Name: a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2019-08-08T12:30:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

<span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Vi er meget taknemmelige for Gudrun Wolter og Änne Michaelis for fremragende teknisk assistance. Vi vil gerne takke alle medlemmerne af Giavalisco Lab for deres hjælp. Vi er taknemmelige for Max Planck Society for finansiering af forskning og FAPESP for Fællesskabet af L A Giraldi

1. præ-kulturer af chlamydomonas Calabaria
<ol><li>Forbered præ-kulturerne af chlamydomonas Calabaria (stamme vildtype CC-1690 MT +) ved at overføre celler fra faste plader af TAP medium til Erlenmeyer kolber med 200 ml HSM medium12.</li>
	<li>Udvid præ-kulturerne på en rotatory shaker ved 24 °C ved 100 μmol · m-2· s-1 kontinuerligt lys, indtil celletætheden når ~ 2 x 106 celler/ml.</li>
</ol>2. synkronisering af Chlamydomonas flydende kulturer i fermentorer
Bemærk: de parametre, der præsenteres i denne protokol, såsom temperatur, lys og CO2, er specifikke for synkronisering af stammen CC-1690 MT +. For at udvikle en synkroniseret kultur ved hjælp af en anden stamme, er det nødvendigt at teste de optimale betingelser.
<ol><li>Før kulturen overføres til et Fermenter-system (Se supplerende figur 1 for det specialfremstillede Fermenter-design), der er forbundet med en recirkulerende køler for at opretholde temperaturen, med boblende filtrerede Co2 (2%, v/v) og omrørt med en magnetisk Stir i bunden af fermenteringen med konstant agitation.</li>
	<li>For at initiere synkroniseringen skal du indstille fermenteringen ved lys-mørk regime på 12:12 h, under 34 °C og 200 μmoles · m-2· s-1 lys og sikre, at det indeholder 500 ml kultur i HSM medium med en celletæthed på 1 x 106 celler/ml.</li>
	<li>Ved udgangen af 24 h cyklus, re-fortynde kulturen til 1 x 106 celler/ml med frisk HSM medium med minimal forstyrrelse ved hjælp af et rørsystem i kombination med peristaltiske pumper, som gør det muligt at først pumpe en særskilt mængde af kultur ud og bagefter pumpe i autoklave-steriliseret medium. Bemærk: som alternativ til peristaltiske pumper kan inokulerende sprøjter bruges til at trække kulturen tilbage, mens den påkrævede mængde frisk medium kan tilsættes direkte til fermenteringen under sterile forhold.</li>
	<li>Gentag trin 2,3 tre gange for at få de synkroniserede kulturerpå 4- dages inokulation.</li>
	<li>For at validere Synchrony af celler, høst prøver med et interval på hver 2 h og målecelle tæthed og celle volumen ved hjælp af en celle tæller og størrelse analysator (Se tabel over materialer). Afhængigt af celletætheden fortyndes prøverne mellem 1:10 og 1:100 og måles i et størrelsesområde på 30 – 1900 μm3.</li>
</ol>3. høst af Chlamydomonas-celler
<ol><li>Mærk 15 mL koniske centrifugeglas, og Forbered en Dewar fyldt med flydende nitrogen.</li>
	<li>Høst prøverne ved hjælp af en sprøjte (50 cm3) gennem den indvendige glas slange af fermenteringen. Prøven fordeles til koniske centrifugeglas, som skal indeholde 10-15 x 106 celler. Bemærk mængden overført til hvert rør og målecelle tætheden og cellestørrelsen af hvert tidspunkt ved hjælp af celle tæller og størrelse analysator (Se tabel over materialer)</li>
	<li>Pellet cellerne ved centrifugering i 5 min ved 4000 x g. Derefter kassere supernatanten, fryse pellets i flydende nitrogen og senere opbevares ved-80 °C.</li>
</ol>4. klargøring af ekstraktions buffere og ekstraktion af klorofyl, lipiderne og metabolitter
Forsigtig: methanol (MeOH) og MTBE er brændbare og kan forårsage irritation af luftvejene, øjet eller huden ved længerevarende eksponering og/eller kontakt. Håndtér dem forsigtigt i en Røghætte, og brug de relevante sikkerhedsprocedurer under ekstraktionen (laboratorie frakke, sikkerhedsbriller, handsker osv.).
<ol><li>
Ekstraktions buffer 1
	<ol>
<li>I en 100 mL målekolbe tilsættes 75 mL MTBE, 25 mL MeOH (UHPLC-kvalitet) og homogeniseres (3:1, Vol/Vol).</li>
		<li>Tilføj følgende løsning til interne standarder: 50 μL kortikosteron (1 mg/mL i MeOH), 50 μL 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-fosfocholin (17:0 PC) (1 mg/mL i chloroform HPLC-kvalitet), 25 μL ampicillin (1 mg/mL i vand-UHPLC-kvalitet) og 50 μL D-sorbitol-1-13C (1 mg/mL i vand UHPLC-kvalitet).</li>
		<li>Overføre ekstraktions bufferen til en ren glas flaske og forkøle opløsningen ved-20 °C, 1 time før brug. Brug frisklavet opløsning til ekstraktioner. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ekstraktions buffer 2
	<ol>
<li>I en 100 mL målekolbe tilsættes 75 mL vand-UHPLC-kvalitet og 25 mL MeOH UHPLC-kvalitet og homogeniseres.</li>
		<li>Overføre ekstraktions bufferen til en ren glas flaske. Brug frisk opløsning til ekstraktioner. Denne løsning kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ekstraktion af klorofyl, lipiderne og metabolitter
<ol><li>Arranger rørene, med celle pellet (indeholdende 10-15 x 106 celler), i flydende nitrogen.</li>
	<li>Celle pellet opslæmmes i hvert rør med 1 mL forkølet (-20 °C) ekstraktions buffer 1. Bemærk: Udfør dette trin hurtigt for at undgå fordampning af lavviskositets ekstraktions buffer. Efter tilsætning af ekstraktions buffer 1, vedligeholde rørene ved stuetemperatur.</li>
	<li>Vortex, indtil cellerne er godt homogeniseret inden for ekstraktions blandingen og alikvot blandingen i 2 mL mikrocentrifuge glas.</li>
	<li>Sonicate kulturer ved hjælp af sonikering bad (Se tabel over materialer) i iskold vand i 10 min.</li>
	<li>Alle prøverne på en orbital shaker inkubates ved 1000 rpm i 60 min ved 4 °C.</li>
	<li>For at inducere faseseparationen tilsættes 650 μL ekstraktions buffer 2.</li>
	<li>Vortex kort efterfulgt af centrifugering ved 20000 x g i 5 min ved 4 °c. Bemærk: efter dette trin er der en adskillelse af væskefaser og en solid pellet i bunden af røret. Håndtér rørene med omhu for at undgå blanding af de to væskefaser. Den øverste MTBE-fase indeholder lipider og klorofyl, mens den nedre fase indeholder de polære og semi-polære metabolitter. Den udfældede pellet i bunden indeholder proteiner, stivelse og andre uopløselige molekyler.</li>
</ol>6. sådan citeres brøker
<ol><li>Overfør 500 μL øvre MTBE-fase (lipider) til et mærket 1,5 mL rør. Prøverne tørres ved hjælp af en vakuum koncentrator (Se tabel over materialer) og opbevares ved-80 °c indtil måling.</li>
	<li>Fjern den resterende MTBE-fase ved hjælp af en 200 μL pipette.</li>
	<li>Overfør 650 μL af den nedre fase (polære og semi-polære metabolitter) til et nyt mærket rør. Prøverne tørres ved hjælp af en vakuum koncentrator (Se tabel over materialer) og opbevares ved-80 °c indtil måling.</li>
	<li>Fjern den resterende nedre fase ved at afpipettere den overskydende lydstyrke.</li>
	<li>Fastfryse den faste pellet i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C indtil yderligere ekstraktion.</li>
</ol>7. bestemmelse af polære metabolitter (primære metabolitter)
<ol><li>Resuspension af den tørrede pellet i Polar fasen (trin 6,3) i methoxyaminhydrochlorid/pyridin opløsning til methoxymization af carbonylgrupper.</li>
	<li>Prøverne opvarmes ved 37 °C i 90 min.</li>
	<li>Prøverne fremkaldes med N-methyl-N-trimethylsilyltrifloracetamid (MSTFA) i 30 min ved 37 °C som beskrevet tidligere13.</li>
