Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for DRs. Craig Duvall og Rebecca Cook for adgang til data og lab ressourcer til at gennemføre denne forskning. Forfatterne er taknemmelige for Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) for adgang til DLS og TEM (NSF EPS 1004083) instrumenter. Forfatterne er taknemmelige for National Science Foundation for at støtte Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). Forfatterne er taknemmelige for de nationale institutter for sundhed for økonomisk støtte (NIH R01 EB019409). Forfatterne er taknemmelige for Department of Defense Congressionally instrueret medicinsk forskning program for økonomisk støtte (DOD CDMRP OR130302).

1. udarbejdelse og karakterisering af si-NP'er
<ol><li>forberedelse af si-NP<ol>
<li>Polymer opløses i 10 mM citronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først opløses ved 10x koncentration i ethanol for at sikre opløsning. Bemærk: polymer kan opløses ved lavere koncentrationer, men anvendelse ved koncentrationer over 3,33 mg/mL kan forhindre homogen dannelse af NP.</li>
		<li>Tilsæt siRNA (50 μM i diH2O) til at resultere i N+:P- forhold på 10. Bland polymer-og siR...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

De her beskrevne si-NPs dannes ved elektrostatisk sammenslutning af anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyionkomplekser (polyplexer). Elektrostatisk kompleksning af siRNA og den kationiske DB-blok af PEG-DB-polymerer lettes ved at blande ved lav pH-værdi (4,0). Ved pH 4,0 er DMAEMA meget protoneret, og derfor er DB blokken meget opladet. Dette sikrer, at polymerer opløses som unimere i opløsning i modsætning til at danne miceller, og at DB komplekser effektivt med siRNA. Efterfølgende justeres opløsningens ...

Fordi sirnas hæmmer oversættelsen af proteiner fra mRNA-sekvenser, kan de teoretisk bruges til at stof alle kendte patologier1,2,3,4,5. Brugen af siRNA i medicin er imidlertid begrænset af den omfattende dårlige farmakokinetiske profil af siRNA-molekyler6,7. Når der injiceres intravenøst, ryddes sirnas hurtigt gennem nyrerne og/eller nedbrydes af nukleaser8,9. På grund af sin store størrelse og negative ladning kan siRNA ikke trænge ind i cellerne eller undslippe endolysosomal pathway for at få adgang til det RNA-inducerede lyddæmpnings kompleks (RISC), der findes i cytosol10,11,12, 13. det er Derfor har en omfattende indsats fokuseret på design og implementering af siRNA leveringsstrategier14. Denne indsats har i høj grad fokuseret på udvikling af lipid-og polymer-baserede nanopartikler, som pakke siRNA, beskytte det mod clearance og nedbrydning in vivo, og initiere cellulære optagelse og endosomal undslippe gennem ionizable, kationiske Amin grupper. Der er rapporteret om mange prækliniske succeser, og senest er den første kliniske succes blevet rapporteret for nanopartikel-baseret hepatisk siRNA-levering til behandling af arvelig transthyretin-medieret (hATTR) amyloidose15.
Der er mange kræftfremkaldende gener, der i øjeblikket er "ubeskadigede" af konventionelle farmakologi (dvs., små molekyle narkotika), motiverende design af polymere siRNA nanopartikler (si-NPs) til behandling af kræft16. Der er dog et separat sæt af design parametre, der skal overvejes for ikke-hepatisk siRNA levering. Leveringssystemet skal beskytte den kationiske ladning af Polyplex, som forårsager agglutinations i det systemiske kredsløb17,18,19. For tumor levering, specifikt, si-NP stabilitet er afgørende for udstyre lang cirkulation og dermed øget akkumulering inden tumorer via den forstærkede permeabilitet og retention (EPR) effekt20,21. Desuden, kontrol over si-NP størrelse er afgørende, da kun nanopartikler ca 20 – 200 Nm diameter i størrelse gearing EPR22, og mindre si-NPS (~ 20 – 50 nm diameter) udviser forbedret tumor penetration over større størrelse nanopartikler og mikropartikler23.
