Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Craig Duvall und Rebecca Cook für den Zugang zu Daten und Laborressourcen für die Durchführung dieser Forschung. Die Autoren danken dem Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) für den Zugang zu den Instrumenten DLS und TEM (NSF EPS 1004083). Die Autoren sind der National Science Foundation dankbar, dass sie das Graduate Research Fellowship Program (NSF#1445197) unterstützt hat. Die Autoren danken den National Institutes of Health für die finanzielle Unterstützung (NIH R01 EB019409). Die Autoren danken dem Programm "Department of Defense Congressionally Directed Medical Research" für finanzielle Unterstützung (DOD CDMRP OR130302).

1. Vorbereitung und Charakterisierung von si-NPs
<ol><li>si-NP Vorbereitung<ol>
<li>Polymere in 10 mM-Zitronensäure-Puffer (pH 4.0) bei 3,33 mg/mL auflösen. Polymer kann zunächst bei 10x Konzentration in Ethanol aufgelöst werden, um die Auflösung zu gewährleisten. NOTE: Polymer kann in niedrigeren Konzentrationen aufgelöst werden, aber der Einsatz in Konzentrationen über 3,33 mg/mL kann eine homogene NP-Bildung verhindern.</li>
		<li>Fügen Sie siRNA (50 μM in diH2 O)hinzu, um N+:P<sup...

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

Die hier beschriebenen si-NPs werden durch die elektrostatische Assoziation von anionischen siRNA und kationischen Polymeren zu Polyionenkomplexen (Polyplexe) gebildet. Die elektrostatische Verkomplexung von siRNA und dem kationischen DB-Block von PEG-DB-Polymeren wird durch das Mischen mit niedrigem pH-Wert (4.0) erleichtert. Bei pH 4.0 ist DMAEMA hoch protoniert, und damit ist der DB-Block hoch aufgeladen. Damit wird sichergestellt, dass sich die Polymere als Eindringlinge in der Lösung auflösen und keine Mikellen bi...

Da siRNAs die Übersetzung von Proteinen aus mRNA-Sequenzen hemmen, können sie theoretisch verwendet werden, um alle bekannten Pathologien1,2, 3,4,5zumedikamentös zu machen. Der Einsatz von siRNA in der Medizin wird jedoch durch das umfassend schlechte pharmakokinetische Profil von siRNA-Molekülen 6,7begrenzt. Wenn sie intravenös injiziert werden, werden siRNAs schnell durch die Nieren und/oder durch Nukleasen8,9abgebaut. Aufgrund seiner großen Größe und negativen Ladung kann siRNAnichtin die Zellen eindringen oder dem endolysosomalen Weg entkommen, um auf den RNA-induzierten Stillstandskomplex (RISC) zuzugreifen, der im Cytosol 10,11, 12, 13. November So konzentriert sich der umfangreiche Aufwand auf die Konzeption und Umsetzung von siRNA-Lieferstrategien 14. Diese Bemühungen konzentrierten sich weitgehend auf die Entwicklung von lipid-und polymerbasierten Nanopartikeln, die siRNA verpacken, vor Räumung und Degradierung in vivo schützen und durch ionisierbare, kationelle Aminengruppen eine zelluläre Aufnahme und endosomale Flucht auslösen. Es wurden viele präklinische Erfolge gemeldet und zuletzt wurde der erste klinische Erfolg für die nanopartikel-basierte Leberlieferungen zur Behandlung der erblichen Transthyrein-vermittelten (hATTR) Amyloidose 15 gemeldet.
Es gibt viele krebserregende Gene, die derzeit von der konventionellen Pharmakologie "nicht rugdfähig" sind (z.B. kleine Molekülmedikamente), die das Design von polymerischen siRNA-Nanopartikeln (si-NPs) zur Behandlung von Krebs16 motivieren. Es gibt jedoch einen separaten Satz von Konstruktionsparametern, die für die nicht-hepatische siRNA-Lieferung berücksichtigt werden müssen. Das Liefersystem muss die kationische Ladung des Polyplex abschirmen, die eine Agglutination innerhalb der systemischen Zirkulation 17,18,19verursacht. Für die Tumorzufuhr ist insbesondere die si-NP Stabilität unerlässlich, um eine lange Zirkulation und damit eine erhöhte Akkumulation innerhalb von Tumoren durch die verbesserte Durchlässigkeit undRetentionseffekt (EPR) 20,21zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Größe von si-NP unerlässlich, da nur Nanopartikel mit einer Größe von etwa 20 – 200 nm Durchmesser EPR22und kleinere si-NPs (~ 20 – 50 nm Durchmesser) eine verbesserte Tumordurchdringung gegenüber größeren Nanopartikeln aufweisen und Mikropartikel23.