	<li>Brug gaskromatografi koblet til Time-of-Flight massespektrometri (GC-TOF-MS) til at analysere de primære metabolitter. De anvendte graduerings parametre var i overensstemmelse med den tidligere beskrevne protokol14.</li>
</ol>8. bestemmelse af ikke-polære metabolitter (lipiderne)
<ol><li>Re-suspendere den tørrede pellet af ikke-polære fase (trin 6,1) i en blanding af acetonitril: isopropanol (7:3, v:v).</li>
	<li>Der centrifugeres ved 20000 x g og adskilles i en omvendt fase C8-kolonne (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm partikler) ved hjælp af et uplc-system (Se tabel over materialer). De to mobile faser var vand med 1% 1 M ammonium acetat, 0,1% eddikesyre (buffer A) og acetonitril: isopropanol (7:3) indeholdende 1% 1 M ammonium acetat, 0,1% eddikesyre (buffer B).</li>
	<li>Brug graduerings parametrene i henhold til den tidligere beskrevne protokol14.</li>
</ol>9. bestemmelse af klorofyl indhold
<ol><li>Bland 100 μL af MTBE-fasen (trin 6,1) med 900 μL 90% methanol for en metode, der er tom, samt de eksperimentelle prøver.</li>
	<li>Absorbansen måles ved hjælp af spektrofotometeret ved en bølgelængde på 665 nm og 652 nm for at skelne mellem klorofyl a og klorofyl b. Bemærk: absorptionen skal variere mellem 0,1 og 1 for en gyldig koncentrations beregning. Fortynd prøverne, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Beregn klorofyl a og b indhold, og også det samlede klorofyl indhold i henhold til følgende formler. CHLa = 16.82 a665 – 9.28 a652 CHLb = 36.92 a652 – 16.54 a665 CHLa = b = 0.28 a665 + 27.64 a652 Bemærk: formlerne blev beskrevet af bar-Nun og Ohad15.</li>
</ol>10. ekstraktion og bestemmelse af proteinindholdet, fordøjelsen og analysen
Bemærk: for at resuspendere proteinet blev pellet urea/thiourea buffer (6 M urinstof, 2 M thioureaog proteasehæmmere og fosfatasehæmmere) anvendt med ændringer i den protokol, der tidligere var beskrevet16. Men, enhver buffer valg kan anvendes til opblanding af proteiner.
<ol><li>Protein bufferen forberedes ved hjælp af følgende koncentrationer: 6 M urinstof og 2 M thiourea.</li>
	<li>Pellet (trin 6,5) opløses i 200 μL protein buffer (10,1).</li>
	<li>Prøverne inkubates ved stuetemperatur i 30 minutter efterfulgt af centrifugering ved 20000 x g i 5 min.</li>
	<li>Overfør supernatanten, som indeholder proteinerne, til et nyt rør.</li>
	<li>Bestem proteinkoncentrationen ved Bradford assay17.</li>
	<li>Digest 50 μg protein i opløsning med en valg protokol. Her ovre, hjælp den næste protokol.<ol>
<li>Reducer 50 μg protein prøver ved hjælp af 5 mM DTT i 30 min efterfulgt af alkylering med 10 mM iodoacetamid i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.</li>
		<li>Tilsæt trypsin/lys-C mix ved et 25:1 protein: proteaseratio (w/w), bland og Inkuber i 3 timer ved 37 °C.</li>
		<li>Prøverne fortyndes seks folder med 50 mM TrisHCl (pH 8) og Inkuber natten over ved 37 °C.</li>
		<li>Afslut fordøjelsen ved at tilsætte trifluoroeddikesyre (TFA) til en endelig koncentration på 0,5 – 1%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter fordøjelsen, udføre afsaltningen af peptider før massespektrometri ved hjælp af C18 Stage tips og elueres de fordøjet peptider18.</li>
	<li>Prøverne koncentreres i nærheden af tørhed, og 2-5 μL af opløsningen efterlades i en vakuum koncentrator (Se tabel over materialer) uden opvarmning.</li>
	<li>Prøverne opslæmmes i indlæsnings bufferen (5% acetonitril, 0,5% myresyre), og peptidblandinger analyseres med LC-MS/MS ved hjælp af et massespektrometer med høj opløsning (Se tabel over materialer), der er forbundet med et Nano-uplc-system.</li>
	<li>Adskil peptiderne ved hjælp af UPLC-system (Se tabel over materialer) på en 20 cm omvendt fase opladet overflade hybrid (Csh) kolonne (Se tabel over materialer) med en indvendig diameter på 75 μm og en partikelstørrelse på 1,7 μm.</li>
	<li>Læg 4 μL prøve, og Kør gennem 90 min gradient ved en strømningshastighed på 300 nL/min.</li>
	<li>Indstil forløbet. Brug delvise loop-offline-indstillinger med isokratisk gradient indstillet til 3% af buffer B (99,9% acetonitril + 0,1% myresyre), der holdes i 14 min før løkken skiftes til online position med kolonnen, derefter øges gradienten lineært for 50 min, indtil 20% buffer B er nået.</li>
	<li>Inden for de næste 15 min, øge koncentrationen af buffer B til 30%. Så i de følgende 15 min, øge buffer B til 40%, før de når 90% af buffer B efter yderligere 4 min. Udfør vaske trinnet, som er nødvendig for at rengøre søjlen, på 400 nL/min og hold i yderligere 10 min (Se tabel 1 for detaljeret gradient betingelser).</li>
	<li>Endelig sættes systemet tilbage til en strømningshastighed på 300 nL/min og en koncentration på 3% buffer B inden for 1 min. Ækvibrere søjlen i 15 minutter, før den næste prøve injiceres. Bemærk: en komplet liste over identificerede proteiner efter LCMS/MS analyse er præsenteret i tabel 2.</li>
</ol>11. udvinding og bestemmelse af stivelsesindhold
Bemærk: til bestemmelse af det totale protein-og stivelsesindhold blev den faste pellet ekstraheret i en to-trins procedure som beskrevet tidligere10.
<ol><li>Tilsæt 500 μL 80% (v/v) ethanol til celle pellet (trin 6,5) og Inkuber i 10 min ved 80 °C.</li>
	<li>Centrifugeres ved 4000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter opløses pellet i 250 μL sterilt vand efterfulgt af tilsætning af 250 μL 100 mM natriumacetat.</li>
	<li>Hydrolyserer stivelsen ved opvarmning i 3 timer ved 99 °C. Den opløste stivelse fordøje til glukose monomerer natten over ved tilsætning af en enzym blanding af α-amylase (4,2 enheder pr. prøve) og α-amyloglucosidase (10 enheder pr. prøve). Inkubér rørene ved 37 °C natten over. Bemærk: efter inkubation kan prøverne fryses ved-20 °C i få dage eller ved-80 °C i flere måneder forud for glucosemålinger.</li>
	<li>Centrifugeres det Ford øjede ekstrakt ved 20000 x g i 5 minutter og opsamles supernatanten. Supernatanten (med de stivelses afledte glucomonomerer) opløses i 100 mM HEPES-buffer (pH 7), der indeholder 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP og glucose-6-fosfat-dehydrogenase (1 enhed pr. prøve).</li>
	<li>For at analysere stivelsesindholdet skal du først måle baseline absorbans ved 340 nm. Tilsæt derefter hexokinase (1 enhed pr. prøve) for at starte reaktionen. Endelig måles stigningen af NADPH + H+ (angiver niveauet af stivelse fordøjet til glukose) ved 340 nm med en 96-brønd plade læser. Bemærk: forskellen mellem den maksimale værdi ved 340 nm (bør ikke overskride det lineære interval på 1), og basislinjen svarer til glucosekoncentrationen af den Ford øjede stivelse. Der skal foretages en glucosekurve for at bestemme glucosekoncentrationen i nmol for glucose pr. mL.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+applications+of+microalgae.">Commercial applications of microalgae.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).</li><li>Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+diversity+and+synthetic+biology+for+the+production+of+algal+biofuels.">Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels.</a> Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).</li><li>Pulz, O., Gross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valuable+products+from+biotechnology+of+microalgae.">Valuable products from biotechnology of microalgae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).