Name: a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2019-08-08T12:30:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

<span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Nous sommes très reconnaissants à Gudrun Wolter et à Nne Michaelis pour l'excellente assistance technique. Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Giavalisco pour leur aide. Nous sommes reconnaissants à la Société Max Planck pour le financement de la recherche et FAPESP pour la bourse de L A Giraldi

1. Pré-cultures de Chlamydomonas reinhardtii
<ol><li>Préparer les pré-cultures de Chlamydomonas reinhardtii (type sauvage de souche CC-1690 mt) en transférant les cellules des plaques solides du milieu TAP aux flacons Erlenmeyer avec 200 ml de HSM moyen12.</li>
	<li>Cultivez les pré-cultures sur un shaker rotatif à 24 oC à 100 'moles 'm-2-1 lumière continue jusqu'à ce que la densité cellulaire atteigne 2 x 106 cellules/mL.</li>
</ol>2. Synchronisation des cultures liquides de Chlamydomonas dans des fermenteurs
REMARQUE : Les paramètres présentés dans ce protocole,tels que la température, la lumière et le CO 2, sont spécifiques à la synchronisation de la souche CC-1690 mt. Afin de développer une culture synchronisée à l'aide d'une autre souche, il est nécessaire de tester les conditions optimales.
<ol><li>Transférer la préculture dans un système de fermenteur (voir la figure 1 supplémentaire pour la conception de fermenteur sur mesure), reliée à une glacière de recirculation pour maintenir la température, avec bouillonnement de CO2 filtré (2 %, v/v) et remuée avec un barre magnétique d'agitation au fond du fermenteur avec l'agitation constante.</li>
	<li>Pour initier la synchronisation, régler le fermenteur à un régime clair-obscurité de 12:12 h, en dessous de 34 oC et 200 'moles-s-1 lumière et s'assurer qu'il contient 500 ml de culture dans le milieu HSM avec une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>À la fin du cycle de 24 h, re-diluer la culture à 1 x 106 cellules/mL avec le milieu HSM frais avec la perturbation minimale en utilisant un système de tube en combination avec des pompes péristaltiques, qui permet d'abord de pomper une quantité distincte de culture dehors et ensuite pompe ntre dedans médium stérilisé automatique. REMARQUE : En tant que pompe alternative à pompes péristétiques, des seringues isolantes peuvent être utilisées pour retirer la culture, tandis que le volume requis de milieu frais peut être ajouté directement dans le fermenteur dans des conditions stériles.</li>
	<li>Répétez l'étape 2.3 trois fois pour obtenir les cultures synchronisées le 4ème jour de l'inoculation.</li>
	<li>Afin de valider la synchronisation des cellules, récolter des échantillons à un intervalle de chaque 2 h et mesurer la densité cellulaire et le volume cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire et de l'analyseur de taille (voir Tableau des matériaux). Selon la densité cellulaire, diluer les échantillons entre 1:10 à 1:100 et mesurer dans une gamme de taille de 30 à 1900 m3.</li>
</ol>3. Récolte des cellules de Chlamydomonas
<ol><li>Étiqueter les tubes coniques centrifugeuses de 15 ml et préparer un dewar rempli d'azote liquide.</li>
	<li>Récoltez des échantillons à l'aide d'une seringue (50 cm3) à travers le tube de verre intérieur du fermenteur. Distribuer l'échantillon dans des tubes coniques de centrifugeuse qui devraient contenir 10-15 x 106 cellules. Notez le volume transféré à chaque tube et mesurez la densité cellulaire et la taille des cellules de chaque point de temps à l'aide du compteur cellulaire et de l'analyseur de taille (voir Tableau des matériaux)</li>
	<li>Pelleter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 4000 x g. Ensuite, jetez le supernatant, congelez les granulés dans de l'azote liquide et entreposez-les plus tard à -80 oC.</li>
</ol>4. Préparation des tampons d'extraction et de la chlorophylle d'extraction, lipides et métabolites
CAUTION : Le méthanol (MeOH) et le MTBE sont inflammables et peuvent causer une irritation des voies respiratoires, des yeux ou de la peau lors d'une exposition et/ou d'un contact prolongés. Veuillez les manipuler avec soin seulement dans une hotte de fumée et utiliser les procédures de sécurité appropriées pendant l'extraction (manteau de laboratoire, lunettes de sécurité, gants, etc.).
