Name: a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2019-08-08T12:30:00
Duration: 7 min 51 s
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<span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">私たちは、優れた技術支援を受けてくださったグドラン・ウォルターとアーン・ミカニスに心から感謝しています。私たちは、彼らの助けのためにジャヴァリスコラボのすべてのメンバーに感謝したいと思います。私たちは、L Aジラルディのフェローシップのための研究とFAPESPに資金を提供するためのマックスプランク協会に感謝しています

1.クラミドモナス・ラインハルティのプレカルチャー
<ol><li>CHlamydomonasラインハルティ(株野生型CC-1690 mt+)の前培養物を、TAP培地の固体プレートからHSM培地12の200mLでエルレンマイヤーフラスコに移すことによって調製する。</li>
	<li>細胞密度が~2 x 106細胞/mLになるまで、100μmoles·m-2·s-1連続光で24°Cで回転シェーカー上の前培養物を成長させる。</li>
</ol>2. 発酵槽におけるクラミドモナス液培養物の同期
注:温度、光、CO2などのこのプロトコルで提示されるパラメータは、歪みCC-1690 mt+の同期に固有です。別の株を用いて同期培養を開発するためには、最適な条件を試験する必要がある。
<ol><li>プレカルチャーを発酵システムに移す(カスタムメイドの発酵槽設計の補足図1を参照)、温度を維持するために再循環クーラーに接続し、濾過されたCO2(2%、v/v)のバブリングで撹拌し、一定の撹拌を伴う発酵槽の底部の磁気攪拌バー。</li>
	<li>同期を開始するには、12:12 hの明暗系で発酵槽を34°Cおよび200 μmoles·m-2·s-1光の下で設定し、1 x 106細胞/mLの細胞密度を持つHSM培地に500 mLの培養物が含まれていることを確認します。</li>
	<li>24時間サイクルの終わりに、最初に明確な量の培養物をポンプで送り出すことを可能にする管システムを使用して、最小限の摂動で新鮮なHSM培地で1 x 106細胞/mLに培養物を再希釈するオートクレーブ殺菌媒体。 注:蠕動ポンプの代替として、注射器を接種して培養を撤回し、新鮮な培地の必要量を無菌条件下で発酵槽に直接添加することができます。</li>
	<li>ステップ 2.3 を 3 回繰り返し、接種の 4日目に同期されたカルチャを取得します。</li>
	<li>細胞の同期を検証するために、2時間ごとにサンプルを収穫し、セルカウンタとサイズアナライザを使用して細胞密度と細胞量を測定します(材料の表を参照)。細胞密度に応じて、サンプルを1:10~1:100の間に希釈し、30~1900 μm3のサイズ範囲で測定します。</li>
</ol>3. クラミドモナス細胞の収穫
<ol><li>15 mLの円錐遠心管にラベルを付け、液体窒素で満たされた脱ワーを準備する。</li>
	<li>発酵槽の内ガラス管を通して注射器(50cm3)を用いてサンプルを収穫する。10-15 x 106細胞を含むべき円錐遠心管にサンプルを分配する。各チューブに転送される体積に注意し、セルカウンタとサイズアナライザを使用して各タイムポイントのセル密度とセルサイズを測定します(「材料の表」を参照)。</li>
	<li>4000 x gで5分間遠心分離によって細胞をペレットする。その後、上清を廃棄し、液体窒素中のペレットを凍結し、後で-80°Cで保存します。</li>
</ol>4. 抽出バッファーおよびクロロフィル、脂質および代謝産物の抽出
注意:メタノール(MeOH)とMTBEは可燃性であり、長時間の暴露および/または接触に対して気道、眼または皮膚の刺激を引き起こす可能性があります。ヒュームフードのみで慎重に取り扱い、抽出時(ラボコート、安全メガネ、手袋など)に適切な安全手順を使用してください。
<ol><li>
抽出バッファ 1
	<ol>
<li>100 mLの容積フラスコで、MTBEの75 mL、MeOH(UHPLC等級)の25 mLを加え、均質化する(3:1、vol/vol)。</li>
		<li>次の内部標準溶液を追加: コルチコステロンの 50 μL (MeOH では 1 mg/mL), 50 μL 1,2-ジヘプタデカノイル-SN-グリセロ-3-ホスホコリン (17:0 PC) (クロロホルム HPLC グレードで 1 mg/mL), アンピシリンの 25 μL (1 mg/mL)D-ソルビトール-1-13C (水 UHPLC グレードで 1 mg/mL).</li>
		<li>抽出バッファーを清潔なガラスボトルに移し、使用前に-20°C、1時間で溶液を事前に冷却します。抽出には、新たに作成したソリューションを使用します。この溶液は、最大2週間4°Cで保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抽出バッファ 2
	<ol>
<li>100 mLの容積フラスコで、75 mLの水UHPLCグレードとMeOH UHPLCグレードの25 mLを加え、均質化します。</li>
		<li>抽出バッファをクリーンなガラスボトルに移します。抽出には新鮮なソリューションを使用します。この溶液は、数週間室温で保存することができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. クロロフィル、脂質、代謝物の抽出
<ol><li>チューブを、細胞ペレット(10-15 x 106細胞を含む)で、液体窒素中に配置します。</li>
	<li>各チューブ内の細胞ペレットを1mLの予冷(-20°C)抽出バッファー1で再ステーペンする。 注: 粘度の低い抽出バッファーの蒸発を避けるために、この手順をすばやく実行します。抽出バッファ1を追加した後、チューブを室温で維持します。</li>
	<li>細胞が抽出混合物内で均質化されるまで渦を2mLマイクロ遠心管にアリコートする。</li>
