafsız bir hücre dışı matriks geliştirilmesi de arzu vardır.

Bizim protokolünü doku özgü ve yetişkin kök hücre kaynaklı fare EHBD organoids nesil açıklar. Sonra organoids kültürlü, Kistik yapısı oluşumu 1 gün sonra EHBD yalıtım olarak erken görülebilir. Fibroblastlar ile kirlenme genellikle kültür oluşturma sırasında gözlenen değil. EHBDO verimliliği kaplama olduğunu yaklaşık %2 ne zaman yenidoğan veya yetişkin üzerinden (2 aydan daha eski) izole fare (şekil 2B). EHBD organoids verim...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts at JoVE.com

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Bu murine ekstrahepatik safra yolu organoid sistemi preklinik kolanjiyopati modellerive pluripotent kök hücre ve karaciğer kaynaklı kolanjiyosit organoid modellerin sınırlamaları sınırlı erişim adresi olabilir. Modelimiz erişkin dokuya özgü, indirgemeci, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet etkindir. İnsan dokularına erişimi olmayan laboratuvarlar için özel bir fayda sağlayacaktır.Tekniğimiz doku rejenerasyonu ve hücre-hücre etkileşimleri çalışma ekstrahepatik safra yolu kolanjiyositneredeyse sınırsız sayıda kültürsağlar. Prosedürü gösteren Junya Shiota, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır. İntrahepatik safra yolu izolasyonu için yetişkin fareyi supine pozisyonda yerleştirin ve orta hat boyunca karın boşluğunu açın.Diyafram dinlenmek için karaciğer geri çekin ve yavaşça karaciğer hilum hemen altında ortak safra kanalı ortaya çıkarmak için proksimal duodenum çekmek için bir hemostat kullanın. Ekstrahepatik safra kanalını çevre dokulardan ayırmak için neşter kullanın. Forceps ile ortak safra kanalının proksimal ucunu tutarak, karaciğerden kanalın proksimal ucunu kesmeden önce duodenum ile kavşak hemen üzerinde distal kanal incelemek.İzole ekstrahepatik safra kanalını hemen buz üzerinde soğuk yıkama tamponu içeren bir cam plakaya yerleştirin, ardından safra kanalını çevredeki dokudan temizleyin ve 0,5 milimetrelik bölümlere doğun. Tüm doku lar doğrlandığında, bölümleri 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir kuluçka için 500 mikrolitre dissociation tamponiçeren bir tüpe aktarın. Dissociation sonunda, buz gibi hücre kültürü orta 500 mikrolitre ile tampon nötralize ve 18-gauge iğne ile doku süspansiyon 20 kez triturate ve daha sonra 20-gauge iğne ile 20 kez.Daha sonra ortaya çıkan hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Bir safra organoid kültür kurmak için, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle supernatant kaldırın. Bir mililitre buz gibi, steril PBS'deki peleti yeniden askıya alın ve ikinci bir santrifüj için hücreleri 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Yıkanmış peleti 120 mikrolitre likit, buz gibi bodrum matrisinde ve plaka 40 mikrolitre hücreyi 37 derece ısıtılmış, 24 kuyuluk üç kuyunun ortasına yerleştirin ve plakayı yaklaşık 15 dakika boyunca 37 derece santigrat doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Bodrum matrisi katılaşmış olduğunda, tabağı kuvöze geri vermeden önce her kuyuya 600 mikrolitre 37 santigrat derece lik tohumlama ortamı ekleyin. Üç gün ve bundan sonraki üç günde bir, tohumlama ortamını 600 mikrolitre taze organoid kültür ortamı ile değiştirin ve organoid büyümeyi ters bir mikroskopla düzenli olarak izleyin.Ekstrahepatik safra kanalı kültürlerini aktarmak için, pipet her kuyudaki organoidleri 400 mikrolitre buz gibi PBS ile 10 kez ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarmadan önce. Organoidleri birbirinden ayırıp hücreleri santrifüjle toplamak için her karışımı dört kez 25 kalibrelik bir iğneden geçirin. Daha sonra yeniden kaplama için uygun oranda bodrum matris hücreleri resuspend.Uzun süreli ekstrahepatik safra kanalı organoid depolama için, bodrum matris damlarahatsız etmeden oda sıcaklığında