<ol><li>
Tampon d'extraction 1
	<ol>
<li>Dans un flacon volumétrique de 100 ml, ajouter 75 ml de MTBE, 25 ml de MeOH (grade UHPLC) et homogénéiser (3:1, vol/vol).</li>
		<li>Ajoutez la solution de normes internes suivante : 50 oL de corticostérone (1 mg/mL en MeOH), 50 l 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) (1 mg/mL en chloroforme HPLC), 25 'L d'ampicilline (1 mg/mL d'eau UH) et 50L de D-Sorbitol-1-13C (1 mg/mL dans l'eau DE qualité UHPLC).</li>
		<li>Transférer le tampon d'extraction dans une bouteille en verre propre et pré-refroidir la solution à -20 oC, 1 h avant utilisation. Utilisez une solution fraîchement préparée pour les extractions. Cette solution peut être stockée à 4 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à 2 semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampon d'extraction 2
	<ol>
<li>Dans un flacon volumétrique de 100 ml, ajouter 75 ml d'eau de qualité UHPLC et 25 ml de grade UhPLC MeOH et homogénéiser.</li>
		<li>Transférer le tampon d'extraction dans une bouteille en verre propre. Utilisez une solution fraîche pour les extractions. Cette solution peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs semaines.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Extraction de chlorophylle, lipides et métabolites
<ol><li>Disposer les tubes, avec la pastille cellulaire (contenant 10-15 x 106 cellules), dans de l'azote liquide.</li>
	<li>Resuspendre la pastille cellulaire dans chaque tube avec 1 ml de tampon d'extraction pré-réfrigéré (-20 oC) extraction 1. REMARQUE : Effectuez cette étape rapidement pour éviter l'évaporation du tampon d'extraction à faible viscosité. Après l'ajout du tampon d'extraction 1, maintenez les tubes à température ambiante.</li>
	<li>Vortex jusqu'à ce que les cellules soient bien homogénéisées dans le mélange d'extraction et aliquot le mélange dans 2 ml tube de microcentrifuge.</li>
	<li>Sonicate les cultures en utilisant le bain de sonication (voir Tableau des matériaux) dans l'eau refroidie à la glace pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber tous les échantillons sur un shaker orbital à 1000 tr/min pendant 60 min à 4 oC.</li>
	<li>Pour induire la séparation de phase, ajoutez 650 l de tampon d'extraction 2.</li>
	<li>Vortex brièvement suivi par centrifugation à 20000 x g pendant 5 min à 4 oC. REMARQUE: Après cette étape, il ya une séparation des phases liquides et une pastille solide dans le fond du tube. Manipulez les tubes avec soin pour éviter le mélange des deux phases liquides. La phase MTBE supérieure contient des lipides et de la chlorophylle, tandis que la phase inférieure contient les métabolites polaires et semi-polaires. La pastille précipitée au fond contient des protéines, de l'amidon et d'autres molécules insolubles.</li>
</ol>6. Aliquoting les fractions
<ol><li>Transférer 500 l de phase MTBE supérieure (lipides) dans un tube étiqueté de 1,5 ml. Séchez les échantillons à l'aide d'un concentrateur à vide (voir Tableau des matériaux)et entreposez-les à -80 oC jusqu'à mesure.</li>
	<li>Retirez le reste de la phase MTBE à l'aide d'une pipette de 200 l.</li>
	<li>Transférer 650 l de la phase inférieure (métabolites polaires et semi-polaires) dans un nouveau tube étiqueté. Séchez les échantillons à l'aide d'un concentrateur à vide (voir Tableau des matériaux)et entreposez-les à -80 oC jusqu'à mesure.</li>
	<li>Retirez la phase inférieure restante en canalisant le volume excédentaire.</li>
	<li>Congeler la granule solide dans l'azote liquide et les conserver à -80 oC jusqu'à ce qu'on les extraction plus loin.</li>
</ol>7. Détermination des métabolites polaires (métabolites primaires)
<ol><li>Resuspendre la granule séchée de la phase polaire (étape 6.3) dans la solution méthoxyamine-hydrochlorure/pyridine pour la méthoxymisation des groupes de carbonyles.</li>
	<li>Chauffer les échantillons à 37 oC pendant 90 min.</li>
	<li>Dérivatiser les échantillons avec N-méthyl-N-trimethyllyltrifloracetamide (MSTFA) pendant 30 min à 37 oC comme décrit précédemment13.</li>
	<li>Utilisez la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse au moment du vol (GC-TOF-MS) pour analyser les métabolites primaires. Les paramètres de gradient utilisés étaient selon le protocole14décrit précédemment.</li>
</ol>8. Détermination des métabolites non polaires (Lipides)
<ol><li>Suspendre à nouveau les granulés séchés de la phase non polaire (étape 6.1) dans un mélange d'acétonitrile:isopropanol (7:3, v:v).</li>
	<li>Centrifugeuse à 20000 x g et séparée sur une colonne C8 de phase inverse (100 mm-2,1 mm 1,7 m de particules), à l'aide d'un système UPLC (voir Tableau des matériaux). Les deux phases mobiles étaient l'eau avec 1% 1 M d'acétate d'ammonium, 0,1% d'acide acétique (Buffer A), et l'acétonitrile:isopropanol (7:3) contenant 1% 1 M d'acétate d'ammonium, 0,1% d'acide acétique (Buffer B).</li>
	<li>Utilisez les paramètres de gradient selon le protocole14décrit précédemment .</li>
</ol>9. Détermination de la teneur en chlorophylle
<ol><li>Mélanger 100 l de la phase MTBE (étape 6.1) avec 900 'L de 90% de méthanol pour une méthode vierge ainsi que les échantillons expérimentaux.</li>
	<li>Mesurer l'absorption à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 665 nm et 652 nm pour distinguer la chlorophylle a et la chlorophylle b. REMARQUE : L'absorption doit varier entre 0,1 et 1 pour le calcul valide de la concentration. Diluer les échantillons, si nécessaire.</li>
	<li>Calculer la teneur en chlorophylle a et b, ainsi que la teneur totale en chlorophylle selon les formules suivantes. Chla 16.82A665 - 9.28A652 Chlb 36,92A652 - 16,54A665 Chla-b 0,28A665 et 27,64A652 REMARQUE: Les formules ont été décrites par Bar-Nun et Ohad15.</li>
</ol>10. Extraction et détermination de la teneur en protéines, digestion et analyse
REMARQUE : Pour resuspendre la protéine, le tampon d'urée/thiourea de granule (6 M d'urée, 2 M de protéase de thioureaand et d'inhibiteurs de phosphatase) a été employé avec des modifications dans le protocole précédemment décrit16. Cependant, n'importe quel tampon de choix peut être utilisé pour la suspension des protéines.
