Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

De auteurs zijn dankbaar drs. Craig Duvall en Rebecca Cook voor toegang tot gegevens en Lab middelen voor het uitvoeren van dit onderzoek. De auteurs zijn dankbaar voor de Vanderbilt Instituut voor Nanoscale Science and Engineering (VINSe) voor de toegang tot DISTRIBUTIELIJSTEN en TEM (NSF EPS 1004083) instrumenten. De auteurs zijn dankbaar voor de National Science Foundation voor de ondersteuning van de Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). De auteurs zijn dankbaar voor de nationale instituten van de gezondheid voor financiële steun (NIH R01 EB019409). De auteurs zijn dankbaar voor het ministerie van defensie conregressie gericht medisch onderzoekprogramma voor financiële ondersteuning (DOD CDMRP OR130302).

1. voorbereiding en karakterisering van Si-NPs
<ol><li>si-NP voorbereiding<ol>
<li>Los polymeer in 10 mM citroenzuur buffer (pH 4,0) op 3,33 mg/mL. Polymeer kan eerst worden opgelost op 10x concentratie in ethanol om de ontbinding te garanderen. Opmerking: polymeer kan worden opgelost bij lagere concentraties, maar het gebruik bij concentraties boven 3,33 mg/mL kan homogene NP-vorming voorkomen.</li>
		<li>Voeg siRNA (50 μM in diH2O) toe om te resulteren in N+:P- ratio van 10. Meng ...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

De si-NPs hier beschreven worden gevormd door elektrostatische vereniging van anionische siRNA en kationische polymeren in polyion complexen (polyplexes). Elektrostatische complexen van siRNA en het kationische DB blok van PEG-DB polymeren wordt vergemakkelijkt door het mengen bij lage pH (4,0). Bij pH 4,0, is DMAEMA hoogst geprotoneerd, en bijgevolg wordt het DB blok hoogst geladen. Dit zorgt ervoor dat de polymeren oplossen als unimers in oplossing in tegenstelling tot de vorming van micellen en dat DB complexen effici...

Omdat siRNAs de vertaling van eiwitten uit mRNA sequenties remt, kunnen ze theoretisch gebruikt worden voor alle bekende pathologieën1,2,3,4,5. Echter, het gebruik van siRNA in de geneeskunde wordt beperkt door de ruim slechte farmacokinetische profiel van siRNA moleculen6,7. Wanneer intraveneus geïnjecteerd, siRNAs worden snel gewist door de nieren en/of afgebroken door nucleasen8,9. Door zijn grote omvang en negatieve lading kan siRNA geen cellen binnengaan of ontsnappen aan de endolysosomal route om toegang te krijgen tot het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) dat zich bevindt in de cytosol10,11,12, 13. Zo heeft uitgebreide inspanning gericht op het ontwerp en de uitvoering van siRNA Delivery Strategies14. Deze inspanning heeft zich grotendeels gericht op de ontwikkeling van lipiden-en polymeer-gebaseerde nanodeeltjes die pakket siRNA, te beschermen tegen ontruiming en degradatie in vivo, en initiëren cellulaire opname en endosomale ontsnappen door ioniserende, kationische amine groepen. Veel pre-klinische successen zijn gemeld en meest recentelijk, de eerste klinische succes is gemeld voor nanodeeltjes op basis van lever siRNA levering aan erfelijke transthyretine-gemedieerde (hATTR) Amyloïdose15te behandelen.
Er zijn vele kanker-veroorzakende genen die momenteel "undruggable" door conventionele farmacologie (d.w.z., kleine molecule drugs) zijn, motiverend het ontwerp van polymere siRNA nanodeeltjes (si-NPs) om kanker16te behandelen. Er zijn echter een aparte set van design parameters die moeten worden overwogen voor niet-lever siRNA levering. Het leveringssysteem moet de kationische last van polyplex beschermen die samenstelling binnen de systemische omloop17,18,19veroorzaakt. Voor de levering van tumoren, in het bijzonder, si-NP stabiliteit is essentieel voor een lange circulatie te begiftigen en dus een verhoogde accumulatie binnen tumoren via de verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect20,21. Bovendien, controle over si-NP grootte is essentieel, aangezien alleen nanodeeltjes ongeveer 20-200 nm diameter in grootte hefboom EPR22, en kleinere si-NPs (~ 20-50 nm diameter) vertonen verbeterde tumor penetratie over grotere grootte nanodeeltjes en microparticles23.