</li><li>Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrophic+cultures+of+microalgae:+metabolism+and+potential+products.">Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products.</a> Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).</li><li>Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+systems+biology+in+engineering+microbes+for+biofuel+production.">Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+reconstruction+of+Chlamydomonas+offers+insight+into+light-driven+algal+metabolism.">Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism.</a> Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).</li><li>Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlgaGEM--a+genome-scale+metabolic+reconstruction+of+algae+based+on+the+Chlamydomonas+reinhardtii+genome.">AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome.</a> Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).</li><li>Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Profiling+of+a+Synchronized+Diurnal+Transcriptome+from+Chlamydomonas+reinhardtii+Reveals+Continuous+Cell+and+Metabolic+Differentiation.">High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation.</a> Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).</li><li>Willamme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+of+the+green+microalga+Chlamydomonas+reinhardtii+cultivated+under+day/night+conditions.">Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions.</a> Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).</li><li>Juppner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+lipids+and+metabolites+during+the+cell+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).</li><li>Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+fast,+comprehensive+and+reproducible+one-step+extraction+method+for+the+rapid+preparation+of+polar+and+semi-polar+metabolites,+lipids,+proteins,+starch+and+cell+wall+polymers+from+a+single+sample.">Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample.</a> Plant Methods. 12, 45 (2016).</li><li>Harris, E. H., Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook. 1, 248-249 (2009).</li><li>Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+advance:+simultaneous+analysis+of+metabolites+in+potato+tuber+by+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).</li><li>Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fractionated+Extraction+Method+for+the+Comprehensive+Analysis+of+Metabolites,+Lipids,+and+Proteins+from+a+Single+Sample.">A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li><li>Bar-Nun, S., Ohad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[34]+Chloroplast+membrane+polypeptides.">[34] Chloroplast membrane polypeptides.</a> Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+by+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionisation-time+of+flight+mass+spectrometry.">Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry.</a> Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+quality+control+tools+for+mass+spectrometry+proteomics.">Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics.</a> Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).</li><li>Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REVIGO+summarizes+and+visualizes+long+lists+of+gene+ontology+terms.">REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms.</a> PloS one. 6 (7), e21800 (2011).</li><li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance.">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li><li>Caldana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+analysis+of+inducible+target+of+rapamycin+mutants+reveal+a+general+metabolic+switch+controlling+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).</li><li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+Arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation.">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li><li>Hummel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatography+and+high+resolution+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+plant+lipids.">Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids.</a> Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+(13)+C,+(15)+N+and+(34)+S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+dissection+of+spatiotemporal+metabolic+shifts+in+primary,+secondary,+and+lipid+metabolism+during+developmental+senescence+in+Arabidopsis.">Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).</li><li>Lambers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteaceae+from+severely+phosphorus-impoverished+soils+extensively+replace+phospholipids+with+galactolipids+and+sulfolipids+during+leaf+development+to+achieve+a+high+photosynthetic+phosphorus-use-efficiency.">Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency.</a> New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).</li><li>Degenkolbe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+remodeling+of+the+lipidome+during+cold+acclimation+in+natural+accessions+of+Arabidopsis+thaliana.">Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).</li><li>Bromke, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+high-resolution+mass+spectrometry+for+fatty+acid+profiling.">Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling.</a> The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAX1,+a+novel+membrane+protein+mediating+plastid+fatty+acid+export.">FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.</a> PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).</li><li>Hemme, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+analysis+of+acclimation+responses+to+long-term+heat+stress+and+recovery+in+the+photosynthetic+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).</li><li>Sharma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS+analysis+of+Chlamydomonas+reinhardtii+and+Scenedesmus+obliquus+lipid+extracts+and+their+possible+metabolic+roles.">UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles.</a> Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).</li><li>Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human,+chimpanzee,+macaque,+and+mouse+tissues.">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li><li>Khrameeva, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neanderthal+ancestry+drives+evolution+of+lipid+catabolism+in+contemporary+Europeans.">Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans.</a> Nature Communications. 5, 3584 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness.">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).</li><li>Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationales+and+approaches+for+studying+metabolism+in+eukaryotic+microalgae.">Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae.</a> Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).</li><li>Allwood, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+reproducibility+of+fast+gas+chromatography-electron+impact-time+of+flight+mass+spectrometry+(GC-EI-TOF/MS)+based+plant+metabolomics.">Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics.</a> Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingen oplysninger.