<ol><li>Préparer le tampon protéique en utilisant les concentrations suivantes : 6 M d'urée et 2 M de thiourea.</li>
	<li>Dissoudre la pastille (étape 6.5) dans 200 l de tampon de protéines (10,1).</li>
	<li>Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 min, suivi de centrifugation à 20000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Transférer le supernatant, qui contient les protéines, dans un nouveau tube.</li>
	<li>Déterminer la concentration en protéines par Bradford assay17.</li>
	<li>Digdiper 50 g de protéines en solution avec un protocole de choix. Ici, utilisez le protocole suivant.<ol>
<li>Réduire 50 g d'échantillons de protéines à l'aide de 5 mD DTT pendant 30 min, suivi d'une alkylation à l'aide de 10 mM d'iodoacétamide pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.</li>
		<li>Ajouter le mélange Trypsin/Lys-C à un rapport protéines:protéase de 25:1 (w/w), mélanger et incuber pendant 3 h à 37 oC.</li>
		<li>Diluer les échantillons en six plis à l'aide de 50 mM TrisHCl (pH 8) et incuber pendant la nuit à 37 oC.</li>
		<li>Terminer la digestion en ajoutant de l'acide trifluroacétique (AFO) à une concentration finale de 0,5 à 1 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après la digestion, effectuer le dessalement des peptides avant la spectrométrie de masse en utilisant C18 pointes d'étape et d'élituer les peptides digérés18.</li>
	<li>Concentrez les échantillons à proximité de la sécheresse, en laissant 2-5 L de solution dans un concentrateur sous vide (voir Tableau des matériaux) sans chauffage.</li>
	<li>Resuspendre les échantillons dans le tampon de chargement (5% d'acétonitrile, 0,5% d'acide thermique) et analyser les mélanges de peptides par LC-MS/MS à l'aide d'un spectromètre de masse à haute résolution (voir Tableau des matériaux)relié à un système nano-UPLC.</li>
	<li>Séparer les peptides à l'aide du système UPLC (voir Tableau des matériaux) sur une colonne hybride de surface chargée de 20 cm en phase inverse (CSH) (voir Tableau des matériaux)avec un diamètre intérieur de 75 m et une taille de particule de 1,7 m.</li>
	<li>Chargez 4 ll d'échantillon et traversez un gradient de 90 min à un débit de 300 nL/min.</li>
	<li>Définir le gradient. Utilisez des paramètres partiellement de boucle hors ligne avec gradient isocratique fixé à 3% de tampon B (99,9% acetonitrile - 0,1% d'acide formique) maintenu pendant 14 minutes avant que la boucle est déplacée à la position en ligne avec la colonne, par la suite le gradient est augmenté linéairement pour 50 min, jusqu'à 20% tampon B est atteint.</li>
	<li>Dans les 15 minutes suivantes, augmenter la concentration de tampon B à 30%. Ensuite, dans les 15 minutes suivantes, augmenter le tampon B à 40 %, avant d'atteindre 90 % du tampon B après 4 min. Effectuer l'étape de lavage, qui est nécessaire pour nettoyer la colonne, à 400 nL/min et tenir pendant 10 min supplémentaires (voir le tableau 1 pour le gradient détaillé conditions de vie).</li>
	<li>Enfin, reculez le système à un débit de 300 nL/min et à une concentration de 3 % de tampon B en 1 min. Équilibrez la colonne pendant 15 min avant l'injection du prochain échantillon. REMARQUE : Une liste complète des protéines identifiées après l'analyse du SCML/SM est présentée dans le tableau 2.</li>
</ol>11. Extraction et détermination de la teneur en amidon
REMARQUE : Pour déterminer la teneur totale en protéines et en amidon, la pastille solide a été extraite dans une procédure en deux étapes comme décrit précédemment10.
