Name: a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2019-08-08T12:30:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

<span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ونحن ممتنون جدا لغودرون ولتر ورين مايكليس على المساعدة التقنية الممتازة. ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبر جيافاليسكو على مساعدتهم. نحن ممتنون لجمعية ماكس بلانك لتمويل البحوث وFAPESP لزمالة L A Giraldi

<ol>
	<li>Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+applications+of+microalgae.">Commercial applications of microalgae.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).</li><li>Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+diversity+and+synthetic+biology+for+the+production+of+algal+biofuels.">Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels.</a> Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).</li><li>Pulz, O., Gross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valuable+products+from+biotechnology+of+microalgae.">Valuable products from biotechnology of microalgae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).</li><li>Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrophic+cultures+of+microalgae:+metabolism+and+potential+products.">Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products.</a> Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).</li><li>Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+systems+biology+in+engineering+microbes+for+biofuel+production.">Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+reconstruction+of+Chlamydomonas+offers+insight+into+light-driven+algal+metabolism.">Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism.</a> Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).</li><li>Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlgaGEM--a+genome-scale+metabolic+reconstruction+of+algae+based+on+the+Chlamydomonas+reinhardtii+genome.">AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome.</a> Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).</li><li>Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Profiling+of+a+Synchronized+Diurnal+Transcriptome+from+Chlamydomonas+reinhardtii+Reveals+Continuous+Cell+and+Metabolic+Differentiation.">High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation.</a> Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).</li><li>Willamme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+of+the+green+microalga+Chlamydomonas+reinhardtii+cultivated+under+day/night+conditions.">Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions.</a> Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).</li><li>Juppner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+lipids+and+metabolites+during+the+cell+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).</li><li>Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+fast,+comprehensive+and+reproducible+one-step+extraction+method+for+the+rapid+preparation+of+polar+and+semi-polar+metabolites,+lipids,+proteins,+starch+and+cell+wall+polymers+from+a+single+sample.">Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample.</a> Plant Methods. 12, 45 (2016).</li><li>Harris, E. H., Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook. 1, 248-249 (2009).</li><li>Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+advance:+simultaneous+analysis+of+metabolites+in+potato+tuber+by+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).</li><li>Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fractionated+Extraction+Method+for+the+Comprehensive+Analysis+of+Metabolites,+Lipids,+and+Proteins+from+a+Single+Sample.">A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Bar-Nun, S., Ohad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[34]+Chloroplast+membrane+polypeptides.">[34] Chloroplast membrane polypeptides.</a> Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+by+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionisation-time+of+flight+mass+spectrometry.">Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry.</a> Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+quality+control+tools+for+mass+spectrometry+proteomics.">Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics.</a> Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).</li><li>Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REVIGO+summarizes+and+visualizes+long+lists+of+gene+ontology+terms.">REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms.</a> PloS one. 6 (7), e21800 (2011).</li><li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance.">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li><li>Caldana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+analysis+of+inducible+target+of+rapamycin+mutants+reveal+a+general+metabolic+switch+controlling+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).</li><li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+Arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation.">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li><li>Hummel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatography+and+high+resolution+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+plant+lipids.">Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids.</a> Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+(13)+C,+(15)+N+and+(34)+S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+dissection+of+spatiotemporal+metabolic+shifts+in+primary,+secondary,+and+lipid+metabolism+during+developmental+senescence+in+Arabidopsis.">Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).</li><li>Lambers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteaceae+from+severely+phosphorus-impoverished+soils+extensively+replace+phospholipids+with+galactolipids+and+sulfolipids+during+leaf+development+to+achieve+a+high+photosynthetic+phosphorus-use-efficiency.">Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency.</a> New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).</li><li>Degenkolbe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+remodeling+of+the+lipidome+during+cold+acclimation+in+natural+accessions+of+Arabidopsis+thaliana.">Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).</li><li>Bromke, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+high-resolution+mass+spectrometry+for+fatty+acid+profiling.">Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling.</a> The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAX1,+a+novel+membrane+protein+mediating+plastid+fatty+acid+export.">FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.</a> PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).</li><li>Hemme, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+analysis+of+acclimation+responses+to+long-term+heat+stress+and+recovery+in+the+photosynthetic+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).</li><li>Sharma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS+analysis+of+Chlamydomonas+reinhardtii+and+Scenedesmus+obliquus+lipid+extracts+and+their+possible+metabolic+roles.">UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles.</a> Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).</li><li>Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human,+chimpanzee,+macaque,+and+mouse+tissues.">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li><li>Khrameeva, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neanderthal+ancestry+drives+evolution+of+lipid+catabolism+in+contemporary+Europeans.">Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans.</a> Nature Communications. 5, 3584 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness.">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).</li><li>Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationales+and+approaches+for+studying+metabolism+in+eukaryotic+microalgae.">Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae.</a> Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).</li><li>Allwood, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+reproducibility+of+fast+gas+chromatography-electron+impact-time+of+flight+mass+spectrometry+(GC-EI-TOF/MS)+based+plant+metabolomics.">Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics.</a> Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.