I denne artikel, vi illustrerede en robust og meget anvendelig udvinding protokol for omfattende lipidomics, metabolomics, stivelse og proteomics analyse fra en enkelt pellet af 10-15 x 106 celler. Metoden er blevet implementeret med succes i flere undersøgelser for en bred vifte af celler og væv10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Her præsenterede vi en trinvis pipeline for multi-omics analyse af forskellige biomolekyler fra en enkelt prøve høstet fra chlamydomonas Calabaria (CC-1690 MT +) kultur.
Protokollen giver en robust og reproducerbar tilgang til behandling af flere prøver på én gang, til analyse af forskellige biomolekyler. Men, en række kritiske skridt bør tages hånd om for at minimere den tekniske variation. For det første bør høst af cellerne ske så hurtigt som muligt, samtidig med at de ensartede betingelser for alle høstede prøver bevares for at bevare cellernes biologiske tilstand. Selvom vi brugte centrifugering til at høste cellerne, kan alternative høst strategier anvendes til høst af prøverne. Men, det er vigtigt at bemærke, at forskellige høst strategier er kendt for at påvirke den metaboliske tilstand af cellerne37 derfor, konsekvent høst tilgang skal anvendes til alle eksperimentelle prøver. For det andet er det vigtigt at undgå tørring af den øvre ikke-polære fase, der indeholder klorofyl, da dette kan påvirke niveauerne af opløst klorofyl i opløsningsmidlet, som påvirker normaliserings faktoren for prøverne. Endelig bør man være forsigtig med at fjerne den resterende Polar fase for at opnå protein-og stivelses pellet for at undgå at forstyrre den pellet, der kan påvirke indholdet af stivelse og protein.
Derved præsenteret udvinding protokol tilbyder flere fordele for multiple-omics dataanalyse. Ud over at minimere antallet af påkrævede prøve-aliquoter reducerer det også variationen mellem de analytiske resultater, der er opnået for forskellige biomolekyler. Dette muliggør direkte sammenligning af resultaterne fra de primære metabolitter, lipiderne og de proteomiske data. På samme måde muliggør den samtidige ekstraktion af flere sammensatte klasser en ensartet og ensartet normaliserings strategi for de forskellige datasæt. Dette gælder især, hvis normalisering er svært at opnå ved hjælp af tør eller frisk vægt38 eller celle nummer.
Protokollen kan gennemføres med henblik på rutinemæssig screening af en kompleks biologisk prøve. Disse holistiske metabolomic, lipidomiske og proteomisk datasæt kan tilbyde omfattende information om systematiske ændringer i stofskiftet. Desuden giver de data, som er indhentet fra proteomics-analysen, indsigt i de kvantitative (overflod) og kvalitative (ændringer) ændringer i proteiner i forhold til metabolitterne. Integrationen af omik-data kunne således afsløre dybtgående oplysninger om ændringer, der skyldes genetiske eller biotiske og/eller abiotiske forstyrrelser i et biologisk system. Således, belyse molekylære ændringer af specifikke metaboliske veje eller cellulære processer. På samme måde kan disse data med høj dataoverførselshastighed gøre det muligt at identificere mål for metaboliseringsteknik og raffinere eller afprøve forudsigelser fra metaboliske modeller af genomskala37,39.