<ol><li>Ajouter 500 l'éthanol de 80 % (v/v) à la pastille cellulaire (étape 6,5) et couver pendant 10 min à 80 oC.</li>
	<li>Centrifugeuse à 4000 x g pendant 10 min à température ambiante. Dissoudre ensuite la pastille dans 250 l d'eau stérile suivie de l'ajout de 250 l d'acétate de sodium de 100 mM.</li>
	<li>Hydrolyser l'amidon en chauffant pendant 3 h à 99 oC. Digdifier l'amidon dissous en monomères de glucose pendant la nuit en ajoutant un mélange d'enzymes de l'amylase (4,2 unités par échantillon) et de l'amyloglucosidase (10 unités par échantillon). Incuber les tubes à 37 oC pendant la nuit. REMARQUE : Après l'incubation, les échantillons peuvent être congelés à -20 oC pendant quelques jours, ou à -80 oC pendant plusieurs mois, avant les mesures du glucose.</li>
	<li>Centrifuger l'extrait digéré à 20000 x g pendant 5 min et recueillir le supernatant. Dissoudre le supernatant (avec les monomères de glucose dérivés de l'amidon) dans 100 mM de HEPES-buffer (pH 7) qui contient 5 mM MgCl2, 60 mg/mL ATP, 36 mg/mL NADP et glucose-6-phosphate-dehydrogénase (1 unité par échantillon).</li>
	<li>Afin d'analyser la teneur en amidon, d'abord mesurer l'absorption de base à 340 nm. Ajouter ensuite l'hexokinase (1 unité par échantillon) pour commencer la réaction. Enfin, mesurez l'augmentation de NADPH-H (indiquant le niveau d'amidon digéré au glucose) à 340 nm avec un lecteur de plaque de 96 puits. REMARQUE : La différence de la valeur maximale à 340 nm (ne doit pas dépasser la plage linéaire de 1) et la ligne de base est équivalente à la concentration en glucose de l'amidon digéré. Une courbe de glucose devrait être faite pour déterminer la concentration de glucose dans le nmol du glucose par mL.</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+high-resolution+mass+spectrometry+for+fatty+acid+profiling.">Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling.</a> The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAX1,+a+novel+membrane+protein+mediating+plastid+fatty+acid+export.">FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.</a> PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).</li><li>Hemme, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+analysis+of+acclimation+responses+to+long-term+heat+stress+and+recovery+in+the+photosynthetic+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).</li><li>Sharma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS+analysis+of+Chlamydomonas+reinhardtii+and+Scenedesmus+obliquus+lipid+extracts+and+their+possible+metabolic+roles.">UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles.</a> Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).</li><li>Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human,+chimpanzee,+macaque,+and+mouse+tissues.">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li><li>Khrameeva, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neanderthal+ancestry+drives+evolution+of+lipid+catabolism+in+contemporary+Europeans.">Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans.</a> Nature Communications. 5, 3584 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness.">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).</li><li>Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationales+and+approaches+for+studying+metabolism+in+eukaryotic+microalgae.">Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae.</a> Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).</li><li>Allwood, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+reproducibility+of+fast+gas+chromatography-electron+impact-time+of+flight+mass+spectrometry+(GC-EI-TOF/MS)+based+plant+metabolomics.">Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics.</a> Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li></ol>

Les auteurs n'ont pas de divulgations.

Dans cet article, nous avons illustré un protocole d'extraction robuste et fortement applicable pour l'analyse complète de lipidomics, de metabolomics, d'amidon et de protéomique d'une boulette simple de 10-15 x 106 cellules. La méthode a été mise en œuvre avec succès dans plusieurs études pour un large éventail de cellules et de tissus10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Ici, nous avons présenté un pipeline stepwise pour l'analyse multi-omics de différentes biomolécules à partir d'un seul échantillon récolté à partir de Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt) culture.
Le protocole fournit une approche robuste et reproductible pour traiter plusieurs échantillons à la fois, pour l'analyse de diverses biomolécules. Cependant, un certain nombre d'étapes critiques devraient être prises en charge afin de minimiser la variation technique. Tout d'abord, la récolte des cellules doit être effectuée aussi rapidement que possible tout en maintenant les conditions uniformes pour tous les échantillons récoltés afin de préserver l'état biologique des cellules. Bien que nous ayons utilisé la centrifugation pour récolter les cellules, d'autres stratégies de récolte peuvent être utilisées pour la récolte des échantillons. Cependant, il est important de noter que différentes stratégies de récolte sont connues pour influencer l'état métabolique des cellules37, par conséquent, l'approche cohérente de récolte doit être utilisée pour tous les échantillons expérimentaux. Deuxièmement, il est important d'éviter le séchage de la phase supérieure non polaire contenant de la chlorophylle, car cela peut influencer les niveaux de chlorophylle dissous dans le solvant affectant le facteur de normalisation des échantillons. Enfin, il faut prendre soin d'enlever la phase polaire restante pour obtenir la protéine et l'amidon, afin d'éviter de déranger le granule qui peut influencer la teneur en amidon et en protéines.