	<li>氷冷水で10分間超音波処理浴(材料の表を参照)を使用して培養物を超音波処理します。</li>
	<li>4°Cで60分間、1000rpmで軌道シェーカー上のすべてのサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>位相分離を誘導するには、抽出バッファー 2 の 650 μL を追加します。</li>
	<li>渦は、4°Cで5分間20000 x gで遠心分離を短時間続けた。 注:このステップの後、チューブの底部に液体相と固体ペレットの分離があります。2つの液体相の混合を避けるために注意して管を扱う。トップMTBE相は脂質とクロロフィルを含み、下相には極性および半極性代謝産物が含まれています。底部の沈殿ペレットには、タンパク質、デンプンおよび他の不溶性分子が含まれています。</li>
</ol>6. 分数のアリコート
<ol><li>上部MTBE相(脂質)の500 μLを標識された1.5 mLチューブに移します。真空濃縮器(材料の表を参照)を使用してサンプルを乾燥させ、測定するまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>200 μL ピペットを使用して残りの MTBE 位相を取り外します。</li>
	<li>下相(極性および半極性代謝産物)の650 μLを新しい標識チューブに移します。真空濃縮器(材料の表を参照)を使用してサンプルを乾燥させ、測定するまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>余分なボリュームをピペッティングして、残りの下のフェーズを削除します。</li>
	<li>液体窒素中の固体ペレットを凍結し、さらに抽出するまで-80°Cで保存します。</li>
</ol>7. 極性代謝産物の決定(原発性代謝産物)
<ol><li>カルボニル基のメトキシ核化のためのメトキシアミン塩酸塩/ピリジン溶液中の極性相(ステップ6.3)の乾燥ペレットを再中断する。</li>
	<li>サンプルを37°Cで90分間加熱します。</li>
	<li>前述の13に記載されているように、N-メチル-N-トリメチルシリルトリフロラセタミド(MSTFA)を30分間30分間30分間誘導体化する。</li>
	<li>一次代謝物を分析するために、飛行時間質量分析(GC-TOF-MS)に結合されたガスクロマトグラフィーを使用します。使用されるグラデーションパラメータは、前述のプロトコル14に従った。</li>
</ol>8. 非極性代謝物の決定(脂質)
<ol><li>非極性相(ステップ6.1)の乾燥ペレットをアセトニトリル:イソプロパノール(7:3,v)の混合物で再停止する。</li>
	<li>20000 x gの遠心分離機で、逆相C8カラム(100mm×2.1 mm×1.7μmの粒子)で分離し、UPLCシステムを使用します(材料の表を参照)。2つの移動相は、1%1M酢酸アンモニウム、0.1%酢酸(緩衝A)、アセトニトリル:イソプロパノール(7:3)を含む水1%1M酢酸アンモニウム、0.1%酢酸(緩衝B)を含む水であった。</li>
	<li>前述のプロトコル14に従ってグラデーション パラメータを使用します。</li>
</ol>9. クロロフィル含有量の判定
<ol><li>MTBE相(ステップ6.1)の100 μLと900 μLの900 μLを混ぜ合わせて、実験サンプルと同様にブランクの方法を使用します。</li>
	<li>665 nmおよび652 nmの波長の分光光度計を用いて吸光度を測定し、クロロフィルaとクロロフィルbを区別する。 注: 吸収は、有効な濃度計算のために 0.1 ~ 1 の範囲である必要があります。必要に応じてサンプルを希釈します。</li>
	<li>クロロフィルa及びb含有量、及び以下の式に従ってクロロフィル含有量の合計も算出する。 Chla = 16.82A665 – 9.28A652 Chlb = 36.92A652 – 16.54A665 Chla=b = 0.28A665 + 27.64A652 注:数式は、バーナンとオハド15によって記述されました.</li>
</ol>10. タンパク質含有量の抽出と決定、消化および分析
注:タンパク質を再中断するために、ペレット尿素/チオレアバッファー(6M尿素、2Mチオレアおよびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤)は、前述のプロトコル16における修飾と共に使用された。しかし、任意の任意のバッファーは、タンパク質の再懸濁に使用することができます。
<ol><li>以下の濃度を用いてタンパク質バッファーを調出す:尿素の6Mおよびチウレアの2M。</li>
	<li>タンパク質バッファー(10.1)の200 μLでペレット(ステップ6.5)を溶解します。</li>
	<li>サンプルを室温で30分間インキュベートし、続いて20000 x gで5分間遠心分離を行います。</li>
	<li>タンパク質を含む上清を新しいチューブに移します。</li>
	<li>ブラッドフォードアッセイ17によるタンパク質濃度の決定。</li>
	<li>選択したプロトコルで50 μgのタンパク質インソリューションを消化します。ここでは、次のプロトコルを使用します。<ol>
<li>5mM DTTを使用して50 μgのタンパク質サンプルを30分間削減し、暗闇の中で室温で10mMのヨードアセタミドを使用して30分間アルキル化します。</li>
		<li>トリプシン/Lys-Cミックスを25:1タンパク質で添加:プロテアーゼ比(w/w)、37°Cで3時間混合してインキュベートします。</li>
		<li>50 mM TrisHCl(pH8)を使用してサンプルを6回希釈し、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>0.5-1%の最終濃度にトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて消化を終了します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>消化後、C18段階の先端を用いて質量分析の前にペプチドの脱塩を行い、消化されたペプチド18を溶出させる。</li>