PBS ile organoidlerin her kuyu yıkama ve her kuyuya buz gibi dondurma orta 500 mikrolitre ekleyin. Organoidleri yavaşça askıya alın ve karışımı tek tek kriyojenik şişelere aktarın, ardından viritleri buhar fazında uzun süreli depolama için bir azot tankına aktarmadan önce 48 saat boyunca eksi 80 dereceye yerleştirin. Parafin gömme için organoidler hazırlamak için, dört santigrat derece PBS 500 mikrolitre ile orta değiştirin ve sıvılaştırılmış bodrum matris içeren tek tek 1.5 mililitrelik tüpler içine her kuyudan süspansiyon aktarın.Santrifüj ile organoidler toplamak ve pelet rahatsız etmeden dikkatle supernatants kaldırmak için değiştirilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın. Sonra dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için organoidlere bir mililitre buz gibi, %4 paraformaldehit ekleyin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile fiksatif değiştirin ve üç kez santrifüj ile organoidler yıkayın.Son yıkamadan sonra, organoidleri oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için %30 etanol mililitresinde yeniden askıya alın ve ardından oda sıcaklığında %70 etanolün mililitresinde beş dakikalık bir kuluçka. %70 etanol inkübatasyonunun sonunda, organoidleri santrifüj le toplayın ve organoidleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca %100 etanolün bir mililitresinde yeniden askıya alın. % 100 etanol kuluçka sonunda, ısı numunesi işleme jeli bir mikrodalga 20 saniye veya sıvılaştırılmış kadar, ve organoidlerin her tüp için sıvılaştırılmış jel 50 mikrolitre ekleyin.Numune işleme jeli katılaştırılanıncaya kadar tüpleri buzüzerine yerleştirin ve parafin katıştırma da daha fazla işleme için bir kaset mavi sünger yastıkları arasında her tüp organoidlerin damla transfer. Kaseti adım başına 15 dakika programlanmış bir doku işlemcisine yerleştirin, ardından parafinle gömülü organoidleri, standart protokollere göre immünohistokimyasal boyama ve analiz için kesit başına dört mikrometrelik numune işleme jeline bölün. Ekstrahepatik safra yolu organoid kaplama verimi yenidoğan veya erişkin farelerden izole edildiğinde yaklaşık %2'dir.İkinci geçişten sonra, erişkin farelerden elde edilen ekstrahepatik safra yolu organoidlerinin kaplama verimi %11'e yükselir ve sabit kalır. Organoidlerin çoğunluğu nadir düzensiz organoidler ile tüm pasajlar boyunca bir kistik morfoloji göstermektedir. Organoidler beş ila yedi gün içinde bir büyüme zirvesine ulaşırlar, bundan sonra intraluminal enkaz biriktirmeye başlarlar ve bozulurlar.Bu nedenle, organoid kültürün bakımı için, organoidler her yedi ila 10 günde bir bölünmelidir. İmmünofluoresans ile analiz edildiğinde, ekstrahepatik safra yolu organoidleri E-kadherin ile işaretlenmiş saf epitel hücrelerinin oluşturduğu bir popülasyondan oluşur. Organoid hücreler ayrıca biliyer ata hücrelerinin belirteçlerinin yanı sıra biliyer farklılaşma belirteçlerini de gösterirler.Daha da önemlisi, organoid hücrelerin yüksek bir yüzdesi asetiloid alfa Tubulin ile işaretlenmiş bir primer cilium sahip, hangi normal kolanjiyositbir özelliğidir ve uygun bir organoid hücre polarizasyonu öneriyor. Açıklanan sıcaklık durumuna yakın yapışma gereklidir. Titiz safra yolu diseksiyonu pankreas hücre kontaminasyonunu önler.Santrifüj sonrası dikkatli manipülasyon ile hücresel malzeme kaybı önlenebilir. Bu organoidler preklinik modeller olarak kullanılabilir, genetik ve farmakolojik olarak manipüle, ya da ilaç ve enfeksiyöz ajanların etkilerini test etmek için kullanılır. Bu yöntem, kolanjiyosit biyolojisinin mekanizmalarını daha fazla incelemek için genetiği değiştirilmiş fare modellerinden yararlanmak isteyen laboratuvarlar tarafından kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Yetişkin Fare Tadı Kök Hücrelerinden Elde Edilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...