في هذه المقالة، قمنا بتوضيح بروتوكول استخراج قوي وقابل للتطبيق للغاية للدهون الشاملة، والبيانات ية، وتحليل النشا والبروتيوميات من بيليه واحد من 10-15 × 106 خلايا. وقد تم تنفيذ هذه الطريقة بنجاح في العديد من الدراسات لمجموعة واسعة من الخلايا والأنسجة10،14،21،22،23،24،25 ،26،27،28،29،30،31،32،33،34 ،35،36. هنا، قدمنا خط أنابيب خطوة لتحليل متعددة omics من الجزيئات الحيوية المختلفة من عينة واحدة تم حصادها من Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt+) الثقافة.
ويوفر البروتوكول نهجا قويا واستنساخا لمعالجة عينات متعددة في آن واحد، لتحليل مختلف الجزيئات الحيوية. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ عدد من الخطوات الحاسمة من أجل التقليل إلى أدنى حد من التباين التقني. أولا، ينبغي أن يتم حصاد الخلايا في أسرع وقت ممكن مع الحفاظ على الظروف الموحدة لجميع العينات التي تم حصادها للحفاظ على الحالة البيولوجية للخلايا. على الرغم من أننا استخدمنا الطرد المركزي لحصاد الخلايا، يمكن استخدام استراتيجيات الحصاد البديلة لحصاد العينات. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن استراتيجيات الحصاد المختلفة من المعروف أن تؤثر على الحالة الأيضية للخلايا37 وبالتالي، يجب استخدام نهج الحصاد متسقة لجميع العينات التجريبية. ثانيا، من المهم تجنب تجفيف المرحلة العليا غير القطبية التي تحتوي على الكلوروفيل، لأن هذا يمكن أن يؤثر على مستويات الكلوروفيل المذاب في المذيب الذي يؤثر على عامل التطبيع للعينات. وأخيرا، ينبغي توخي الحذر أثناء إزالة المرحلة القطبية المتبقية للحصول على البروتين والنشا بيليه، لتجنب إزعاج بيليه التي يمكن أن تؤثر على محتوى النشا والبروتين.
وبالتالي يقدم بروتوكول الاستخراج المقدم عدة فوائد لتحليل البيانات متعددة omics. وإلى جانب تقليل عدد العوامل العلية المطلوبة، فإنه يقلل أيضا من التباين بين النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها لمختلف الجزيئات الحيوية. وهذا يسمح بإجراء مقارنة مباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها من الأيض الأولي والدهون والبيانات البروتيومية. وبالمثل، فإن الاستخراج المتزامن لفئات مركبة متعددة يسمح باستراتيجية تطبيع متسقة وموحدة لمجموعات البيانات المختلفة. وهذا ينطبق بشكل خاص إذا كان من الصعب تحقيق التطبيع باستخدام الوزن الجاف أو الطازج38 أو رقم الخلية.
ويمكن تنفيذ البروتوكول من أجل الفحص الروتيني لعينة بيولوجية معقدة. هذه المجموعات البيانات الميتابولوميك الكلي, الدهون وبروتيومميك يمكن أن توفر معلومات شاملة حول التغيرات المنهجية في عملية التمثيل الغذائي. بالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل البروتيوميات، توفر رؤى في التغيرات الكمية (الوفرة) والنوعية (التعديلات) في البروتينات فيما يتعلق بالأيض. ومن ثم، فإن دمج البيانات الأوميسية يمكن أن يكشف عن معلومات متعمقة عن التغيرات الناجمة عن الاضطرابات الوراثية أو الأحيائية و/أو اللاأحيائية للنظام البيولوجي. وهكذا، توضيح التغيرات الجزيئية لمسارات التمثيل الغذائي محددة أو العمليات الخلوية. وبالمثل، فإن هذه البيانات عالية الإنتاجية يمكن أن تسمح بتحديد الأهداف للهندسة الأيضية وصقل أو اختبار التنبؤات من نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم37،39.