	<li>サンプルをほぼ乾燥に濃縮し、2~5 μLの溶液を真空濃縮器(材料の表を参照)に残します。</li>
	<li>ローディングバッファー(5%アセトニトリル、0.5%ギ酸)のサンプルを再中断し、ナノUPLCシステムに接続された高分解能質量分析計(材料の表を参照)を使用してLC-MS/MSによるペプチド混合物を分析します。</li>
	<li>内径75μm、粒径1.7μmの20cmの逆相荷電面ハイブリッド(CSH)カラム(材料の表を参照)にUPLCシステム(材料の表を参照)を使用してペプチドを分離します。</li>
	<li>サンプルの4 μLをロードし、300 nL/分の流量で90分の勾配を通して実行します。</li>
	<li>グラデーションを設定します。ループがカラムとのオンライン位置にシフトされる前に14分間保持されるバッファーB(99.9%アセトニトリル+0.1%ギ酸)の3%にアイソクラティックグラデーションを設定した部分的なループオフライン設定を使用し、その後、グラデーションが20%まで直線的に増加します。バッファ B に達します。</li>
	<li>次の15分以内に、バッファーBの濃度を30%に増加させる。次の15分で、バッファBを40%に増やし、さらに4分後にバッファBの90%に達する前に、400 nL/分でカラムをきれいにするために必要な洗浄ステップを実行し、さらに10分間保持します(詳細な勾配については表1を参照)。条件)。</li>
	<li>最後に、システムを 300 nL/min の流量に戻し、1 分以内に 3% バッファー B の濃度を設定し、次のサンプルが注入される前にカラムを 15 分間平衡化します。 注: LCMS/MS 分析後に同定されたタンパク質の完全なリストを表 2に示します。</li>
</ol>11. デンプン含有量の抽出と決定
注:全タンパク質およびデンプン含有量の決定のために、固体ペレットは、前述の10として2段階の手順で抽出した。
<ol><li>細胞ペレット(ステップ6.5)に80%(v/v)エタノールの500 μLを加え、80°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>室温で10分間4000 x gで遠心分離機。次いで、無菌水の250μLでペレットを溶解し、続いて100mM酢酸ナトリウムの250 μLを添加する。</li>
	<li>99°Cで3時間加熱してデンプンを加水分解する。溶解したデンプンを一晩グルコースモノマーに消化し、α-アミラーゼ(サンプル当たり4.2単位)とα-アミログルコシダーゼ(サンプル当たり10単位)の酵素ミックスを加えて、グルコースモノマーに消化する。チューブを一晩37°Cでインキュベートします。 注:インキュベーション後、サンプルは-20°Cで数日間、または-80°Cで数ヶ月間、グルコース測定の前に凍結することができます。</li>
	<li>消化エキスを20000 x gで5分間遠心分離し、上清を回収する。5 mM MgCl 2、60 mg/mL ATP、36 mg/mL NADP およびグルコース-6-リン酸脱水素酵素(サンプルあたり1単位)を含むHEPESバッファー(pH7)の100mMに上清(デンプン由来グルコースモノマーを用いて)を溶解する。</li>
	<li>デンプン含有量を分析するために、まず340nmでベースライン吸光度を測定します。次いで、ヘキソキネゼ(サンプル1個につき1単位)を加えて反応を開始する。最後に、96ウェルプレートリーダーで340nmでNADPH+H+(ブドウ糖に消化されたデンプンのレベルを示す)の増加を測定する。 注:340nmでの最大値の差(1の線形範囲を超えてはならない)とベースラインは、消化デンプンのグルコース濃度に相当します。グルコース曲線は、mL当たりのブドウ糖のnmol中のグルコース濃度を決定するために行われるべきである。</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+high-resolution+mass+spectrometry+for+fatty+acid+profiling.">Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling.</a> The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAX1,+a+novel+membrane+protein+mediating+plastid+fatty+acid+export.">FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.</a> PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).</li><li>Hemme, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+analysis+of+acclimation+responses+to+long-term+heat+stress+and+recovery+in+the+photosynthetic+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).</li><li>Sharma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS+analysis+of+Chlamydomonas+reinhardtii+and+Scenedesmus+obliquus+lipid+extracts+and+their+possible+metabolic+roles.">UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles.</a> Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).