Om deze extra ontwerp beperkingen aan te pakken voor systemische tumor levering van siRNA na intraveneuze toediening, neutraal geladen, pH-responsieve si-NPs zijn ontwikkeld (Figuur 1)24. Deze si-NPs zijn PEGylated, of recentst, Zwitterionated25, voor neutrale oppervlaktelast en weerstand tegen eiwit adsorptie en opsonization in omloop. Aangezien zij zich niet uitsluitend op kationische karakter kunnen baseren om intracellulaire levering te drijven, is de uiterst efficiënte endosomale vlucht noodzakelijk voor het bereiken van het krachtige gen silencing. Dienovereenkomstig, de kern van deze si-NPs is samengesteld uit een zeer endosomolytic kern die inert is op extracellulaire pH (7,4), maar die wordt geactiveerd in een switch-achtige wijze in de aangezuurde voorwaarden van de endolysosomal pathway [pH 6,8 (vroege endosomes) – 5,0 ( lysosomen)]. Ten slotte, een mengsel van kationische en hydrofobe inhoud binnen de kern van Si-NPs bieden zowel elektrostatische en van der Waals stabilisatie krachten, verbetering van de stabiliteit van de si-NPs in het bloed in vergelijking met louter kationische systemen.
De integratie van vele functies in een relatief eenvoudig ontwerp is mogelijk met behulp van omkeerbare toevoeging-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) gecontroleerde polymerisatie om polymeren te produceren met complexe architectuur en nauwkeurige samenstelling. Om si-NPs met neutrale oppervlaktelast, pH-ontvankelijkheid, en NP stabiliteit te produceren, wordt het vlot gebruikt om poly (ethyleenglycol-b-[2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat-co-butyl METHYLMETHACRYLAAT]) (peg-DB te synthetiseren; Figuur 1a). PEG-DB is elektrostatisch gecomplexeerd met siRNA, het vormen van Si-NPs met een PEG Corona en DB/siRNA core (Figuur 1b). PEG vormt een inerte, neutraal geladen hydrofiele laag op de si-NP Corona. Het DB blok bestaat uit een 50:50 Molar ratio van 2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat (DMAEMA) en butyl methylmethacrylaat (BMA). Kationische DMAEMA elektrostatisch complexen negatief-geladen siRNA. BMA Self-Associates binnen de NP core door van der Waals interacties, toenemende NP stabiliteit. Samen, DMAEMA en BMA geven pH-afhankelijke lipide bilayer-lytische gedrag aan de DB polymeer blok. Op extracellulaire pH, de DB blok is afgezonderd aan de si-NP kern en is inert voor lipide bilayers. Onder zure omstandigheden, zoals die binnen de endolysosomal pathway, ioniseer DMAEMA binnen de DB blok vergemakkelijkt de Proton spons effect, waar endosomale buffering leidt tot osmotische zwelling en scheuren26. Daarnaast hydrofobe BMA delen binnen de DB blok actief te integreren in en lyse lipide bilayers, wat resulteert in krachtige endosomolysis. Aldus, is siRNA complex met PEG-DB om si-NPs te vormen die neutraal-geladen en hoogst stabiel bij extracellulaire pH zijn maar die lipide bilayers bij zure pH verstoren, verzekerend cytosolische levering van de siRNA lading.