الطحالب الدقيقة هي مصدر غني للمنتجات الطبيعية (مثل الوقود والتغذية البشرية والحيوانية ومستحضرات التجميل والمواد الدوائية). يتم تنفيذ العديد من الجهود البحثية لتعزيز كفاءة إنتاجالمنتجات ذات القيمة العالية من الطحالب الدقيقة 1،2،3،4. فهم على مستوى النظم لعملية التمثيل الغذائي هو شرط مسبق لتحسيننوعية وغلة المنتجات الطبيعية 5،6،7. مع ظهور تقنيات الجينوم الوظيفية وتحسين أساليب قياس الطيف الكتلي، يمكن رصد الآلاف من الجينات والنصوص والبروتينات والأيض في وقت واحد. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات متعددة لدراسات البروتيوميات المتعمقة، والدهون والبيانات، والتي غالبا ً ما يكون من الصعب تحقيقها في الكائنات أحادية الخلية، خاصة إذا كان من المقرر إجراء دراسات دورة زمنية. وعلاوة على ذلك، فإن جمع ومعالجة أنواع مختلفة من الأليكوتات المختلفة بالاقتران مع بروتوكولات مختلفة لجمع بيانات الأوميكس المعقدة للغاية (أي البروتيوميك، والدهون، والبيانات) يدخل في تباين، مما يجعل تكامل البيانات مهمة صعبة.
الكلاميدومونات يوفر ليس فقط نظام الميكروبية ممتازة للتحقيق في العمليات الخلوية، ولكن أيضا نموذجا مناسبا لدراسة تنسيق دورة الخلية والتمثيل الغذائي. وبناء على ذلك، تم عرض تنسيق قوي للتعبير النصوص مع دورة الخلية باستخدام التنميط النسخ عالية الدقة من الثقافة المتزامنة من Chlamydomonas8. حوالي 80٪ من النصوص التي تم تحليلها أظهرت دورية قوية على مدى دورة خلية 24 ساعة8. وبالمثل ، تبين أن الوزن الجاف ، والبروتينات ، والكلوروفيل ، والأحماض الأمينية والأحماض الدهنية من سلالات مختلفة من الكلاميدوماسونا ترتبط مع انقسام الخلايا في دراسة حيث تم إجراء أخذ العينات كل 4 ح9. في الآونة الأخيرة، أفيد أن ديناميات المستقلب والدهون من تحول الخلية على أساس مراحل محددة من دورة الخلية10. كانت التغيرات الدقيقة في الجزيئات الحيوية المختلفة ممكنة للرصد باستخدام ميثيل ثالثبوتيل الأثير القوي (MTBE): الميثانول: طريقة الاستخراج القائمة على المياه، والتي توفر نقطة انطلاق مثالية لتحليل شامل متعدد الأوميكس10 , 11.
أدلة البروتوكول المقدمة من خلال استراتيجية قابلة للاستنساخ وفعالة10، لاستخراج في وقت واحد من الدهون ، والأيض ، والبروتينات والنشا من aliquot عينة واحدة ، للمرة حل دراسة الميتابوليوموميك والدهون من متزامن الثقافات الكلاميدوموناس المتنامية. بالإضافة إلى توضيح البيانات الأيضية والدهنية القوية والقابلة للاستنساخ10، هنا ، يتم أيضا ً إثبات جودة العينات البروتيومية التي تم الحصول عليها من نفس بيليه.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td>Internal standard for metabolites, ISOTEC&#174; Stable Isotopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27840-500MG</td>
			<td>Internal standard for metabolites, HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5072</td>
			<td>Enzymatic digestion of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for sample extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenter system</td>
			<td>Glasbl&#228;serei M&#252;ller, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>custom made fermenter of 800ml capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 &#956;m and a particle size of 1.7 &#956;m</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186007477</td>
			<td>Analysis of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td>standard preset sonication power at 45kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td>particle (cells) volume and number analyser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii

وكانت الطحالب الدقيقة محور البحوث لتطبيقاتها في إنتاج المركبات عالية القيمة والغذاء والوقود. وعلاوة على ذلك، فهي نماذج قيمة للتركيب الضوئي تسهل فهم العمليات الخلوية الأساسية. تتيح الدراسات على نطاق المنظومة فهمًا شاملًا ومتعمقًا للوظائف الجزيئية للكائنات الحية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات وبروتوكولات مستقلة متعددة لدراسات البروتيوميات والدهون والميتابولات التي تحدث خطأ أعلى وتباين. يتم عرض طريقة قوية عالية استخراج الإنتاجية لاستخراج الكلوروفيل في وقت واحد، والدهون، والأيض، والبروتينات والنشا من عينة واحدة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii هنا. الإعداد التجريبي المصور هو لثقافات Chlamydomonas متزامنة باستخدام 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / الظروف المظلمة. تم جمع العينات على مدى دورة خلية 24 ساعة لإثبات أن الأيض والدهون وبيانات النشا التي تم الحصول عليها باستخدام منصات تحليلية مختلفة مطابقة بشكل جيد. وعلاوة على ذلك، استُخدمت عينات البروتين التي جُمعت باستخدام بروتوكول الاستخراج نفسه لإجراء تحليل مفصل للبروتيوميات لتقييم نوعيتها وقابليتها للاستنساخ. واستناداً إلى البيانات، يمكن استنتاج أن الطريقة المصورة توفر نهجاً قوياً واستنساخاً لتعزيز فهم مختلف المسارات البيوكيميائية ووظائفها بثقة أكبر في البحوث الأساسية والتطبيقية على حد سواء.