Mikroalger er en rig kilde til naturlige produkter (f. eks. brændstoffer, menneskers og dyrs ernæring, kosmetik og farmakologiske stoffer). Der gennemføres talrige forskningsbestræbelser for at øge effektiviteten af produktionen af produkter af høj værdi fra mikroalger1,2,3,4. System-niveau forståelse af metabolisme er en forudsætning for at forbedre kvaliteten og udbyttet af naturlige produkter5,6,7. Med fremkomsten af funktionelle genomteknikker og forbedrede massespektrometri metoder, tusindvis af gener, udskrifter, proteiner, og metabolitter kan overvåges samtidigt. Der kræves dog flere prøver til dybdegående proteomics, lipidomics og metabolomics undersøgelser, som ofte er svære at opnå i unicellulære organismer, især hvis der skal udføres tidskursus undersøgelser. Desuden introducerer indsamling og behandling af forskellige prøve aliquoter i kombination med forskellige protokoller til indsamling af de meget komplekse omik-data (dvs. proteomic, lipidomic og metabolomics) variabilitet, hvilket gør integrationen af data til en udfordrende opgave.
Chlamydomonas giver ikke kun et fremragende mikrobielt system til undersøgelse af cellulære processer, men også en bekvem model til at studere koordineringen af celle cyklus og metabolisme. Derfor er en stærk koordination af transskriptioner udtryk med celle cyklus blevet vist ved hjælp af høj opløsning transkriptom profilering af synkroniseret kultur af Chlamydomonas8. Omkring 80% af de analyserede udskrifter udstillet robust periodicitet over en 24 h celle cyklus8. Ligeledes, tør vægt, proteiner, chlorophyll, aminosyrer og fedtsyrer af to forskellige stammer af Chlamydomonas viste sig at korrelere med celledeling i en undersøgelse, hvor prøvetagning blev udført hver 4 h9. For nylig blev det rapporteret, at metabolitten og lipid dynamikken i celle skiftet baseret på specifikke faser af cellen cyklus10. De subtile ændringer i forskellige biomolekyler var mulige at overvåge ved hjælp af en robust methyltert-butylether (MTBE): methanol: vandbaseret ekstraktionsmetode, som giver et ideelt udgangspunkt for omfattende multi-omics-analyse10 , 11.
Den præsenterede protokol guider gennem en reproducerbar og effektiv strategi10, for samtidig ekstraktion af lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve alikvot, for den tid, der er løst metabolomic og lipidomisk undersøgelse af synkrone voksende Chlamydomonas kulturer. Ud over at illustrere de robuste og reproducerbare metaboliske og lipidomiske data10, her, er kvaliteten af de proteiske prøver opnået fra samme pellet også påvist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td>Internal standard for metabolites, ISOTEC&#174; Stable Isotopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27840-500MG</td>
			<td>Internal standard for metabolites, HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5072</td>
			<td>Enzymatic digestion of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for sample extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenter system</td>
			<td>Glasbl&#228;serei M&#252;ller, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>custom made fermenter of 800ml capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 &#956;m and a particle size of 1.7 &#956;m</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186007477</td>
			<td>Analysis of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td>standard preset sonication power at 45kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td>particle (cells) volume and number analyser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii

Mikroalger har været fokus for forskning for deres anvendelser i produktionen af høj værdi forbindelser, fødevarer og brændstof. Desuden er de værdifulde fotosyntetiske modeller lette forståelsen af de grundlæggende cellulære processer. System dækkende undersøgelser muliggør omfattende og dybtgående forståelse af organismers molekylære funktioner. Der kræves imidlertid flere uafhængige prøver og protokoller for proteomics, lipidomics-og metabolomics-undersøgelser, som indfører højere fejl og variabilitet. Her præsenteres en robust ekstraktionsmetode med høj gennemløb for samtidig ekstraktion af klorofyl, lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve af den grønne Alga chlamydomonas Calabaria . Den illustrerede eksperimentelle opsætning er for Chlamydomonas kulturer synkroniseret ved hjælp af 12 h/12 h lys/mørke forhold. Der blev indsamlet prøver over en 24-timers celle cyklus for at påvise, at metabolitter, lipider og stivelses data opnået ved hjælp af forskellige analytiske platforme er godt konforme. Desuden blev protein prøver indsamlet ved hjælp af samme ekstraktions protokol anvendt til at gennemføre detaljerede proteomics-analyser for at evaluere deres kvalitet og reproducerbarhed. Baseret på de data, kan det udledes, at den illustrerede metode giver en robust og reproducerbar tilgang til at fremme forståelsen af forskellige biokemiske veje og deres funktioner med større tillid til både grundlæggende og anvendt forskning.