</li><li>Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human,+chimpanzee,+macaque,+and+mouse+tissues.">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li><li>Khrameeva, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neanderthal+ancestry+drives+evolution+of+lipid+catabolism+in+contemporary+Europeans.">Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans.</a> Nature Communications. 5, 3584 (2014).</li><li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness.">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).</li><li>Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationales+and+approaches+for+studying+metabolism+in+eukaryotic+microalgae.">Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae.</a> Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).</li><li>Allwood, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+reproducibility+of+fast+gas+chromatography-electron+impact-time+of+flight+mass+spectrometry+(GC-EI-TOF/MS)+based+plant+metabolomics.">Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics.</a> Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).</li><li>Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+biochemical+networks+in+microorganisms.">Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).</li></ol>

著者は開示を持っていません。

この記事では、10-15 x 106細胞の単一ペレットからの包括的な脂肪学、メタボロミクス、デンプンおよびプロテオミクス分析のための堅牢で非常に適用可能な抽出プロトコルを示した。この方法は、細胞および組織の広い範囲のためのいくつかの研究で正常に実施されている10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 、35、36。ここでは、クラミドモナス・ラインハルティ(CC-1690 mt+)培養物から採取した単一サンプルから異なる生体分子のマルチオミクス解析のための段階的なパイプラインを提示した。
このプロトコルは、様々な生体分子の分析のために、複数のサンプルを一度に処理する堅牢で再現性の高いアプローチを提供します。ただし、技術的なバリエーションを最小限に抑えるために、多くの重要な手順を考慮する必要があります。第一に、細胞の生物学的状態を維持するために、すべての採取されたサンプルの均一な条件を維持しながら、細胞の収穫を可能な限り迅速に行う必要があります。遠心分離を使用して細胞を収穫しましたが、代替の収穫戦略を用いてサンプルの収穫を行うことができます。しかしながら、異なる収穫戦略が細胞37の代謝状態に影響を与ることが知られていることに注意することが重要であり、したがって、一貫した収穫アプローチは、すべての実験サンプルに使用されなければならない。第二に、クロロフィルを含む上部非極性相の乾燥を避けることは重要であり、これはサンプルの正規化因子に影響を与える溶媒中の溶解クロロフィルのレベルに影響を与えることができるので。最後に、残りの極相を除去しながら、タンパク質およびデンプンペレットを得る間、デンプンおよびタンパク質含有量に影響を与えることができるペレットを乱すことを避ける必要があります。
それによって提示された抽出プロトコルは、複数のオミクスデータ分析のためのいくつかの利点を提供する。必要なサンプルアリコートの数を最小限に抑えるだけでなく、異なる生体分子に対して得られる分析結果間の変動も減少します。これにより、一次代謝産物、脂質およびプロテオミックデータから得られた結果を直接比較することができます。同様に、複数の複合クラスを同時に抽出することで、異なるデータセットの一貫した統一正規化戦略を可能にします。これは、乾燥または新鮮な重量38またはセル数を使用して正規化が達成することが困難な場合に特に適用されます。
プロトコルは、複雑な生物学的サンプルの定期的なスクリーニングのために実装することができる。これらの全体的なメタボロミック、リピドミックおよびプロテオミクスデータセットは、代謝の系統的変化に関する包括的な情報を提供することができます。さらに、プロテオミクス分析から得られたデータは、代謝産物に関連するタンパク質の定量的(豊富)および定性的(修飾)変化に関する洞察を提供する。したがって、オミクスデータを統合することで、生物学的システムの遺伝的または生物学的および/または非生物的摂動によって引き起こされる変化に関する詳細な情報が明らかになる可能性があります。したがって、特定の代謝経路または細胞過程の分子変化を解明する。同様に、これらのハイスループットデータは、代謝工学の標的を同定し、ゲノムスケールの代謝モデル37、39からの予測を絞り込んだりテストしたりすることを可能にする。