Chlamydomonas reinhardtii CC-1690 مزامنة الثقافة ولتوضيح النتائج التمثيلية للبروتوكول المعطى، نقدم نموذج البيانات المتعددة الأوميس التي تم الحصول عليها بعد حصاد واستخراج عينات من ثقافات الكلاميدودوماس رينهارتي المتزامنة10. الثقافات المتزامنة من Chlamydomonas تتألف من الخلايا التي تنتمي إلى مرحلة النمو موحدة في نقطة زمنية محددة. تمت مزامنة ثقافات الكلاميدومونات عند 12 ساعة/12 ساعة ضوء/دورة مظلمة، 34 درجة مئوية مع شدة الضوء من 200 μmol·m-2·s-1 وتركيز ثاني أكسيد الكربون من2٪، v/v، الموصوفة على أنها تركيز أمثل للإجهاد CC-1690 mt+10 . وقد تم تحسين هذه الشروط سابقا والتحقق من صحتها باستخدام مختلف المعلمات دورة الخلية10. يعرض الشكل 1 توزيع حجم الخلية المقاس مع عداد Coulter في نقاط زمنية متميزة للثقافات المتزامنة. ويمكن ملاحظة تحول في حجم الخلية كما تنمو الخلايا في الحجم طوال مرحلة الضوء، تليها الإفراج عن خلايا ابنة بدءا من نهاية مرحلة الضوء من 10 ح. مرة واحدة يتم تحرير جميع الخلايا ابنة، يمكن ملاحظة التحول في حجم الخلية كما يتم التخلص من خلايا ابنة صدر حديثا لبدء الدورة التالية 10 (الشكل 1).
جمع العينات، والمناولة واستخراج ويتم الحصاد السريع للعينات باستخدام الطرد المركزي وبعد التخلص من supernatant، يمكن تخزين الكريات في -80 درجة مئوية حتى استخراج. وكما هو موضح أعلاه (الخطوة 5)، فإن استخراج MTBE يؤدي إلى ثلاث مراحل متميزة: (أ) استخدمت المرحلة العضوية لقياس الدهون وكذلك مستويات الكلوروفيل (عامل التطبيع)، ب) تم جمع المرحلة القطبية لقياس الأيض على نظام إدارة النُسَّم العالمي في حين أن ج) تم استخدام الكريات لقياس محتوى النشا والبروتينات. ويبين الشكل 2لمحة عامة عن توزيع مختلف المراحل وتوظيفهم.
الأيض القطبي وغير القطبي استناداً إلى تحليل GCMS للكسر القطبي، تم شرح 65 أيضًا، تغطي الأحماض الأمينية، والأحماض النووية، ووسيطات تحلل الجلوكوز، وتكوين الجلوكوز، ودورة حمض تريكاربوكسيليك، ومسار فوسفات البنتوز، والبوليامين (الشكل3A). أدى تحليل LCMS للمرحلة المحايدة التي تحتوي على الدهون إلى تحديد 204 أنواع الدهون المتميزة التي تغطي مختلف فئات الدهون وهي فوسفاتيديلغليسيرول، فوسفاتيديلإيثانولامين، سولفوكينوسيل دياسيلكلينرول، مونوغالاكتوسيلدياسيلغليسيكلوريس، ديغالكتوسيلدياسيلغليسيكلين، دياسيلغليسيريلتريلميثيلهوموسيرين، الأحماض الدهنية، دياسيلغليسيريدس وترياسيلغليسيريدس. لتصور التحولات العالمية في الأيض والدهون عبر دورة الخلية، تم استخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA). يعرض PCA فصل المراحل الخفيفة والظلام لكل من البيانات الميتابولوميك والدهون. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة شبه دوري (دائرة مفتوحة جزئيا) لكلا البيانات (الشكل3C،D). وتعزى الفجوة الجزئية في النمط الدائري إلى حقيقة أن العينات في 24 ساعة من دورة الخلية تم جمعها تحت الظلام على النقيض من العينات التي تم جمعها في بداية دورة الخلية بعد 0.25 ساعة من التعرض للضوء (الشكل3C ،D).
تحليل البروتين والنشا لدراسة نوعية بيليه البروتين التي تم الحصول عليها نتيجة لاستخراج MTBE، تم استخدام 6 عينات لتحليل البروتيومية. تم فحص جودة البيانات البروتيوميات التي تم الحصول عليها عن طريق هضم 50 ميكروغرام بروتين / عينة، باستخدام أداة مراقبة الجودة الحسابية -البروتيوميات مراقبة الجودة (PTXQC)19،مما يشير إلى استنساخ عالية وجودة البيانات البروتيوميات التي تم الحصول عليها من جميع النسخ المتماثلة (الشكلالتكميلي1). تم فحص التغطية الوظيفية الجزيئية للبروتينات باستخدام