For at løse disse yderligere konstruktions begrænsninger for systemisk tumor levering af siRNA efter intravenøs administration er der udviklet neutrally-ladede, pH-Responsive si-NP'er (figur 1)24. Disse si-NPs er pegyleret, eller senest, Zwitterionated25, for neutral overflade opladning og resistens over for protein adsorption og opsonisation i omløb. Da de ikke kan stole udelukkende på kationisk karakter til at drive intracellulære levering, ekstremt effektiv endosomal flugt er bydende nødvendigt for at opnå potent genhæmning. Derfor består kernen af disse si-NP'er af en meget endosomolytisk kerne, som er inaktiv ved ekstracellulær pH (7,4), men som udløses på en switch-lignende måde i de syrnede forhold på endolysosomal pathway [pH 6,8 (tidlige endosomer) – 5,0 ( lysosomer)]. Endelig giver en blanding af kationisk og Hydrofobisk indhold i kernen af si-NPs både elektrostatiske og van der Waals stabiliserings kræfter, hvilket forbedrer stabiliteten af si-NP'er i blodet sammenlignet med blot kationiske systemer.
Integrationen af mange funktioner i et relativt simpelt design er muligt ved hjælp af reversible addition-fragmentering kæde Transfer (RAFT) kontrolleret polymerisering til at producere polymerer med kompleks arkitektur og præcis sammensætning. For at producere si-NPs med neutral overflade opladning, pH-reaktionsevne, og NP stabilitet, er TØMMERFLÅDE bruges til at syntetisere poly (ethylenglycol-b-[2-(dimethylamino) ethylmethacrylat-Co-butylmethacrylat]) (peg-DB; Figur 1a). Peg-DB er elektrostatisk kompleks bundet med siRNA, der danner si-NPS med en peg Corona og DB/siRNA kerne (figur 1b). PEG danner et inert, neutralt ladet hydrofile lag på si-NP Corona. DB blokken består af en 50:50 molær ratio på 2-(dimethylamino) ethylmethacrylat (DMAEMA) og butylmethacrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatiske komplekser negativt opladet siRNA. BMA Self-Associates inden for NP kerne af van der Waals interaktioner, øge NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA overgive pH-afhængige lipid bilayer-lytisk opførsel til DB polymer blokken. Ved ekstracellulær pH, er DB blokken sekvenestered til si-NP kerne og er inaktiv til lipid bilag. Under sure forhold, såsom dem inden for endolysosomal pathway, letter ionisérbare dmaema inden for DB blokken proton svamp effekt, hvor endosomal buffer fører til osmotisk hævelse og ruptur26. Derudover er hydrofobe BMA-fuser i DB-blokken aktivt integreret i og lysere lipid-bilag, hvilket resulterer i potent endosomolyse. Således er siRNA kompleks bundet med peg-dB til at danne si-NPS, der er neutralt-ladede og meget stabile ved ekstracellulær pH, men som forstyrrer lipid bilag ved sur pH, hvilket sikrer cytosoliske levering af siRNA nyttelast.