Um diesen zusätzlichen Konstruktionseinschränkungen für die systemische Tumorzustellung von siRNA nach intravenöser Verabreichung gerecht zu werden, wurden neutral aufgeladene, pH-reaktionsfähige si-NPs entwickelt (Abbildung 1)24. Diese si-NPs sind PEGylatierte,oder zuletzt Zwitterionierte 25, für neutrale Oberflächenaufladung und Resistenz gegen Proteinadsorption und Opsonisierung im Umlauf. Da sie sich nicht allein auf den kationischen Charakter verlassen können, um die intrazelluläre Lieferung voranzutreiben, ist ein äußerst effizientes endosomales Escape-Escape-Gebot, um eine starke Genverstallung zu erreichen. Dementsprechend besteht der Kern dieser si-NPs aus einem hochendosomolytischen Kern, der bei extrazellulärem pH-Wert (7,4) inert ist, aber in schalterlicher Weise unter den sauren Bedingungen des endolysosomalen Weges [pH 6.8 (frühe Endosomen) – 5.0 ausgelöst wird ( Lysosomen)]. Schließlich sorgt eine Mischung aus kationischem und hydrophobischem Gehalt im Kern der si-NPs für elektrostatische und van der Waals-Stabilisierungskräfte, die die Stabilität der si-NPs im Blut im Vergleich zu rein kationischen Systemen verbessern.
Die Integration vieler Funktionen in ein relativ einfaches Design ist durch die reversible Addition-Fragmentierungskette Transfer (RAFT) zur Herstellung von Polymeren mit komplexer Architektur und präziser Komposition möglich. Zur Herstellung von Si-NPs mit neutraler Oberflächenaufladung, pH-Reaktionsfähigkeit und NP-Stabilität wird RAFT verwendet, um Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylate--Butylmethacrylat] zu synthetisieren. Abbildung 1A). PEG-DB ist elektrostatisch mit siRNA vervollbbar und bildet si-NPs mit einem PEG-Korona und DB/siRNA-Kern (Abbildung 1B). PEG bildet eine inerte, neutral geladene hydrophile Schicht auf der si-NP Corona. Der DB-Block besteht aus einem 50:50-molaren Verhältnis von 2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylat (DMAEMA) und Butylmethacrylat (BMA). Die ationische DMAEMA umsetzt elektrostatisch die negativ geladene siRNA. BMA Selbst-assoziierte innerhalb der NP-Kern von van der Waals Interaktionen, die Erhöhung der NP-Stabilität. Gemeinsam vermitteln DMAEMA und BMA pH-abhängiges Lipidbilayer-lytisches Verhalten an den DB-Polymerblock. Bei extrazellulärem pH wird der DB-Block an den si-NP-Kern geklebt und ist inert auf Lipidbilayers. Unter sauren Bedingungen, wie zum Beispiel innerhalb des Endolysosomalpfads, erleichtert die ionisierbare DMAEMA innerhalb des DB-Blocks den Protonenschwamm-Effekt, bei dem die endosomale Pufferungzuosmotischer Schwellung und Bruch 26 führt. Darüber hinaus integrieren sich hydrophobe BMA-Moieanlagen innerhalb des DB-Blocks aktiv in und lysen Lipidbilayers, was zu einer starken Endosomolyse führt. So wird siRNA mit PEG-DB zu si-NPs Komplexiert, die neutral aufgeladen und bei extrazellulärem pH-Wert hochstabil sind, aber die Lipidbilayer bei saurem pH-Wert stören und so eine zytosolische Lieferung der siRNA-Nutzlast gewährleisten.