微細藻類は、天然物(例えば、燃料、ヒトおよび動物の栄養、化粧品および薬理学的物質)の豊富な供給源である。微細藻類1、2、3、4からの高価な製品の生産の効率を高めるために多数の研究が行われている。新陳代謝のシステムレベルの理解は、天然物の品質と収量を向上させるための前提条件である 5,6,7.機能的ゲノム技術の出現と改良された質量分析法により、何千もの遺伝子、転写産物、タンパク質、代謝産物を同時に監視することができます。しかし、詳細なプロテオミクス、リピドミクス、メタボロミクス研究には複数のサンプルが必要であり、特に時間コース研究を行う場合は、単細胞生物では達成が困難であることが多い。さらに、異なるサンプルアリコートの収集と処理を異なるプロトコルと組み合わせて、非常に複雑なオミクスデータ(すなわち、プロテオミック、リピドミック、メタボロミクス)を収集すると、変動性が生じ、データの統合が可能になります。挑戦的な仕事。
クラミドモナスは、細胞プロセスの研究のための優れた微生物システムを提供するだけでなく、細胞周期と代謝の調整を研究するための便利なモデルを提供します。従って、細胞周期との転写発現の強い協調は、クラミドモナス8の同期培養の高解像度トランスクリプトームプロファイリングを用いて示された。分析された転写物の約80%は、24時間の細胞周期8にわたって堅牢な周期性を示した。同様に、乾燥重量、タンパク質、クロロフィル、アミノ酸およびクラミドモナスの2つの異なる株の脂肪酸は、4時間9ごとにサンプリングを行った研究において細胞分裂と相関することが示された。最近、細胞周期10の特定の相に基づく細胞シフトの代謝産物および脂質ダイナミクスが報告された。異なる生体分子の微妙な変化は、堅牢なメチルテルト-ブチルエーテル(MTBE):メタノール:包括的なマルチオミクス分析のための理想的な出発点を提供する水ベースの抽出方法を使用して監視することが可能でした10,11.
提示されたプロトコルガイドは、単一のサンプルアリコートからの脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンの同時抽出のために、再生可能で効率的な戦略10を通して、時間解決されたメタボロミックおよび脂質学的研究を導く同期的に成長するクラミドモナス文化。堅牢で再現可能な代謝およびリピドミックデータ10を示すほか、ここでは、同じペレットから得られるプロテオミクス試料の品質も実証されている。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850360P</td>
			<td>Internal standard for lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td>Internal standard for metabolites, ISOTEC&#174; Stable Isotopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Internal standard for metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27840-500MG</td>
			<td>Internal standard for metabolites, HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13684102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl tert-butyl ether (MTBE)</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>13890602</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5072</td>
			<td>Enzymatic digestion of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve Chemicals</td>
			<td>23214102</td>
			<td>ULC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for sample extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius Corporation</td>
			<td>14 557 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenter system</td>
			<td>Glasbl&#228;serei M&#252;ller, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>custom made fermenter of 800ml capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model 5427R</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.7 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186002878</td>
			<td>Analysis of lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 &#956;m and a particle size of 1.7 &#956;m</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186007477</td>
			<td>Analysis of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm&#215;2.1 mm containing 1.8 &#956;m diameter particles)</td>