Heri beskrives de eksperimentelle procedurer til fremstilling af si-NP'er fra PEG-DB. Metoder til at karakterisere de fysisk-kemiske parametre og Bioaktivitet af si-NPs præsenteres og diskuteres. For hurtigt at kunne vurdere si-NP-Bioaktivitet anvendes luciferase som et model-gen til Knockdown undersøgelser. Firefly luciferase er det protein, der er ansvarlig for "glød" af ildfluer27. Derfor producerer pattedyrsceller, der er transficeret med Firefly luciferase-genet, en bioluminescerende ' glød ', der kan optages ved hjælp af et luminometer til kvantificering af niveauet af luciferase-ekspression. Her bruger vi luciferase til at vurdere Bioaktivitet af si-NPS ved at levere siRNA mod luciferase og kvantificere den tilsvarende reduktion i bioluminescens i luciferase-udtrykker celler sammenlignet med celler, der modtager en røræg siRNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Den succes siRNA som en målrettet Molekylær medicin er afhængig af sin effektive cytosoliske levering til celler i vævet af patologi. Der er opnået klinisk succes med behandling af tidligere ' ubeskadigede ' hepatiske sygdoms mål med siRNA. Men, effektiv tumor siRNA levering kræver yderligere farmakokinetiske design overvejelser, herunder lang cirkulation tid, unddragelse af clearance organer (f. eks, leveren og nyrerne), og tumor penetration og fastholdelse. Her beskriver vi forberedelsen og in vitro fysisk-kemiske/biologiske karakterisering af polymere nanopartikler designet til effektiv siRNA levering, især til ikke-hepatisk væv såsom tumorer. SiRNA nanopartiklerne fremstilles ved elektrostatisk komplexering af siRNA og diblok copolymer poly (ethylenglycol-b-[2-(dimethylamino) ethylmethacrylat-Co-butylmethacrylat]) (peg-dB) til dannelse af polyion-komplekser ( polyplexer), hvor siRNA er afsondret inden for Polyplex-kernen, og PEG danner en hydrofile, neutrally-ladet Corona. Desuden bliver DB blokken membran-lytisk som vesikler af endolysosomale pathway acidificering (< pH 6,8), udløser endosomal flugt og cytosoliske levering af siRNA. Metoder til at karakterisere de fysisk-kemiske egenskaber af siRNA nanopartikler såsom størrelse, overflade ladning, partikel morfologi, og siRNA lastning er beskrevet. Bioaktivitet af siRNA nanopartikler måles ved hjælp af luciferase som et model-gen i en hurtig og høj gennemløb genhæmnings analyse. Design, der passerer disse indledende tests (såsom PEG-DB-baserede polyplexer) anses for passende til oversættelse til prækliniske dyreforsøg, der vurderer leveringen af siRNA til tumorer eller andre steder af patologi.

Nogle væsentlige karakteristika ved effektive si-NP'er for in vivo siRNA-levering er den korrekte størrelse (~ 20 – 200 Nm-diameter), siRNA-emballering og genhæmnings Bioaktivitet. Selv om dette ikke er en udtømmende liste (som omtalt i diskussionen), bør disse grundlæggende egenskaber bekræftes, før man overvejer yderligere testning af en formulering.
Figur 2 illustrerer karakteriseringen...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Metoder til at forberede og karakterisere de fysisk-kemiske egenskaber og Bioaktivitet af neutrally-ladede, pH-Responsive siRNA nanopartikler præsenteres. Kriterier for vellykkede siRNA nanomediciner såsom størrelse, morfologi, overflade ladning, siRNA lastning, og genhæmning diskuteres.