Hierin worden beschreven de experimentele procedures voor de productie van Si-NPs van PEG-DB. Methoden om de fysisch-chemische parameters en bioactiviteit van Si-NPs te karakteriseren worden gepresenteerd en besproken. Om snel te beoordelen si-NP bioactiviteit, Luciferase wordt gebruikt als een model gen voor knock-out studies. Firefly Luciferase is het eiwit dat verantwoordelijk is voor de ' Glow ' van vuurvliegjes27. Dienovereenkomstig, zoogdiercellen transfected met de Firefly Luciferase gen produceren een bioluminescent ' Glow ' die kunnen worden gevangen met behulp van een luminometer om het niveau van Luciferase expressie te kwantificeren. Hier gebruiken we Luciferase om de bioactiviteit van Si-NPs te beoordelen door het leveren van siRNA tegen Luciferase en het kwantificeren van de overeenkomstige reductie in bioluminescentie in Luciferase cellen vergeleken met cellen die een scrambled siRNA ontvangen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Het succes van siRNA als een gerichte moleculaire geneeskunde is afhankelijk van zijn efficiënte cytosolische levering aan cellen binnen het weefsel van pathologie. Klinisch succes voor de behandeling van eerder ' undruggable ' leverziekte doelen met siRNA is bereikt. Nochtans, vergt de efficiënte levering van de tumor siRNA extra farmacokinetische ontwerpoverwegingen, met inbegrip van lange omlooptijd, ontwijking van ontruimings organen (b.v., lever en nieren), en tumor penetratie en behoud. Hier beschrijven we de voorbereiding en in vitro fysisch-chemische/biologische karakterisering van polymere nanodeeltjes ontworpen voor een efficiënte siRNA levering, met name voor niet-lever weefsels zoals tumoren. De siRNA nanodeeltjes worden bereid door elektrostatische teint van siRNA en de diblok copolymeer poly (ethyleenglycol-b-[2-(Dimethylamino) ethyl methylmethacrylaat-co-butyl METHYLMETHACRYLAAT]) (peg-DB) om poly-complexen te vormen ( polyplexes) waar siRNA is afgezonderd binnen de polyplex kern en PEG vormt een hydrofiele, neutraal geladen Corona. Bovendien, de DB blok wordt membraan-lytische als blaasjes van de endolysosomal pathway breng (< pH 6,8), triggering endosomale ontsnappen en cytosolische levering van siRNA. De methodes om de fysisch-chemische kenmerken van siRNA nanodeeltjes zoals grootte, oppervlaktelast, deeltjes morfologie, en siRNA lading te kenmerken worden beschreven. Bioactiviteit van siRNA nanodeeltjes wordt gemeten met behulp van Luciferase als een model gen in een snelle en high-throughput gen silencing assay. Ontwerpen die deze eerste tests passeren (zoals PEG-DB-gebaseerde polyplexes) worden geschikt geacht voor de vertaling van preklinische dierstudies de beoordeling van de levering van siRNA aan tumoren of andere sites van pathologie.

Enkele essentiële kenmerken van effectieve si-NPs voor in vivo siRNA levering zijn de juiste grootte (~ 20-200 nm diameter), siRNA verpakking, en Gene silencing bioactiviteit. Hoewel dit niet een uitputtende lijst (zoals besproken in de discussie), moeten deze fundamentele kenmerken worden bevestigd voordat overweegt verder testen van een formulering.
Figuur 2 illustreert de karakterisering van Si-...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Methoden ter voorbereiding en karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen en bioactiviteit van neutraal geladen, pH-responsieve siRNA nanodeeltjes worden gepresenteerd. De criteria voor succesvolle siRNA nanomedicines zoals grootte, morfologie, oppervlaktelast, siRNA lading, en gen het silencing worden besproken.

Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Het huidige protocol is belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om siRNA geladen nanodeeltjes te produceren en deze nanodeeltjes adequaat te karakteriseren om hun geschiktheid voor toediening aan dieren voorafgaand aan latere studies te waarborgen. Het voordeel van deze aanpak is het produceren van nanodeeltjes die de biologische beschikbaarheid van siRNA verhogen en nanodeeltjes produceren die neutraal geladen zijn en dus geschikt zijn voor systemische toediening. Deze techniek is impactful omdat siRNA nanodeeltjes kunnen worden toegepast voor de behandeling van een groot aantal ziekten die systemische toediening, waaronder kanker, hart-en vaatziekten, en auto-immuunziekten, onder anderen.Los om te beginnen polymeer op in ethanol met een concentratie van 33,3 milligram per milliliter en roer om ontbinding te garanderen. Gebruik vervolgens een pipet om polymeeroplossing over te brengen in 10 millimolar citroenzuurbuffer om een concentratie van 3,33 milligram per milliliter te bereiken. Voeg gedestilleerd water toe in een buis met klein storend RNA om een concentratie van 50 micromolar te bereiken.Meng het polymeer en kleine storende RNA-oplossingen grondig in een buis door op en neer te pipetten om een stikstof-fosfaatverhouding van 10 te bereiken. Plaats de buis 30 minuten op omgevingstemperatuur. Voeg vervolgens een milliliter fosfaatbuffer van 10 millimolar bij pH acht aan de buis toe om een concentratie van 0,28 milligram per milliliter te bereiken en meng voorzichtig door de buis te pipetten of om te keren.Om te bevestigen dat de uiteindelijke pH neutraal is, rond 7,2 tot 7,5, pipette 10 microliters van de kleine storende RNA nanodeeltjes oplossing op de pH-teststrips. Bereid eerst een dynamisch lichtverstrooiingsmonster voor door een milliliter kleine storende RNA-nanodeeltjes te filteren met een concentratie van 0,28 milligram per milliliter tot 0,45 micrometer poriegroottespuitfilters in een vierkant kwarts of polystyreen cuvette. Noteert vervolgens maat- en oppervlakteladingmetingen met behulp van een dynamisch lichtverstrooiingsinstrument volgens de specificaties van de fabrikant.Om de grootte en morfologie van kleine storende RNA nanodeeltjes met behulp van transmissie elektronen microscopie eerst vijf microliters van gefilterde kleine storende RNA nanodeeltjes oplossing op 0,28 milligram per milliliter toe te voegen aan elk TEM-raster. Plaats de roosters gedurende 60 seconden op omgevingstemperatuur. Dep drie seconden droog met filterpapier.Voeg vervolgens vijf microliters van 3% uranylacetaatoplossing toe aan elk raster en broed gedurende 20 seconden in. Dep drie seconden droog. Plaats vervolgens de rasters in een desiccator om 's nachts te drogen voordat beeldvorming onder transmissie elektronenmicroscopie.Om agarose gel retardatie uit te voeren, voeg eerst twee gram elektroforese-grade agarose poeder aan 100 milliliter 1x Tris-paraceaat-EDTA buffer bij pH acht in een beker om 2%agarose gel te produceren. Roer om de agarose op te schorten. Plaats de beker onbedekt in een magnetron te verwarmen voor een tot drie minuten totdat alle agarose is opgelost.Eenmaal afgekoeld, voeg vijf microliter ethidium bromide bij de concentratie van 10 milligram per milliliter in het bekerglas en meng goed. Giet vervolgens de agarose in een gellade en plaats kam om putten te produceren. Laat de gel 30 minuten drogen.Verwijder voorzichtig de kam om laadputten achter te laten en giet 1X Tris-acetaat-EDTA buffer in de gellade om te vullen tot de maximale vullijn. Plaats vervolgens twee microliter aliquots van ladingskleurstof zonder SDS of het verminderen van agenten op paraffinefilm voor elke kleine storende RNA nanodeeltjesformulering bij verschillende stikstof-fosfaatverhoudingen. Pipette om 10 microliters van kleine storende RNA nanodeeltjesoplossing te mengen met het laden van kleurstof op paraffinefilm.Voeg het mengsel toe aan agarose gel putten. Sluit het elektroforesesysteem aan op een voeding en voer de spanningsbron gedurende 35 minuten op 100 volt of totdat monsters 80% van de gellengte hebben doorkruist. Breng de gel van de lade naar een UV-transilluminator en visualiseer de kleine storende