			<td>Waters, Machester, UK</td>
			<td>186003539</td>
			<td>Analysis of metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Eppendorf Thermomixer 5436</td>
			<td>2050-100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>USC 300 TH</td>
			<td>142-0084</td>
			<td>standard preset sonication power at 45kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC system</td>
			<td>Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td>
			<td>7.008.500.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Vortex-Genie 2, Model G560</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td>particle (cells) volume and number analyser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-omics extraction method for the in-depth analysis of synchronized cultures of the green alga chlamydomonas reinhardtii

微細藻類は、高価な化合物、食品、燃料の生産における彼らのアプリケーションのための研究の焦点となっています。さらに、それらは基本的な細胞プロセスの理解を促進する貴重な光合成モデルである。システム全体の研究は、生物の分子機能の包括的かつ詳細な理解を可能にします。しかし、プロテオミクス、リピドミクス、メタボロミクス研究では、より高い誤差と変動性を導入するために、複数の独立したサンプルとプロトコルが必要です。緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの単一サンプルからクロロフィル、脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンを同時抽出するための堅牢な高スループット抽出方法をここに提示する。図示された実験セットアップは、12時間/12時間の光/暗い条件を使用して同期されたクラミドモナス培養用です。サンプルを24時間の細胞周期で収集し、様々な分析プラットフォームを使用して得られた代謝産物、脂質およびデンプンデータが十分に適合していることを実証した。さらに、同じ抽出プロトコルを用いて収集したタンパク質サンプルを用いて、その品質と再現性を評価するために詳細なプロテオミクス分析を行った。このデータに基づいて、図示された方法は、様々な生化学的経路とその機能の理解を進めるための堅牢で再現性の高いアプローチを提供し、基礎研究と応用研究の両方に対する自信を持って提供できると推測できる。

クラミドモナス・ラインハルティCC-1690 カルチャ同期 所定のプロトコルの代表的な結果を実証するために、同期クラミドモナス・ラインハルトティ培養10からサンプルを採取および抽出した後に得られたマルチオミクスデータの例を示す。クラミドモナスの同期培養は、特定の時点における均一な成長段階に属する細胞からなる。クラミドモナス培養物は、12 h/12h光/暗サイクル、34°C、光強度200μmol·m-2·s-1およびCO2濃度2%、v/v、株CC-1690 mt+ 10に最適な濃度として記載された同期した。.これらの条件は、以前に様々な細胞周期パラメータ10を使用して最適化および検証されていた。図 1は、同期カルチャの個別の時点でコールター カウンターで測定されたセル サイズ分布を表示します。細胞量の変化は、細胞が光相を通して大きくなるにつれて観察され、その後、10時間から光相の終わりから始まる娘細胞の放出が続く。すべての娘細胞が放出されると、新たに放出された娘細胞が次のサイクル10を開始するように処分されるにつれて、細胞体積のシフトが観察される(図1)。
サンプル収穫、-処理および-抽出 サンプルの迅速な収穫は遠心分離を使用して行われ、上清を廃棄した後、ペレットは抽出まで-80°Cで保存することができる。上述したように(ステップ5)、MTBE抽出結果は3つの異なる相で、a)有機相を用いて脂質およびクロロフィルレベル(正常化因子)を測定し、b)極相を収集しGCMS上の代謝産物を測定し、c)ペレットを使用した。デンプン含有量とタンパク質を測定します。さまざまなフェーズの分布とその雇用の概要を図 2に示します。
極性および非極性代謝物 極分率のGCMS分析に基づいて、65の代謝産物にアノテートし、アミノ酸、核酸、糖分解の中間体、グルコネオジェネシス、トリカルボン酸サイクル、ペントースリン酸経路およびポリアミンをカバーした(図3A)。脂質を含む中性相のLCMS分析は、様々な脂質クラスすなわちホスファチジルグリセロール、ホスファチジルタノールアミン、スルホキノヴォシルジアシルグリセロールをカバーする204の異なる脂質種の同定につながった。モノガラクトシルジルグリセロール、ジガラクトシルジルチルグリセロール、ジアシルグリセリルトリエチルホモセリン、脂肪酸、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリド。細胞周期全体の代謝産物と脂質のグローバルシフトを可視化するために、主成分分析(PCA)が用いられた。PCAは、メタボロミクスとリピドミックデータの両方に光相と暗色相の分離を表示します。さらに、両方のデータに対して半周期(部分的に開いた円)が気づくことができる(図3C、D)。円形パターンの部分ギャップは、光への暴露の0.25時間後に細胞周期の初めに収集されたサンプルとは対照的に、細胞周期の24時間のサンプルが暗闇の下で収集されたという事実に起因する(図3C) ,D)