Fremstilling af Neutrally-ladede, pH-Responsive polymere nanopartikler til Cytosolic siRNA-levering

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Den nuværende protokol er vigtig, fordi den giver forskerne mulighed for at producere siRNA-belastede nanopartikler og i tilstrækkelig grad karakterisere disse nanopartikler for at sikre, at de er i stand til at indgive dyr inden efterfølgende undersøgelser. Fordelen ved denne tilgang er at producere nanopartikler, der øger siRNA's biotilgængelighed, og at producere nanopartikler, der er neutralt ladede og dermed egnede til systemisk administration. Denne teknik er virkningsfuld, fordi siRNA nanopartikler kan anvendes til behandling af et utal af sygdomme, der nødvendiggør systemisk administration, herunder kræft, hjerte-kar-sygdom, og autoimmune sygdomme, blandt andre.Til at begynde, opløse polymer i ethanol i en koncentration på 33,3 mg pr. milliliter og rør for at sikre opløsning. Brug derefter en pipette til at overføre polymeropløsning i 10 millimolar citronsyre buffer for at nå en koncentration på 3,33 mg pr. milliliter. Tilsæt destilleret vand i et rør, der indeholder små forstyrrende RNA for at opnå en koncentration på 50 mikromolar.Bland polymeren og små forstyrrende RNA-opløsninger grundigt i et rør ved at pipettere op og ned for at opnå et nitrogen til fosfatforhold på 10. Rørret ved omgivelsestemperatur i 30 minutter. Derefter tilsættes en milliliter 10 millimolarphosphat buffer ved pH otte til røret for at opnå en koncentration på 0,28 mg pr. milliliter og bland forsigtigt enten ved pipettering eller invertering af røret.For at bekræfte, at den endelige pH-pH er neutral, omkring 7,2 til 7,5, pipettes 10 mikroliter af den lille forstyrrende RNA nanopartikler opløsning på pH-test strimler. Først forberede en dynamisk lys spredning prøve ved at filtrere en milliliter af små forstyrrende RNA nanopartikler ved koncentrationen af 0,28 mg pr. milliliter gennem 0,45-mikrometer pore størrelse sprøjte filtre i en firkantet kvarts eller polystyren cuvette. Derefter registreres størrelses- og overfladeopladningsmålinger ved hjælp af et dynamisk lyssprændeinstrument i henhold til fabrikantens specifikationer.For at bekræfte størrelsen og morfologien af små forstyrrende RNA-nanopartikler ved hjælp af transmissionselektrekroskopi skal der først tilføjes fem mikroliter filtreret lille forstyrrende RNA-nanopartikelopløsning ved 0,28 mg pr. milliliter til hvert TEM-gitter. Læg gitrene ved omgivelsestemperatur i 60 sekunder. Tør med filterpapir i tre sekunder.Dernæst tilsættes fem mikroliter af 3% uranylacetatopløsning til hvert gitter og inkuberes i 20 sekunder. Blot tør i tre sekunder. Derefter placeres gitrene i en ekssiccator for at tørre natten over, før der billeddannelse under transmissionselektroansmikroskopi.For at udføre agarose gel retardering, først tilføje to gram elektroforese-grade agarose pulver til 100 milliliter af 1X Tris-acetat-EDTA buffer på pH otte i et bægerglas til at producere 2% agarose gel. Rør rundt for at suspendere agarose. Anlægret, der er utildækket i en mikrobølgeovn, opvarmes i et til tre minutter, indtil al agarose er opløst.Når afkølet, tilsættes fem mikroliter ethidium bromid ved koncentrationen af 10 mg pr. milliliter i bægerglasset og blandes godt. Hæld derefter agarose i en gel bakke og sted kam til at producere brønde. Lad gelen tørre i 30 minutter.Fjern forsigtigt kammen for at efterlade læssebåse, og hæld 1X Tris-acetat-EDTA-buffer i gelbakken for at fylde til den maksimale påfyldningslinje. Derefter placeres to mikroliter aliquots af lastning farvestof uden SDS eller reducerende midler på paraffin film for hver lille forstyrrende RNA nanopartikel formulering på forskellige kvælstof til fosfat nøgletal. Pipette til at blande 10 mikroliter af små forstyrrende RNA nanopartikel opløsning med lastning farvestof på paraffin film.Tilsæt blandingen til agarose gel brønde. Tilslut elektroforesesystemet til en strømforsyning og kør spændingskilde ved 100 volt i 35 minutter, eller indtil prøverne har krydset 80% af gellængden. Overfør gelen fra bakken til en UV-transilluminator, og visualiser de små forstyrrende RNA-bånd på UV-transilluminatoren i henhold til producentens specifikationer.Det optimale kvælstof- til fosfatforhold bestemmes baseret