Ainsi présenté le protocole d'extraction offre plusieurs avantages pour l'analyse de données multi-omics. En plus de minimiser le nombre d'aliquots d'échantillon requis, il réduit également la variation entre les résultats analytiques obtenus pour différentes biomolécules. Cela permet de comparer directement les résultats obtenus à partir des métabolites primaires, lipides et données protéomiques. De même, l'extraction simultanée de classes composées multiples permet une stratégie de normalisation cohérente et uniforme des différents ensembles de données. Ceci est particulièrement applicable si la normalisation est difficile à réaliser en utilisant le poids sec ou frais38 ou le numéro de cellule.
Le protocole peut être mis en œuvre pour le dépistage systématique d'un échantillon biologique complexe. Ces ensembles de données métabolomiques, lipidomiques et protéomiques holistiques peuvent offrir des informations complètes sur les changements systématiques dans le métabolisme. En outre, les données obtenues à partir de l'analyse protéomique, fournit un aperçu des changements quantitatifs (abondance) et qualitatives (modifications) dans les protéines par rapport aux métabolites. Par conséquent, l'intégration des données omics pourrait révéler des informations approfondies sur les changements induits par les perturbations génétiques ou biotiques et/ou abiotiques d'un système biologique. Ainsi, élucider les changements moléculaires de voies métaboliques spécifiques ou des processus cellulaires. De même, ces données à haut débit peuvent permettre l'identification de cibles pour l'ingénierie métabolique et affiner ou tester les prédictions des modèles métaboliques à l'échelle du génome37,39.

Les microalgues sont une riche source de produits naturels (p. ex. carburants, nutrition humaine et animale, cosmétiques et substances pharmacologiques). De nombreux efforts de recherche sont réalisés pour améliorer l'efficacité de la production de produits de grande valeur à partir de microalgues1,2,3,4. La compréhension du métabolisme au niveau des systèmes est une condition préalable pour améliorer la qualité et le rendement des produits naturels5,6,7. Avec l'avènement des techniques génomiques fonctionnelles et des méthodes améliorées de spectrométrie de masse, des milliers de gènes, transcriptions, protéines et métabolites peuvent être surveillés simultanément. Cependant, plusieurs échantillons sont nécessaires pour les études approfondies de protéomique, de lipidomique et de métabolomique, qui est souvent difficile à réaliser dans les organismes unicellulaires, particulièrement si des études de cours de temps doivent être exécutées. En outre, la collecte et le traitement de différents échantillons d'aliquots en combinaison avec différents protocoles pour recueillir les données omics très complexes (c.-à-d. protéomique, lipidomique et métabolomic) introduit la variabilité, ce qui rend l'intégration des données un tâche difficile.
Chlamydomonas fournit non seulement un excellent système microbien pour l'étude des processus cellulaires, mais aussi un modèle pratique pour étudier la coordination du cycle cellulaire et le métabolisme. En conséquence, une forte coordination de l'expression des transcriptions avec le cycle cellulaire a été démontrée à l'aide du profilage transcriptome à haute résolution de la culture synchronisée de Chlamydomonas8. Environ 80% des transcriptions analysées ont montré la périodicité robuste au-dessus d'un cycle cellulaire8de 24 h. De même, le poids sec, les protéines, la chlorophylle, les acides aminés et les acides gras de deux souches différentes de Chlamydomonas ont été montrés pour corrélé avec la division cellulaire dans une étude où l'échantillonnage a été effectué tous les 4 h9. Récemment, il a été signalé que le métabolite et la dynamique lipidique du décalage cellulaire basé sur des phases spécifiques du cycle cellulaire10. Les changements subtils dans différentes biomolécules ont été possibles pour surveiller à l'aide d'un solide éther de méthyle-butyl (MTBE): méthanol: méthode d'extraction à base d'eau, qui offre un point de départ idéal pour une analyse multi-omique complète10 , 11.
Le protocole présenté guide à travers une stratégie reproductible et efficace10, pour l'extraction simultanée de lipides, métabolites, protéines et amidon à partir d'un seul échantillon aliquot, pour le temps résolu étude métabolomique et lipidomique de cultures de Chlamydomonas en croissance synchrone. En plus d'illustrer les données métaboliques et lipidomiques robustes et reproductibles10, ici, la qualité des échantillons protéomiques obtenus à partir de la même pastille est également démontrée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td>Internal standard for metabolites, ISOTEC&#174; Stable Isotopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27840-500MG</td>
			<td>Internal standard for metabolites, HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5072</td>
			<td>Enzymatic digestion of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for sample extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenter system</td>
			<td>Glasbl&#228;serei M&#252;ller, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>custom made fermenter of 800ml capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 &#956;m and a particle size of 1.7 &#956;m</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186007477</td>
			<td>Analysis of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td>standard preset sonication power at 45kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td>particle (cells) volume and number analyser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii

Les microalgues ont fait l'objet de recherches pour leurs applications dans la production de composés, d'aliments et de carburant de grande valeur. En outre, ils sont de précieux modèles photosynthétiques facilitant la compréhension des processus cellulaires de base. Les études à l'échelle du système permettent une compréhension complète et approfondie des fonctions moléculaires des organismes. Cependant, plusieurs échantillons et protocoles indépendants sont nécessaires pour les études de protéomique, lipidomique et métabolomique introduisant une erreur et une variabilité plus élevées. Une méthode robuste d'extraction à haut débit pour l'extraction simultanée de chlorophylle, lipides, métabolites, protéines et amidon à partir d'un seul échantillon de l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii est présentée ici. La configuration expérimentale illustrée est pour les cultures Chlamydomonas synchronisées en utilisant 12 h/12 h de lumière/des conditions sombres. Des échantillons ont été prélevés sur un cycle cellulaire de 24 h pour démontrer que les métabolites, les lipides et les données sur l'amidon obtenus à l'aide de diverses plates-formes analytiques sont bien conformes. En outre, des échantillons de protéines prélevés à l'aide du même protocole d'extraction ont été utilisés pour effectuer une analyse protéomique détaillée afin d'évaluer leur qualité et leur reproductibilité. D'après les données, on peut en déduire que la méthode illustrée offre une approche robuste et reproductible pour faire progresser la compréhension de diverses voies biochimiques et de leurs fonctions avec une plus grande confiance pour la recherche fondamentale et appliquée.