Hierin werden die experimentellen Verfahren beschrieben, um si-NPs von PEG-DB zu produzieren. Es werden Methoden zur Charakterisierung der physikalisch-chemischen Parameter und der Bioaktivität von si-NPs vorgestellt und diskutiert. Um die si-NP-Bioaktivität schnell zu bewerten, wird Luciferase als Modell-Gen für Knockdown-Studien eingesetzt. Firefly Luciferase ist das Protein, das für das "Glühen" der Glühwürmchen 27 verantwortlich ist. Entsprechend erzeugen Säugetierzellen, die mit dem firefly luciferase-Gen transferiert werden, ein biolumineszierendes "Glühen", das mit einem Leuchtometer erfasst werden kann, um die Werte der Luciferase-Expression zu quantifizieren. Hier verwenden wir Luciferase, um die Bioaktivität von si-NPs zu bewerten, indem wir siRNA gegen Luciferase liefern und die entsprechende Reduktion der Biolumineszenz in Luziferase-Ausdruckszellen im Vergleich zu Zellen quantifizieren, die eine Rührei siRNA erhalten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Der Erfolg von siRNA als zielgerichteter molekularer Medizin hängt von der effizienten zytosolischen Zufuhr an Zellen im Gewebe der Pathologie ab. Der klinische Erfolg bei der Behandlung von bisher "untrüglichen" Lebererkrankungen mit siRNA wurde erzielt. Eine effiziente TumorsiRNA-Zufuhr erfordert jedoch zusätzliche pharmakokinetische Gestaltungsüberlegungen, darunter lange Umlaufzeiten, Ausweichorgane (z.B . Leber und Nieren) sowie Tumordurchdringung und-bindung. Hier beschreiben wir die Zubereitung und in vitro physicochemical/biologische Charakterisierung von polymerischen Nanopartikeln, die für eine effiziente SiRNA-Lieferung, insbesondere für nicht-epatische Gewebe wie Tumoren, entwickelt wurden. Die siRNA-Nanopartikel werden durch elektrostatische Komplexe von siRNA und dem DBlock-Copolymer-Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Meylmethacrylate-Co-Butylmethacrylat]) (PEG-DB) zu Polyionen hergestellt. In der Lage, sich in der Lage zu befinden, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage zu sein. Darüber hinaus wird der DB-Block als Vesikel des endolysosomalen Pfades (< pH 6.8), was endosomale Escape-und zytosolische Lieferung von siRNA auslöst. Es werden Methoden beschrieben, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften von siRNA-Nanopartikeln wie Größe, Oberflächenaufladung, Partikelmorphologie und siRNA-Belastung zu charakterisieren. Die Bioaktivität von siRNA-Nanopartikeln wird mittels Luciferase als Modell-Gen in einem schnellen und hochdurchgehenden Gen-Schweigungsanfall gemessen. Entwürfe, die diese ersten Tests bestehen (wie PEG-DB-basierte Polyplexe), gelten als geeignet für die Übersetzung in präklinische Tierstudien, die die Lieferung von siRNA an Tumoren oder andere Orte der Pathologie bewerten.

Einige wesentliche Merkmale der effektiven si-NPs für die In-vivo siRNA-Lieferung sind die richtige Größe (~ 20 – 200 nm Durchmesser), siRNA-Verpackungen und Gen-Schweigenden Bioaktivität. Obwohl es sich hierbei nicht um eine erschöpfende Liste handelt (wie in der Diskussion angesprochen), sollten diese grundlegenden Merkmale bestätigt werden, bevor eine weitere Prüfung einer Formulierung in Erwägung gezogen wird.
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Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.

Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Das aktuelle Protokoll ist von Bedeutung, da es forschern ermöglicht, siRNA-geladene Nanopartikel herzustellen und diese Nanopartikel angemessen zu charakterisieren, um ihre Eignung für die Verabreichung an Tiere vor späteren Studien zu gewährleisten. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, Nanopartikel zu produzieren, die die Bioverfügbarkeit von siRNA erhöhen, und Nanopartikel zu produzieren, die neutral geladen und somit für die systemische Verabreichung geeignet sind. Diese Technik ist wirkungsvoll, da siRNA-Nanopartikel zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt werden können, die eine systemische Verabreichung erfordern, darunter Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, unter anderem.Zunächst polymer in Ethanol in einer Konzentration von 33,3 Milligramm pro Milliliter auflösen und rühren, um die Auflösung zu gewährleisten. Dann verwenden Sie eine Pipette, um Polymerlösung in 10 Millimolaren Zitronensäurepuffer zu übertragen, um eine Konzentration von 3,33 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Fügen Sie destilliertes Wasser in eine Röhre mit kleiner störender RNA ein, um eine Konzentration von 50 Mikromolaren zu erreichen.Mischen Sie die Polymer- und kleinen störenden RNA-Lösungen gründlich in einem Rohr, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um ein Stickstoff-Phosphat-Verhältnis von 10 zu erreichen. Legen Sie das Rohr 30 Minuten bei Umgebungstemperatur auf. Dann fügen Sie einen Milliliter 10 Millimolar Phosphatpuffer bei pH 8 in das Rohr, um eine Konzentration von 0,28 Milligramm pro Milliliter zu erreichen und mischen Sie vorsichtig entweder durch Pipettieren oder Invertieren der Röhre.Um zu bestätigen, dass der endgültige pH-Wert neutral ist, um 7,2 bis 7,5, Pipette 10 Mikroliter der kleinen störenden RNA-Nanopartikellösung auf die pH-Teststreifen. Bereiten Sie zunächst eine dynamische Lichtstreuungsprobe vor, indem Sie einen Milliliter kleiner störender RNA-Nanopartikel in der Konzentration von 0,28 Milligramm pro Milliliter durch Spritzenfilter in einer Porengröße von 0,45 Mikrometern in eine quadratische Quarz- oder Polystyrol-Küvette filtern. Zeichnen Sie dann Größen- und Oberflächenladungsmessungen mit einem dynamischen Lichtstreuungsgerät nach herstellerspezifischen Vorgaben auf.Um die Größe und Morphologie kleiner störender RNA-Nanopartikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie zu bestätigen, fügen Sie zunächst fünf Mikroliter gefilterter kleiner interferierender RNA-Nanopartikellösung mit 0,28 Milligramm pro Milliliter zu jedem TEM-Raster hinzu. Platzieren Sie die Gitter 60 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur. Mit Filterpapier drei Sekunden trocknen.Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter 3%Uranylacetat-Lösung zu jedem Gitter hinzu und brüten für 20 Sekunden. Drei Sekunden lang trocknen. Dann legen Sie die Gitter in einem Trockenhaus, um über Nacht zu trocknen, bevor Sie unter Transmissionselektronenmikroskopie bildgeben.Um die Agarose-Gel-Retardierung durchzuführen, fügen Sie zunächst zwei Gramm Elektrophorese-Grade-Agarosepulver zu 100 Millilitern 1X Tris-Acetat-EDTA Puffer bei pH 8 in einem Becher hinzu, um 2%Agarose-Gel zu produzieren. Rühren, um die Agarose auszusetzen. Legen Sie den Becher in einer Mikrowelle freigelegt, um für ein bis drei Minuten zu erhitzen, bis alle Agarose gelöst ist.Nach dem Abkühlen fünf Mikroliter Ethidiumbromid in der Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in den Becher geben und gut vermischen. Dann gießen Sie die Agarose in ein Geltablett und legen Sie Kamm, um Brunnen zu produzieren. Lassen Sie das Gel 30 Minuten trocknen.Entfernen Sie vorsichtig den Kamm, um Ladebrunnen zu hinterlassen, und gießen Sie 1X Tris-Acetat-EDTA Puffer in das Geltablett, um es bis zur maximalen