Chlamydomonas Calabaria CC-1690 kultur synkronisering For at demonstrere de repræsentative resultater for den givne protokol, præsenterer vi eksemplet multi-omics data opnået efter høst og ekstraktion af prøver fra synkroniserede chlamydomonas Calabaria kulturer10. Synkroniserede kulturer af Chlamydomonas består af celler, der tilhører en ensartet vækstfase på et bestemt tidspunkt. Chlamydomonas-kulturerne blev synkroniseret ved 12 timer/12 timer lys/mørk cyklus, 34 °C med en lysintensitet på 200 μmol · m-2· s-1 og co2 -koncentrationen of2%, v/v, beskrevet som optimal koncentration for stammen CC-1690 MT +10 . Disse betingelser var tidligere blevet optimeret og valideret ved hjælp af forskellige celle cyklusparametre10. Figur 1 viser celle størrelsesfordeling målt med Coulter Counter på forskellige tidspunkter af synkroniserede kulturer. Et skift i celle volumen kan observeres som cellerne vokser i størrelse gennem lys fase, efterfulgt af frigivelsen af datter celler startende i slutningen af lys fase fra 10 h. Når alle datter cellerne er frigivet, kan Skift i celle volumen observeres som de nyligt frigivne datter celler er afsat til at begynde den næste cyklus 10 (figur 1).
Prøveudtagning, håndtering og udvinding Hurtig høst af prøver udføres ved hjælp af centrifugering og efter kassering af supernatanten kan pillerne opbevares ved-80 °C indtil ekstraktion. Som beskrevet ovenfor (trin 5) resulterer MTBE ekstraktion i tre særskilte faser: a) organisk fase blev anvendt til at måle lipider samt klorofyl niveauer (normaliseringsfaktor), b) Polar fase blev indsamlet for at måle metabolitter på GCMS, mens c) pellet blev brugt til måling af stivelsesindhold og proteiner. I figur 2illustreres en oversigt over fordelingen af de forskellige faser og deres beskæftigelse.
Polære og ikke-polære metabolitter Baseret på GCMS-analysen af Polar fraktionen blev 65 metabolitter kommenteret, der dækkede aminosyrer, nukleinsyrer, mellemprodukter af glycolyse, glukoneogenese, tricarboxylsyrecyklus, pentose fosfat pathway og polyaminer (figur 3a). LCMS-analysen af neutral fase indeholdende lipider førte til identifikation af 204 forskellige lipidarter, som dækkede forskellige lipid-klasser, nemlig phosphatidylglyceroler, phosphatidylethanolamin, sulfoquinovosyl diacylglyceroler, monogalactosyldiacylglyceroler, digalactosyldiacylglyceroler, diacylglyceryltrimethylhomoserin, fedtsyrer, diacylglycerider og triacylglycerider. For at visualisere de globale forskydninger i metabolitterne og lipiderne på tværs af cellecyklussen blev der anvendt hovedkomponent analyse (PCA). Partnerskabs-og samarbejdsaftalen viser en adskillelse af lyse og mørke faser for både metabolomics og lipidomiske data. Desuden kan en semi-cyklisk (delvist åben cirkel) blive bemærket for begge data (figur 3c, D). Den delvise kløft i det cirkulære mønster tilskrives det faktum, at prøverne ved 24 h af cellecyklussen blev indsamlet under mørke i modsætning til de prøver, der blev indsamlet i begyndelsen af cellecyklussen efter 0,25 h udsættelse for lyset (figur 3c , D).
Analyse af protein og stivelse For at undersøge kvaliteten af den protein pellet, der blev opnået som følge af MTBE-ekstraktion, blev 6 prøver anvendt til proteomisk analyse. Kvaliteten af proteomics data opnået ved at fordøje 50 μg protein/prøve, blev undersøgt ved hjælp af et beregningsmæssige kvalitetskontrol værktøj-proteomics Quality Control (PTXQC)19, der indikerer reproducerbar og høj kvalitet af proteomics data opnået fra alle replikater (supplerende figur 1). Den molekylære funktionelle dækning af proteiner blev undersøgt ved hjælp af REVIGO20. En oversigt over funktionel berigelse af de 2463 identificerede proteiner (Se tabel 2) er præsenteret i figur 4a. Den resterende pellet efter proteinekstraktion blev anvendt til reproducerbar kvantificering af stivelse som angivet ved lav standardafvigelse blandt forskellige replikater (figur 4b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig1.jpg"> Figur 1: illustrativt eksempel på ændringer i celle volumen på tværs af forskellige faser af cellecyklussen i chlamydomonas Calabaria. Den x-akse, der repræsenterer celle lydstyrken, mens y-aksen repræsenterer celle nummeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig2.jpg"> Figur 2: illustreret workflow for ansættelse af forskellige faser under multi-omics udvinding celle pellets. Figuren er blevet genbrugt fra Juppner, J.et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig2large.jpg" target="_blank">Klik venligst her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig3.jpg"> Figur 3: repræsentativt eksempel på metabolitter og lipider identificeret ved hjælp af den beskrevne protokol. A) metabolit-klasser identificeret ved gcms-analyse. B) lipidarter, der tilhører forskellige klasser, som er identificeret ved LCMS-analyse. (C) princip komponent analyse af metabolitten niveauer i 24 h celle cyklus. D) princip komponent analyse af lipiderne i en 24-timers celle cyklus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig4.jpg"> Figur 4: repræsentativt eksempel på data om protein og stivelse. A) Molekylær funktionel berigelse af proteinerne identificeret ved hjælp af LCMS-analyse, træstruktur trukket ved hjælp af REVIGO 20 B) repræsentative stivelses data, der viser protokollens reproducerbarhed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: tilpasset design af Fermenter system til temperatur og beluftning kontrolleret synkrone vækst af Chlamydomonas kulturer. Figuren er blevet genbrugt fra Juppner, J.et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S1.eps">Klik venligst her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: repræsentativt resultat for proteomics datakvalitet. Heatmap plottet ved hjælp af Computational PTXQC Tool19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S2.eps">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tid (min.)</td>
			<td>% Buffer B til buffer A</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0 til 15 min</td>
			<td>Lineær graduering fra 0 TM3%</td>
			<td>Buffer A: 0,1% myresyre i UPLC-kvalitet vand</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 til 75 min</td>
			<td>Lineær gradient fra 3% til 30%</td>
			<td>Buffer B: 0,1% myresyre i 60% UPLC-klasse acetonitril</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 til 90 min</td>
			<td>Lineær gradient fra 30% til 40%</td>
			<td>Strømningshastighed 300 nL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>90 til 94 min</td>
			<td>Lineær gradient fra 40% til 90%</td>
			<td>Injektionsvolumen 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 to104 min</td>
			<td>vask kolonnen med 90%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>105 til 120 min</td>
			<td>Ækvibrere søjlen i 15 min ved 3%</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: væskekromatografi af peptidprøver, gradient parametre.
Tabel 2: liste over proteiner, der er identificeret efter LCMS/MS-analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/Table_2.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