Chlamydomonas reinhardtii Synchronisation de la culture CC-1690 Pour démontrer les résultats représentatifs pour le protocole donné, nous présentons l'exemple de données multi-omics obtenues après la récolte et l'extraction d'échantillons à partir de Chlamydomonas reinhardtii cultures synchronisées10. Les cultures synchronisées de Chlamydomonas comprennent des cellules appartenant à une phase de croissance uniforme à un moment précis. Les cultures de Chlamydomonas ont été synchronisées à 12 h/12 h cycle de lumière/obscurité, 34 oC avec l'intensité lumineuse de 200 'mol'm -2-1 et la concentration de CO2 de2%, v/v, décrite comme concentration optimale pour la souche CC-1690 mt'10 . Ces conditions avaient déjà été optimisées et validées à l'aide de divers paramètres du cycle cellulaire10. La figure 1 affiche la distribution de la taille des cellules mesurée avec Coulter Counter à des moments distincts des cultures synchronisées. Un changement dans le volume cellulaire peut être observé que les cellules se développent en taille tout au long de la phase de lumière, suivie par la libération de cellules filles à partir de la fin de la phase de lumière à partir de 10 h. Une fois que toutes les cellules filles sont libérées, le déplacement du volume cellulaire peut être observé au fur et à mesure que les cellules filles nouvellement libérées sont éliminées pour commencer le prochain cycle 10 (figure 1).
Récolte d'échantillons, -manipulation et -extraction La récolte rapide des échantillons est effectuée à l'aide de centrifugation et après avoir jeté le supernatant, les granulés peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à l'extraction. Comme décrit ci-dessus (étape 5), l'extraction de MTBE se traduit par trois phases distinctes : a) la phase organique a été utilisée pour mesurer les lipides ainsi que les niveaux de chlorophylle (facteur de normalisation), b) la phase polaire a été recueillie pour mesurer les métabolites sur le GCMS tandis que, c) la pastille a été utilisée pour mesurer la teneur en amidon et les protéines. Un aperçu de la répartition des différentes phases et de leur emploi est illustré à la figure 2.
Métabolites polaires et non polaires Basé sur l'analyse de GCMS de la fraction polaire, 65 métabolites ont été annotés, couvrant les acides aminés, les acides nucléiques, les intermédiaires de glycolyse, la gluconeogenesis, le cycle tricarboxylique d'acide, la voie de phosphate de pentose et les polyamines (figure 3A). L'analyse LCMS de la phase neutre contenant des lipides a conduit à l'identification de 204 espèces lipidiques distinctes couvrant diverses classes lipidiques, à savoir phosphatidylglycerols, phosphatidylethanolamine, sulfoquinovosyl diacylglycerols, monogalactosyldiacylglycerols, digalactosyldiacylglycerols, diacylglyceryltrimethylhomoserine, acides gras, diacylglycérides et triacylglycérides. Pour visualiser les changements globaux dans les métabolites et les lipides à travers le cycle cellulaire, l'analyse des composants principaux (PCA) a été utilisée. Le PCA affiche une séparation des phases de lumière et de noir pour les données métabolomiques et lipidomiques. De plus, un semi-cyclique (cercle partiellement ouvert) peut être remarqué pour les deux données (Figure 3C, D). L'écart partiel dans le modèle circulaire est attribué au fait que les échantillons à 24 h du cycle cellulaire ont été prélevés dans l'obscurité, contrairement aux échantillons prélevés au début du cycle cellulaire après 0,25 h d'exposition à la lumière (figure3C ,D).