REVIGO20. ويرد في الشكل 4 ألفعرض عام للإثراء الوظيفي للبروتينات المحددة لعام 2463 (انظر الجدول 2). تم استخدام بيليه المتبقية بعد استخراج البروتين لاستنساخ كمية النشا كما هو مبين من خلال انخفاض الانحراف المعياري بين مختلف تكرار (الشكل4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig1.jpg"> الشكل 1: مثال توضيحي للتغيرات في حجم الخلية عبر مراحل مختلفة من دورة الخلية في Chlamydomonas reinhardtii. المحور س الذي يمثل وحدة تخزين الخلية بينما يمثل المحور ص رقم الخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig2.jpg"> الشكل 2: سير العمل المصور لتوظيف مراحل مختلفة أثناء الكريات خلية استخراج متعددة omics. وقد أعيد استخدام هذا الرقم من جوبنر، ج.وآخرون. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig3.jpg"> الشكل 3: مثال تمثيلي للأيض والدهون المحددة باستخدام البروتوكول الموصوف. (أ) فئات المستقلب التي حددها تحليل GCMS. (ب) أنواع الدهون التي تنتمي إلى فئات مختلفة محددة من قبل تحليل LCMS. (C) تحليل مكون المبدأ من مستويات المستقلب عبر دورة الخلية 24 ح. (D) تحليل مكون المبدأ من الدهون عبر دورة الخلية 24 ساعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig4.jpg"> الشكل 4: مثال تمثيلي لبيانات البروتين والنشا. أ) الإثراء الوظيفي الجزيئي للبروتينات المحددة باستخدام تحليل LCMS، خريطة الشجرة المرسومة باستخدام REVIGO 20 B) بيانات النشا التمثيلية التي تعرض إمكانية استنساخ البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: تصميم مخصص لنظام المخمرة لدرجة الحرارة والطباعة التي تسيطر عليها النمو المتزامن للثقافات Chlamydomonas. وقد أعيد استخدام هذا الرقم من جوبنر، ج.وآخرون. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S1.eps">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي 2: النتيجة التمثيلية لنوعية بيانات البروتيوميات. خريطة الحرارة المرسومة باستخدام أداة حسابية PTXQC19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S2.eps">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الوقت (دقيقة)</td>
			<td>النسبة المئوية للمخزن المؤقت B إلى المخزن المؤقت A</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>من 0 إلى 15 دقيقة</td>
			<td>تدرج خطي من 0 إلى 3%</td>
			<td>العازلة A: 0.1٪ حمض الفورميك في المياه الصف UPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 إلى 75 دقيقة</td>
			<td>تدرج خطي من 3% إلى 30%</td>
			<td>العازلة B: 0.1٪ حمض الفورميك في 60٪ UPLC الصف acetonitrile</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 إلى 90 دقيقة</td>
			<td>تدرج خطي من 30% إلى 40%</td>
			<td>معدل التدفق 300 nL / دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>90 إلى 94 دقيقة</td>
			<td>تدرج خطي من 40% إلى 90%</td>
			<td>حقن حجم 4 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 إلى 104 دقيقة</td>
			<td>غسل العمود مع 90٪</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>105 إلى 120 دقيقة</td>
			<td>معادلة العمود لمدة 15 دقيقة في 3٪</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: الكروماتوغرافيا السائلة لعينات الببتيد، بارامترات التدرج.
الجدول 2: قائمة بالبروتينات التي تم تحديدها بعد تحليل نظام إدارة النُمس/نظام إدارة النُسْمع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/Table_2.xlsx">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