En multi-omics ekstraktionsmetode til dybtgående analyse af synkroniserede kulturer af den grønne Alga chlamydomonas Calabaria

System dækkende analyse af flere biomolekyler er afgørende for at opnå funktionel og mekanistisk indsigt i biologiske processer. Herved beskrives en omfattende protokol for udvinding af lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve høstet fra synkroniseret Chlamydomonas-kultur.

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Systemer-dækkende undersøgelser er afgørende for en dybtgående forståelse af de biologiske funktioner. Der kræves dog flere uafhængige prøver til forskellige omics-platforme, hvilket introducerer en høj mængde variation i dataene. Denne metode tilbyder en robust og høj-throughput strategi for samtidig ekstraktion af klorofyl, lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve af modellen grønne alger, Chlamydomonas reinhardtii.For klorofyl, lipid, og metabolit ekstraktion, arrangere rør af høstede Klamydomonas celle pellets i flydende nitrogen. Pelletsuspendrer pelletet i hvert rør med en milliliter 20 graders ekstraktionsbuffer. For at undgå fordampning af den lave viskositetsekstraktionsbuffer, skal rørerne hurtigt vortex, indtil cellerne er godt homogeniseret i ekstraktionsblandingen, og undersøg opløsningen i to milliliter mikrocentrifugerør.Sonikere kulturerne i et sonikeringsbad i iskoldt vand i 10 minutter før inkubation på en orbital shaker ved 1.000 rotationer i minuttet i 60 minutter ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning tilsættes 650 mikroliter ekstraktionsbuffer to, og prøverne hvirvles kort før centrifugering. For at tage fraktionerne overføres 500 mikroliter af den øvre MTBE lipidfase til et mærket 1,5 milliliterrør.Brug en 200 mikroliterpipette til at fjerne lipidfasen og overføre 650 mikroliter i den nedre polære og halvpolære metabolitfase til nye mærkede rør. Inspirer det overskydende volumen for at fjerne den resterende nederste fase og fryse de faste pellets i flydende nitrogen til 80 graders opbevaring. Ved bestemmelse af polarmetabolit skal den tørrede pellet i polarfasen i methoxyaminhydroridpyidopløsning opvarmes til methoxymisering af carbonylgrupperne, og prøverne opvarmes ved 30 grader Celsius i 90 minutter.Ved inkubationens afslutning derivatize prøverne med n-methyl-n-trifluoracetamid i 30 minutter ved 37 grader Celsius i henhold til standardprotokoller. Brug gaskromatografi koblet til time-of-flight massespektrometri til at analysere de primære metabolitter. Ved bestemmelse af ikke-polær metabolit opsaltning opsaltning af den tørrede pellet i den ikke-polære fase i en blanding af 7-3 volumen til volumen acetonitrile til isopropanol og sediment pellets ved centrifugering.Derefter adskilles prøverne på en omvendt fase C8 kolonne på et ultraperformance væskekromatografisystem. Ved bestemmelse af klorofylindhold blandes 100 mikroliter i MTBE-fasen med 900 mikroliter på 90 % methanol for metodesting samt forsøgsprøverne. Absorbansen på et spektrofotometer måles derefter ved 655 og 652 nanometerbølgelængder for at skelne mellem klorofyl a og klorofyl b og beregne indholdet af klorofyl a og b og det samlede indhold af klorofyl.Ved proteinekstraktion opløses den nederste fasepille i 200 mikroklitter af proteinbufferen, og prøven inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Ved inkubationens afslutning centrifugeres prøven, og det proteinholdige supernatant overføres til et nyt rør. Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen.For at fordøje proteinet reduceres 15 mikrogram af prøven i fem millimolar dithiothreitol i 30 minutter efterfulgt af alkylering med 10 millimolar iodoacetamid i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Ved afslutningen af alkyleringen blandes Trypsin/Lys-C-opløsningen ved et 25 til et protein til proteaseforhold og inkuberes prøven i tre timer ved 37 grader Celsius. Prøven seksdobles seksdoblet i 50 millimolarttri Hcl for en inkubation natten over ved 37 grader Celsius.Næste morgen afsluttes fordøjelsen med trifluoretsyre til en endelig koncentration på 0,5 til 1%Efter fordøjelsen skal prøverne koncentreres i nærheden af tørhed, så to til fem mikroliter opløsning efterlades i en vakuumkoncentrator uden opvarmning. Opslænt prøven i lastningsbufferen igen. Analysere peptid blandinger af flydende kromatografi tandem massespektrometri ved hjælp af en høj opløsning massespektrometer forbundet til en nano ultra tryk flydende kromatografi system.For at adskille peptiderne skal du lægge fire mikroliter af prøven på en 20 centimeter omvendt fase ladet overfladehybriskosko med en indre diameter på 75 mikrometer og en partikelstørrelse på 1,7 mikrometer. Brug delvise offlineindstillinger for løkken med et isokratisk forløb indstillet til 3 % af buffer B, der holdes i 14 minutter, før løkken flyttes til onlinepositionen med kolonnen, hvorefter forløbet øges lineært i 50 minutter, indtil 20 %buffer B nås. Et skift i cellevolumen kan observeres, efterhånden som cellerne vokser i størrelse i hele lysfasen, efterfulgt af frigivelsen af datterceller, der starter ved afslutningen af lysfasen fra 10 timer.Når alle dattercellerne er blevet frigivet, kan der observeres et skift i cellevolumenet, da de nyligt frigivne datterceller er indstillet til at begynde den næste cyklus. Baseret på gaskromatografi massespektrometri analyse af polar fraktion, i denne repræsentative eksperiment, 65 metabolitter blev kommenteret. Den flydende kromatografi massespektrometri analyse af lipid-holdige neutrale fase førte til identifikation af 204 forskellige lipid arter, der dækker forskellige lipid klasser.Hovedkomponentanalyse kan bruges til at visualisere globale forskydninger i metabolitter og lipider i hele cellecyklussen med en adskillelse af lyse og mørke faser samt semicykliske faser observeret for både metabolomik og lipidomic data. Her vises en oversigt over den funktionelle berigelse af 2.463 identificerede berigede proteiner. Den resterende pellet efter proteinekstraktion kan anvendes til reproducerbar kvantificering af stivelsen, som det fremgår af den lave standardafvigelse mellem forskellige replikater.Det er vigtigt at undgå tørring af den øvre klorofyl organiske fase, da dette kan påvirke niveauet af klorofyl i opløsningsmidlet, påvirker normalisering faktor for prøverne. Forskellige analytiske procedurer kan gennemføres for den biokemiske karakterisering af de udvænkede molekylære arter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Anvendelse af DNA-specifik farvning Methyl Green i Fluorescent Labeling af embryoner

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Brug af Konfokal Analyse af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; At Undersøg Modulatorer af Wnt og Shh Morfogen Gradienter

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differentiering af SH-SY5Y human neuroblastomcellelinje

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En Metode til Lineage Sporing af hornhindeceller Brug Multi-color Fluorescent Reporter Mus

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur af murine embryonale Mellemfodsben: en fysiologisk model af endochondral ossifikation

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Kvantificering af forgreningsdensitet i rotte mammary Gland Whole-mounts ved hjælp af Sholl analysemetoden

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

En Seminiferous tubulus Squash teknik til cytologiske analyse af spermatogenesen ved hjælp af musen Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tre-dimensionelle gengivelse og analyse af Immunolabeled, klarere menneskelige placenta villøs vaskulære netværk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tre-dimensionelle Organotypic kulturer af vestibulære og auditive sanseorganer

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...