Analyse des protéines et de l'amidon Pour examiner la qualité de la granule protéique obtenue à la suite de l'extraction de MTBE, 6 échantillons ont été utilisés pour l'analyse protéomique. La qualité des données protéomiques obtenues en digérant 50 g de protéines/échantillons, a été examinée à l'aide d'un outil de contrôle de la qualité computationnelle -Proteomics quality control (PTXQC)19, indiquant la reproductible et la haute qualité des données protéomiques obtenues à partir de toutes les répliques (Figure supplémentaire 1). La couverture fonctionnelle moléculaire des protéines a été examinée à l'aide de REVIGO20. Un aperçu de l'enrichissement fonctionnel des 2463 protéines identifiées (voir le tableau 2), est présenté à la figure 4A. Le reste de la pastille après extraction de protéines a été utilisé pour la quantification reproductible de l'amidon, comme l'indique une faible déviation type entre diverses répliques (figure 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig1.jpg"> Figure 1 : Exemple illustré des changements dans le volume cellulaire à travers différentes phases du cycle cellulaire dans Chlamydomonas reinhardtii. L'axe x représentant le volume de la cellule tandis que l'axe y représentant le nombre de cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig2.jpg"> Figure 2 : Flux de travail illustré pour l'emploi de différentes phases pendant les granulés de cellules d'extraction multi-omiques. La figure a été réutilisée par Juppner, J.et coll. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig3.jpg"> Figure 3 : Exemple représentatif de métabolites et de lipides identifiés à l'aide du protocole décrit. (A) Classes de métabolites identifiées par l'analyse GCMS. (B) Espèces lipidiques appartenant à différentes classes identifiées par l'analyse LCMS. (C) Analyse des composants principaux des niveaux de métabolite à travers le cycle cellulaire de 24 h. (D) Analyse des composants principaux des lipides à travers le cycle cellulaire de 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig4.jpg"> Figure 4 : Exemple représentatif des données sur les protéines et l'amidon. A) L'enrichissement fonctionnel moléculaire des protéines identifiées à l'aide de l'analyse LCMS, carte des arbres tirée à l'aide de données représentatives reVIGO 20 B) sur l'amidon affichant la reproductibilité du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 1 : Conception personnalisée du système de fermenteur pour la température et l'aération contrôlée sa croissance synchrone des cultures chlamydomonas. La figure a été réutilisée par Juppner, J.et coll. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S1.eps">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Résultat représentatif pour la qualité des données protéomiques. Heatmap tracé à l'aide de l'outil de calcul PTXQC19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S2.eps">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temps (min)</td>
			<td>% Tampon B à Tampon A</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0 à 15 min</td>
			<td>Gradient linéaire de 0 à 3%</td>
			<td>Tampon A : 0,1 % d'acide formique dans l'eau de qualité UPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 à 75 min</td>
			<td>Gradient linéaire de 3 % à 30 %</td>
			<td>Tampon B : 0,1 % d'acide formique dans 60 % d'acétonitrile de qualité UPLC</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 à 90 min</td>
			<td>Gradient linéaire de 30% à 40%</td>
			<td>Taux de débit 300 nL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>90 à 94 min</td>
			<td>Gradient linéaire de 40% à 90%</td>
			<td>Volume d'injection 4 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 à 104 min</td>
			<td>colonne de lavage avec 90%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>105 à 120 min</td>
			<td>Équilibrez la colonne pendant 15 min à 3%</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : chromatographie liquide d'échantillons de peptides, paramètres de gradient.
Tableau 2 : Liste des protéines identifiées après l'analyse du SCML/SM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/Table_2.xlsx">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Une méthode d'extraction multi-omics pour l'analyse approfondie des cultures synchronisées de l'alga verte Chlamydomonas reinhardtii

L'analyse à l'échelle du système de plusieurs biomolécules est cruciale pour obtenir des informations fonctionnelles et mécanistes sur les processus biologiques. Par la présente, un protocole étendu est décrit pour l'extraction à haut débit des lipides, des métabolites, des protéines et de l'amidon à partir d'un seul échantillon récolté à partir de la culture synchronisée de Chlamydomonas.