på forsvinden af små forstyrrende RNA-bånd i bunden af gelen. At vælte model gen luciferase, første frø luciferase-udtryk celler i en 96-godt sort walled plade med DMEM i 10% FBS på en tæthed på 2, 000 celler per brønd. Anbring pladen i en inkubator natten over for at lade cellerne klæbe.Om morgenen fjerne medier og tilsæt 10 mikroliter pr brønd af små forstyrrende RNA nanopartikler fortyndet i fuld serum medier for en endelig lille forstyrrende RNA koncentration på 100 nanomolar. Returnering af brøndene til inkubatoren i 24 timer for at behandle cellerne med små forstyrrende RNA-nanopartikler. Den næste dag, erstatte medier med fuld serum medier, der indeholder 150 mikrogram pr milliliter D-luciferin.Inkuber cellerne ved stuetemperatur i fem minutter, før lysæscens måles på en pladelæser. Gentag derefter mediernes forfriskning to gange med friske fulde serummedier fri for D-luciferin, efterfulgt af inkubation i 24 timer. Medier, der indeholder 150 mg/milliliter D-luciferin, udskiftes med fuldt serummedie, der indeholder 150 mg/ml, og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter.Mål luminescensen på 48-timers tidspunkt. Til undersøgelser i længderetningen skal låget stå på toppen af brøndpladen uden for biosikkerhedsskabet for at vedligeholde celler under sterile forhold og fortsætte inkubationen efter udskiftning af luciferinholdige medier med friske fulde medier. Dynamiske lysspælemålinger viser, at små forstyrrende RNA-nanopartikel har en gennemsnitlig diameter på 35 nanometer.Tilstedeværelsen af en enkelt top med smal topbredde indikerer unimodal fordeling og lav polydispersitet. TEM-målinger bekræfter størrelsesmålingen fra dynamisk lysspælelse tyder på tilstedeværelsen af en ensartet population af små forstyrrende RNA-nanopartikler og afslørede den sfæriske morfologi af de små forstyrrende RNA-nanopartikler. For høj koncentration af polymer i forberedelsestrinnet resulterede i små forstyrrende RNA-nanopartikel to i uønsket diameter på over 200 nanometer, en multimodal og polydispersed population og aggregater i opløsning, der ikke udgør nogen særskilt partikelmorfologi.Begge små forstyrrende RNA-nanopartikler en og to displayneutral overfladeladning angivet med næsten nul gennemsnitlige zeta potentielle værdier. Agarose gel retarderingsanalyse viser forsvinden af små forstyrrende RNA-bånd i gelbunden, hvilket indikerer kompleksisering af små forstyrrende RNA til polymer. Polymerkomplekseret lille forstyrrende RNA er ude af stand til at migrere gennem gelen og visualiseres således øverst på gelen i nærheden af læsseningslyderne.Da forholdet mellem kvælstof og fosfat øges, øges små forstyrrende RNA-kompleksationer som indikeret ved nedsat intensitet af det lille forstyrrende RNA-bånd i gelbunden. Bioaktiv luciferase lille forstyrrende RNA nanopartikel en udstiller signifikant formindsket luciferase aktivitet i forhold til forvrænget kontrol. I modsætning hertil betragtes luciferase lille forstyrrende RNA nanopartikel to ikke som bioaktiv.For at producere konsistente siRNA-nanopartikler med ønskede fysisk-kemiske egenskaber bør man anvende polymeropløsninger med passende koncentrationer og validere pH-zonen for bufferopløsningerne på hvert trin i protokollen. Ved hjælp af disse metoder i vores forskning har vi været i stand til at producere siRNA nanopartikel-baserede behandlinger for tidligere undruggable kræftfremkaldende gener og teste effekten af disse behandlinger i prækliniske modeller af brystkræft.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmering stamceller til terapeutiske Angiogenesis Brug Bionedbrydelig Polymere Nanopartikler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fremstilling af polymere og biohybridfibre med foruddefineret størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonisk Nanopartikler for regenerativ Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porøst silicium mikropartikler til levering af siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymere mikronålarray Fabrication ved Fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Opdigte superhydrofobe Polymere materialer til biomedicinske anvendelser

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering af terapeutisk siRNA til CNS Brug kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...