طريقة استخراج متعددة Omics للتحليل المتعمق للثقافات المتزامنة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii

تحليل الجزيئات الحيوية المتعددة على نطاق المنظومة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى وظيفية وميكانيكية في العمليات البيولوجية. بموجب هذا، يتم وصف بروتوكول واسع النطاق لاستخراج الإنتاجية العالية من الدهون والأيض والبروتينات والنشا من عينة واحدة تم حصادها من ثقافة الكلاميدوموناس المتزامنة.

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

والدراسات التي تجري على نطاق المنظومة حاسمة في فهم الوظائف البيولوجية فهما عميقا. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات مستقلة متعددة لمنصات omics مختلفة، وإدخال كمية عالية من التباين في البيانات. هذه الطريقة تقدم استراتيجية قوية وعالية الإنتاجية لاستخراج في وقت واحد من الكلورو, الدهون, المستقلبات, البروتينات, والنشا من عينة واحدة من النغا الخضراء نموذج, chlamydomonas reinhardtii.بالنسبة لاستخراج الكلوروفير، والدهون، والاستقلاب، قم بترتيب أنابيب كريات خلايا Chlamydomonas المحصودة في النيتروجين السائل. Resuspend بيليه في كل أنبوب مع ملليلتر واحد من 20 درجة استخراج العازلة واحد. لتجنب تبخر العازلة استخراج اللزوجة منخفضة، دوامة بسرعة الأنابيب حتى يتم تجانس الخلايا بشكل جيد داخل خليط استخراج و aliquot الحل في اثنين من أنابيب microcentuge ملليلتر.سونيكات الثقافات في حمام سونيكيشن في الماء البارد الجليد لمدة 10 دقائق قبل الحضانة على شاكر المدارية في 1، 000 التناوب في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة 650 ميكرولترات من استخراج العازلة اثنين ودوامة لفترة وجيزة العينات قبل الطرد المركزي. إلى aliquot الكسور، نقل 500 ميكرولترات من مرحلة الدهون MTBE العليا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر المسمى.استخدام ماصة 200 ميكرولتر لإزالة مرحلة الدهون ونقل 650 ميكرولتردات من المرحلة المنخفضة القطبية وشبه القطبية المستقلب في أنابيب جديدة تحمل علامة. استلهم حجم الفائض لإزالة المرحلة الأقل المتبقية وتجميد الكريات الصلبة في النيتروجين السائل للتخزين 80 درجة. لتحديد المستقلب القطبي، resuspend بيليه المجففة من المرحلة القطبية في محلول هيدروكلوريد ميثوكسيمين البيريدين للميثوكسيمين من المجموعات الكربونية وتسخين العينات في 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.في نهاية الحضانة، اشتقاق العينات مع n-ميثيل-n-trifluoracetamide لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية وفقا للبروتوكولات القياسية. استخدام الكروماتوغرافيا الغاز إلى جانب وقت الطيران الطيفية الكتلة لتحليل الأيض الأولية. لتحديد المستقلب غير القطبية، resuspend بيليه المجففة من المرحلة غير القطبية في خليط من سبعة إلى ثلاثة حجم لحجم الأسيتونيتريل إلى isopropanol والرواسب الكريات عن طريق الطرد المركزي.ثم فصل العينات على عمود C8 المرحلة العكسية على نظام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء. لتحديد محتوى الكلوروفيرل، مزيج 100 ميكرولترات من المرحلة MTBE مع 900 ميكرولترات من 90٪ الميثانول لطريقة فارغة فضلا عن العينات التجريبية. ثم قياس الامتصاص على مقياس الطيفي في 655 و 652 نانومتر أطوال موجية للتمييز بين الكلوروفيرل ب والكلوروفير وحساب محتوى الكلوروفيرل أ وب ومحتوى الكلوروفير الكلي.لاستخراج البروتين، حل بيليه المرحلة السفلى في 200 ميكرولترات من العازلة البروتين واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينة ونقل السوبر المحتوية على البروتين إلى أنبوب جديد. قياس تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد.وهضم البروتين، قلل 15 ميكروغراماً من العينة في خمسة ديوثيوثيريتول ميليمولار لمدة 30 دقيقة، تليها الألكيل مع 10 ملليمولاري iodoacetamide لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الألكيل، مزيج تريبسين / ليس-C حل في نسبة البروتين 25 إلى واحد إلى البروتياز واحتضان العينة لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. تمييع العينة ستة أضعاف في 50 ملليمولار تريس Hcl لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.في صباح اليوم التالي ، إنهاء الهضم مع حمض ثلاثي الفلوراستيك إلى تركيز نهائي من 0.5 إلى 1 ٪ بعد الهضم ، والتركيز على العينات إلى قرب الجفاف ، وترك اثنين إلى خمسة ميكرولترات من الحل في فراغ المكثف دون تدفئة. إعادة تعليق العينة في مخزن التحميل المؤقت. تحليل خليط الببتيد بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتل باستخدام مقياس الطيف كتلة عالية الدقة متصلة نظام الكروماتوغرافيا السائلة ضغط متناهية الصغر نانو.لفصل الببتيدات، تحميل أربعة ميكرولترات من العينة على 20 سم عكس المرحلة المشحونة عمود هجين سطح مع قطر داخلي من 75 ميكرومتر وحجم جسيم من 1.7 ميكرومتر. استخدام إعدادات غير متصلة حلقة جزئية مع التدرج متساوي المستويات تعيين في 3٪ من المخزن المؤقت B، عقد لمدة 14 دقيقة قبل أن يتم إزاحة الحلقة إلى موضع عبر الإنترنت مع العمود، وبعد ذلك سيتم زيادة التدرج خطياً لمدة 50 دقيقة حتى يتم الوصول إلى 20٪ المخزن المؤقت B. ويمكن ملاحظة تحول في حجم الخلية حيث تنمو الخلايا في حجمها طوال مرحلة الضوء ، يليها إطلاق الخلايا الابنة بدءًا من نهاية مرحلة الضوء من 10 ساعات.بمجرد أن يتم تحرير جميع الخلايا ابنة، يمكن ملاحظة تحول في حجم الخلية، كما يتم التخلص من الخلايا ابنة صدر حديثا لبدء الدورة القادمة. استناداً إلى تحليل قياس الطيف الكتلي الكتلي للكسر القطبي، في هذه التجربة التمثيلية، تم إضافة 65 من نواتج الأيض. أدى تحليل قياس الطيف الكتلي الكتلي اللوني السائل للمرحلة المحايدة المحتوية على الدهون إلى تحديد 204 نوع من الدهون المتميزة تغطي مختلف فئات الدهون.يمكن استخدام التحليل الرئيسي للمكونات لتصور التحولات العالمية في الأيض والدهون عبر دورة الخلية مع فصل مراحل الضوء والظلام وكذلك المراحل شبه الدورية التي لوحظت لكل من بيانات المستقلبومومية والدهون. هنا، يتم عرض لمحة عامة عن الإثراء الوظيفي لل 2،463 البروتينات المخصبة التي تم تحديدها. ويمكن استخدام الكريه المتبقية بعد استخراج البروتين في القياس الكمي المستنسخ للنشا ، كما هو مبين في الانحراف المعياري المنخفض بين مختلف التكرارات.من المهم تجنب تجفيف المرحلة العضوية العليا من الكلورو فيل، لأن هذا يمكن أن يؤثر على مستويات الكلورو في المذيبات، مما يؤثر على عامل التطبيع للعينات. يمكن تنفيذ إجراءات تحليلية مختلفة للتوصيف الكيميائي الحيوي للأنواع الجزيئية المستخرجة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

تطبيق للDNA محددة وصمة عار الميثيل الأخضر في بطاقات المواد الفلورية الأجنة

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

منهج في النسب الانسحاب من الخلايا القرنية عن طريق متعدد الألوان مراسل الفلورسنت الفئران

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

كوانتينغينغ المتفرعة الكثافة في الجرذ الغدة الثديية كله يتصاعد باستخدام طريقة تحليل شول

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...