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Les études à l’échelle des systèmes sont cruciales pour la compréhension approfondie des fonctions biologiques. Cependant, plusieurs échantillons indépendants sont nécessaires pour différentes plates-formes d’omique, introduisant une grande variabilité des données. Cette méthode offre une stratégie robuste et à haut débit pour l’extraction simultanée de chlorophylle, lipides, métabolites, protéines et amidon à partir d’un seul échantillon de l’algue verte modèle, Chlamydomonas reinhardtii.Pour l’extraction de chlorophylle, lipide et métabolite, disposer les tubes des granulés de cellules chlamydomonas récoltés dans de l’azote liquide. Resuspendez la pastille dans chaque tube avec un millilitre de tampon d’extraction de 20 degrés. Pour éviter l’évaporation du tampon d’extraction de faible viscosité, vortexez rapidement les tubes jusqu’à ce que les cellules soient bien homogénéisées dans le mélange d’extraction et aliquot la solution en tubes de microcentrifugeuse de deux millilitres.Sonicate les cultures dans un bain de sonication dans l’eau glacée pendant 10 minutes avant l’incubation sur un shaker orbital à 1000 rotations par minute pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 650 microlitres de tampon d’extraction deux et vortex brièvement les échantillons avant la centrifugation. Pour aliquot les fractions, transférer 500 microlitres de la phase lipidique mtbe supérieure dans un tube étiqueté 1,5 millilitre.Utilisez une pipette de 200 microlitres pour éliminer la phase lipidique et transférer 650 microlitres de la phase de métabolite polaire et semipolaire inférieure dans de nouveaux tubes étiquetés. Aspirer l’excès de volume pour enlever la phase inférieure restante et congeler les granulés solides dans de l’azote liquide pour un stockage de 80 degrés. Pour la détermination des métabolites polaires, résusquez la pastille séchée de la phase polaire dans la solution de pyridine hydrochlorure de méthoxyamine pour la méthoxymisation des groupes carbonyles et chauffez les échantillons à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes.À la fin de l’incubation, dérivation des échantillons avec du n-méthyl-n-trifluoracetamide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius selon les protocoles standard. Utilisez la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse de l’heure de vol pour analyser les métabolites primaires. Pour la détermination des métabolites non polaires, resuspendez la pastille séchée de la phase non polaire dans un mélange de sept à trois volumes à l’acétyltrile de volume à l’isopropanol et sédimenter les granulés par centrifugation.Séparez ensuite les échantillons sur une colonne de phase C8 inversée sur un système de chromatographie liquide ultraperformance. Pour la détermination de la teneur en chlorophylle, mélanger 100 microlitres de la phase MTBE avec 900 microlitres de 90% de méthanol pour la méthode vierge ainsi que les échantillons expérimentaux. Mesurez ensuite l’absorption sur un spectrophotomètre à des longueurs d’onde de 655 et 652 nanomètres pour distinguer la chlorophylle a et la chlorophylle b et calculer la teneur en chlorophylle a et b et la teneur totale en chlorophylle.Pour l’extraction des protéines, dissoudre la pastille de phase inférieure dans 200 microlitres de tampon protéique et incuber l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, centrifuger l’échantillon et transférer le supernatant contenant des protéines dans un nouveau tube. Mesurer la concentration en protéines à l’aide de l’analyse bradford.Pour digérer la protéine, réduire 15 microgrammes de l’échantillon en dithiothreitol millimolaire pendant 30 minutes, suivi de l’alkylation avec 10 millimolar iodoacetamide pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’alkylation, mélanger la solution Trypsin/Lys-C à un rapport protéine/protéase de 25 pour une et incuber l’échantillon pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Diluer l’échantillon six fois en 50 millimolaires tris Hcl pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain matin, terminer la digestion avec de l’acide trifluoroacétique à une concentration finale de 0,5 à 1% Après la digestion, concentrer les échantillons à la quasi-sécheresse, laissant deux à cinq microlitres de solution dans un concentrateur sous vide sans chauffage. Resuspendez l’échantillon dans le tampon de chargement. Analyser les mélanges de peptides par spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide à l’aide d’un spectromètre de masse haute résolution relié à un système de chromatographie liquide nano-pression.Pour séparer les peptides, chargez quatre microlitres d’échantillon sur une colonne hybride de surface chargée de phase inverse de 20 centimètres avec un diamètre intérieur de 75 micromètres et une taille de particule de 1,7 micromètre. Utilisez des paramètres hors ligne partiels de boucle avec un gradient isocratique réglé à 3% du tampon B, maintenu pendant 14 minutes avant que la boucle ne soit déplacée vers la position en ligne avec la colonne, après quoi le gradient sera augmenté linéairement pendant 50 minutes jusqu’à ce que 20% tampon B soit atteint. Un changement dans le volume cellulaire peut être observé à mesure que les cellules se développent en taille tout au long de la phase de lumière, suivie par la libération des cellules fille à partir de la fin de la phase de lumière à partir de 10 heures.Une fois que toutes les cellules de fille ont été libérées, un décalage dans le volume de cellules peut être observé, pendant que les cellules de fille nouvellement libérées sont disposées pour commencer le prochain cycle. Basé sur l’analyse de spectrométrie de masse de chromatographie de gaz de la fraction polaire, dans cette expérience représentative, 65 métabolites ont été annotés. L’analyse de la spectrométrie de masse chromatographie liquide de la phase neutre contenant des lipides a mené à l’identification de 204 espèces distinctes de lipides couvrant diverses classes de lipides.L’analyse des composants principaux peut être utilisée pour visualiser les changements mondiaux dans les métabolites et les lipides à travers le cycle cellulaire avec une séparation des phases de lumière et d’obscurité ainsi que des phases semi-cycliques observées pour les données métabolomiques et lipidomiques. Ici, un aperçu de l’enrichissement fonctionnel de 2 463 protéines enrichies identifiées est montré. Le reste de la pastille après extraction des protéines peut être utilisé pour la quantification reproductible de l’amidon, comme l’indique le faible écart type entre les différentes répliques.Il est important d’éviter le séchage de la phase organique supérieure de chlorophylle, car cela peut influencer les niveaux de chlorophylle dans le solvant, affectant le facteur de normalisation pour les échantillons. Diverses procédures analytiques peuvent être mises en œuvre pour la caractérisation biochimique des espèces moléculaires extraites.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Application de la tache verte de méthyle DNA-spécifique dans le Marquage fluorescent d&#39;embryons

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Recherche

Biologie du développement

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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