タンパク質とデンプンの分析 MTBE抽出の結果として得られたタンパク質ペレットの品質を調べるために、プロテオミクス分析に6つのサンプルを用いた。50μgタンパク質/サンプルを消化して得られたプロテオミクスデータの品質を、計算品質管理ツール-プロテオミクス品質管理ツール(PTXQC)19を用いて調べたところ、得られたプロテオミクスデータの再現性と高品質を示す。すべての反復 (補足図1)。タンパク質の分子機能カバレッジをREVIGO20を用いて調べた。2463の同定されたタンパク質の機能的濃縮の概要(表2参照)を図4Aに示す。タンパク質抽出後の残りのペレットは、各種反復中の低標準偏差によって示されるデンプンの再現可能な定量に用いた(図4B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig1.jpg"> 図1:クラミドモナス・ラインハルティにおける細胞周期の異なる段階にわたる細胞体積の変化の例示例。セル数を表す Y 軸ながらセルボリュームを表す X 軸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig2.jpg"> 図2:マルチオミクス抽出細胞ペレット中の異なる段階の雇用のための図示ワークフロー。フィギュアはジュップナー、J.らから再利用されています。10.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig3.jpg"> 図3:記載のプロトコルを用いて同定された代謝産物および脂質の代表的な例。(A) GCMS分析によって同定された代謝産物クラス。(B) LCMS分析によって同定された異なるクラスに属する脂質種。(C) 24h細胞周期にわたる代謝産物レベルの原理成分分析。(D)24時間細胞周期にわたる脂質の原理成分分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig4.jpg"> 図4:タンパク質およびデンプンデータの代表的な例。A)LCMS分析を用いて同定されたタンパク質の分子機能的濃縮、REVIGO 20B)を用いて描かれたツリーマップは、プロトコルの再現性を示す代表的なデンプンデータである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:クラミドモナス培養物の温度および通気制御制御の同期成長のための発酵システムのカスタマイズされた設計。フィギュアはジュップナー、J.らから再利用されています。10.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S1.eps">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:プロテオミクスデータ品質の代表的な結果。計算PTXQCツール19を使用してプロットされたヒートマップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S2.eps">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>時間 (分)</td>
			<td>% バッファー B からバッファ A</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0~15分</td>
			<td>0~ 3% の線形グラデーション</td>
			<td>バッファーA:UPLCグレード水中のギ酸0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>15~75分</td>
			<td>3% から 30% までの線形グラデーション</td>
			<td>バッファーB:60%UPLCグレードアセトニトリルで0.1%ギ酸</td>
		</tr>
<tr>
<td>75~90分</td>
			<td>線形グラデーションを 30% から 40% に</td>
			<td>流量 300 nL/分</td>
		</tr>
<tr>
<td>90~94分</td>
			<td>線形グラデーションを 40% から 90% に</td>
			<td>射出量 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>94~104分</td>
			<td>90%の洗浄カラム</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>105~120分</td>
			<td>3%で15分間カラムを平衡化</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ペプチド試料の液体クロマトグラフィー、勾配パラメータ。
表2:LCMS/MS解析後に同定されたタンパク質のリスト<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/Table_2.xlsx">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

複数の生体分子のシステム全体の分析は、生物学的プロセスに関する機能的および機械的な洞察を得るために重要です。本明細書により、同期クラミドモナス培養から採取された単一のサンプルから脂質、代謝産物、タンパク質およびデンプンの高スループット抽出について広範なプロトコルが記載されている。

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