RNA-banden op de UV-transilluminator volgens de specificaties van de fabrikant.Bepaal de optimale stikstof-fosfaatverhouding op basis van het verdwijnen van kleine storende RNA-banden aan de onderkant van de gel. Om modelgen luciferase neer te halen, eerste zaad luciferase-uitdrukkende cellen in een 96-goed zwarte ommuurde plaat met DMEM in 10%FBS bij een dichtheid van 2.000 cellen per put. Plaats de plaat 's nachts in een couveuse om de cellen te laten hechten.Verwijder 's ochtends media en voeg 10 microliter per put van kleine storende RNA-nanodeeltjes toe die in volledige serummedia worden verdund voor een laatste kleine RNA-concentratie van 100 nanomolar. Breng de putten 24 uur terug naar de couveuse om de cellen te behandelen met kleine storende RNA nanodeeltjes. De volgende dag, vervang media door volledige serum media met 150 microgram per milliliter D-luciferin.Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat u luminescentie meet op een plaatlezer. Herhaal vervolgens twee maal de mediaverfrising met verse volledige serummedia vrij van D-luciferin, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur. Vervang de media door volledige serummedia met 150 milligram per milliliter D-luciferin en incubbate vijf minuten bij kamertemperatuur.Meet de luminescentie op het tijdspunt van 48 uur. Voor longitudinale studies, laat deksel op de top van de put plaat wanneer buiten de biosafety kast om cellen te onderhouden onder steriele omstandigheden en de incubatie voort te zetten na het vervangen van luciferin-bevattende media met verse volledige media. Dynamische lichtverstrooiingsmetingen tonen aan dat kleine storende RNA nanodeeltjes een gemiddelde diameter van 35 nanometer heeft.De aanwezigheid van een enkele piek met smalle piekbreedte duidt op een unimodale verdeling en een lage polydispersiteit. TEM-metingen bevestigen de groottemeting van dynamische lichtverstrooiing suggereert de aanwezigheid van een uniforme populatie van kleine storende RNA-nanodeeltjes en onthulden de bolvormige morfologie van de kleine storende RNA-nanodeeltjes. Een te hoge concentratie polymeer in de voorbereidingsstap resulteerde voor kleine storende RNA nanodeeltjes twee in ongewenste diameter van meer dan 200 nanometer, een multimodale en polydispersed populatie, en aggregaten in oplossing die geen duidelijke deeltjesmorfologie vormt.Zowel kleine storende RNA nanodeeltjes een en twee display neutrale oppervlakte lading aangegeven door bijna nul gemiddelde zeta potentiële waarden. Agarose gel retardatie test toont het verdwijnen van kleine storende RNA banden op de gel bodem die de complexiteit van kleine storende RNA aan polymeer aangeeft. Polymeer complex kleine storende RNA is niet in staat om te migreren door de gel en is dus gevisualiseerd aan de bovenkant van de gel in de buurt van de laadputten.Naarmate de stikstof-fosfaatverhouding wordt verhoogd, neemt de kleine storende RNA-complexatie toe, zoals blijkt uit een verminderde intensiteit van de kleine storende RNA-band aan de gelbodem. Bioactieve luciferase kleine storende RNA nanodeeltjes vertoont men aanzienlijk verminderde luciferase activiteit in vergelijking met scrambled control. In tegenstelling, luciferase kleine storende RNA nanodeeltje twee wordt niet beschouwd als bioactief.Om consistente siRNA nanodeeltjes met de gewenste fysischchemische eigenschappen te produceren, moet men polymeeroplossingen met de juiste concentraties gebruiken en de pH van de bufferoplossingen bij elke stap van het protocol valideren. Met behulp van deze methoden in ons onderzoek hebben we in staat geweest om siRNA nanodeeltjes gebaseerde therapieën te produceren voor eerder ondruggbare kankerverwekkende genen en de werkzaamheid van deze therapieën te testen in preklinische modellen van borstkanker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Microfluïdische fabricage van polymere en biohybridevezels met vooraf ontworpen grootte en vorm

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymere Microneedle Array Fabrication door Fotolithografie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabriceren superhydrophobic polymere materialen voor biomedische toepassingen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...