システム全体の研究は、生物学的機能の詳細な理解のために重要です。ただし、異なるオミクス プラットフォームに複数の独立したサンプルが必要であり、データに大きくばらつきが生まれます。この方法は、クロロフィル、脂質、代謝産物、タンパク質、およびデンプンをモデルの緑色藻類、クラミドモナス・reinhardtiiの単一サンプルから同時に抽出するための堅牢で高スループットの戦略を提供します。クロロフィル、脂質、代謝産物抽出のために、採取したクラミドモナス細胞ペレットのチューブを液体窒素に配置する。20度抽出バッファー1の1ミリリットルで各チューブ内のペレットを再懸濁します。低粘度抽出バッファーの蒸発を避けるために、細胞が抽出混合物内で均質化されるまでチューブを素早くボルテックスし、溶液を 2 つのミリリットルマイクロ遠心分離管にアリコートします。氷冷水の超音波浴で培養物を10分間超音波処理してから、1分あたり1,000回転の軌道シェーカーで摂氏4度で60分間培養します。インキュベーションの終わりに、抽出バッファー2の650マイクロリットルを加え、遠心分離の前にサンプルを短時間渦に入れる。分画をアリコートするには、上のMTBE脂質相の500マイクロリットルを標識された1.5ミリリットルチューブに移す。200マイクロリットルピペットを使用して脂質相を除去し、低極性および半極代謝物相の650マイクロリットルを新しい標識チューブに移します。余分な体積を吸引し、残りの低相を除去し、固体ペレットを液体窒素中に凍結して80度保存する。極性代謝物の定量のために、カルボニル基のメトキシマイメーション用メトキシアミン塩酸塩ピリジン溶液中の極相の乾燥ペレットを再懸濁し、30°Cで試料を摂氏30度で90分間加熱する。インキュベーションの終了時に、標準プロトコルに従って37°Cで30分間、n-メチル-n-トリフルオレアセトアミドでサンプルを誘導体化します。一次代謝産物を分析するために、飛行時間の質量分析に結合されたガスクロマトグラフィーを使用してください。非極性代謝物の決定のために、非極相の乾燥ペレットを、アセトニトリルをイソプロパノールに容積し、遠心分離によってペレットを沈沈させる7〜3体積の混合物で再懸濁する。次に、超高性能液体クロマトグラフィーシステム上の逆相C8カラム上のサンプルを分離します。クロロフィル含量の測定のために、MTBE相の100マイクロリットルを900マイクロリットルの900マイクロリットルのメタノールと混合し、実験サンプルと同様にブランクの方法を作ります。次に、分光光度計の吸光度を655および652ナノメートルの波長で測定してクロロフィルaとクロロフィルbを区別し、クロロフィルaおよびb含有量と総クロロフィル含有量を計算します。タンパク質抽出のために、200マイクロリットルのタンパク質バッファーに低相ペレットを溶解し、室温で30分間サンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離し、タンパク質含有上清を新しいチューブに移す。ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。タンパク質を消化するには、5ミリモルジチオトライトール中のサンプル15マイクログラムを30分間減らし、続いてアルキル化を10ミリモルヨードアセトアミドを室温で30分間、光から保護する。アルキル化の終わりに、トリプシン/Lys-C溶液をプロテアーゼ比に対して25~1タンパク質で混合し、37°Cで3時間インキュベートします。サンプルを50ミリモルトリスHclで6倍に希釈し、摂氏37度で一晩インキュベーションします。翌朝、トリフルオロ酢酸で消化を0.5~1%の最終濃度に終了し、サンプルを乾燥に近い状態に濃縮し、加熱せずに真空濃縮器に2~5マイクロリットルの溶液を残します。読み込みバッファでサンプルを再中断します。ナノ超高圧液体クロマトグラフィーシステムに接続された高解像度質量分析計を用いて、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によりペプチド混合物を分析します。ペプチドを分離するには、4マイクロリットルのサンプルを20センチメートルの逆相荷電面ハイブリッドカラムに積み込み、内径は75マイクロメートル、粒子サイズは1.7マイクロメートルです。部分的ループオフライン設定を使用して、ループが列のオンライン位置にシフトされる前に14分間保持されるバッファBの3%に設定された部分ループオフライン設定を使用し、その後、20%バッファBに達するまで50分間線形に勾配が増加します。細胞体積の変化は、細胞が光相を通して大きくなるにつれて観察され、その後、10時間から光相の終わりから始まる娘細胞の放出が続く。すべての娘細胞が放出されると、新たに放出された娘細胞が次のサイクルを開始するために処分されるため、細胞体積の変化が観察される。極性分率のガスクロマトグラフィー質量分析に基づいて、本代表的実験において、65の代謝産物にアノメーションを行った。液体クロマトグラフィーの質量分析分析は、脂質含有中性相の分析により、様々な脂質クラスをカバーする204種の異なる脂質種の同定につながった。主成分分析は、メタボロミクスとリピドミコデータの両方に対して観察された半周期相と同様に、光と暗い相の分離を用いて、細胞周期全体の代謝産物および脂質のグローバルシフトを可視化するために使用することができる。ここで、2,463個の機能性富化の概要を示す富化タンパク質が示されている。タンパク質抽出後の残りのペレットは、様々な複製物の中で低い標準偏差によって示されるように、デンプンの再現性定量に使用することができる。これは、溶媒中のクロロフィルのレベルに影響を与え、サンプルの正規化係数に影響を与える可能性がありますので、上部クロロフィル有機相の乾燥を避けるために重要です。抽出した分子種の生化学的特徴付けのために、様々な分析手順を実施することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

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Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

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精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

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三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...