Fülllinie zu füllen. Dann legen Sie zwei Mikroliter Aliquots von Ladefarbstoff ohne SDS oder Reduktionsmittel auf Paraffinfolie für jede kleine störende RNA-Nanopartikelformulierung bei unterschiedlichen Stickstoff-Phosphat-Verhältnissen. Pipette zum Mischen von 10 Mikrolitern kleiner störender RNA-Nanopartikellösung mit Ladefarbstoff auf Paraffinfolie.Fügen Sie die Mischung zu Agarose Gel Brunnen. Schließen Sie das Elektrophoresesystem an ein Netzteil an und führen Sie die Spannungsquelle bei 100 Volt für 35 Minuten oder bis die Proben 80 % der Gellänge durchlaufen haben. Übertragen Sie das Gel aus dem Tablett auf einen UV-Transilluminator und visualisieren Sie die kleinen störenden RNA-Bänder am UV-Transilluminator nach herstellerspezifischen Spezifikationen.Bestimmen Sie das optimale Stickstoff-Phosphat-Verhältnis basierend auf dem Verschwinden kleiner störender RNA-Bänder an der Unterseite des Gels. Um Modellgen luziferase zu fallen, erste Kern-Luziferase-exzierende Zellen in einer 96-well schwarz wandförmigen Platte mit DMEM in 10%FBS bei einer Dichte von 2.000 Zellen pro Brunnen. Legen Sie die Platte über Nacht in einen Inkubator, damit die Zellen haften können.Am Morgen Medien entfernen und 10 Mikroliter kleiner störender RNA-Nanopartikel hinzufügen, die zu vollserummedien verdünnt werden, um eine abschließende kleine störende RNA-Konzentration von 100 Nanomolar zu erreichen. Bringen Sie die Brunnen für 24 Stunden in den Inkubator zurück, um die Zellen mit kleinen störenden RNA-Nanopartikeln zu behandeln. Ersetzen Sie am nächsten Tag Medien durch vollständige Serummedien mit 150 Mikrogramm pro Milliliter D-Luciferin.Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Lumineszenz auf einem Plattenleser messen. Dann wiederholen Sie die Medien Erfrischung zweimal mit frischen vollen Serum-Medien frei von D-Luziferin, gefolgt von Inkubation für 24 Stunden. Ersetzen Sie die Medien durch vollständige Serummedien, die 150 Milligramm pro Milliliter D-Luzifferin enthalten, und brüten Sie bei Raumtemperatur fünf Minuten lang.Messen Sie die Lumineszenz am 48-Stunden-Zeitpunkt. Für Längsschnittstudien den Deckel auf der Brunnenplatte lassen, wenn sie außerhalb des Biosicherheitsschranks sind, um Zellen unter sterilen Bedingungen zu erhalten und die Inkubation fortzusetzen, nachdem luziferinhaltige Medien durch frische Vollmedien ersetzt wurden. Dynamische Lichtstreumessungen zeigen, dass kleine störende RNA-Nanopartikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 35 Nanometern haben.Das Vorhandensein eines einzelnen Peaks mit schmaler Spitzenbreite weist auf eine unimodale Verteilung und eine geringe Polydispersität hin. TEM-Messungen bestätigen die Größenmessung durch dynamische Lichtstreuung, die das Vorhandensein einer einheitlichen Population kleiner störender RNA-Nanopartikel nahelegt und die sphärische Morphologie der kleinen störenden RNA-Nanopartikel aufdeckt. Eine zu hohe Polymerkonzentration im Vorbereitungsschritt führte zu kleinen störenden RNA-Nanopartikeln zwei mit unerwünschtem Durchmesser von mehr als 200 Nanometern, einer multimodalen und polydispergierten Population und Aggregaten in Lösung, die keine eindeutige Partikelmorphologie bilden.Sowohl kleine störende RNA-Nanopartikel eins als auch zwei zeigen neutrale Oberflächenladungen, die mit nahe Null mittleren Zeta-Potenzialwerten angezeigt werden. Agarose-Gel-Retardierung-Assay zeigt das Verschwinden kleiner störender RNA-Bänder am Gelboden, was auf eine Komplexierung kleiner störender RNA zu Polymer hindeutet. Polymerkomplexige kleine störende RNA kann nicht durch das Gel wandern und wird somit an der Oberseite des Gels in der Nähe der Ladebrunnen visualisiert.Mit der Erhöhung des Stickstoff-Phosphat-Verhältnisses erhöht sich die kleine störende RNA-Komplexierung, wie durch eine verringerte Intensität des kleinen störenden RNA-Bandes am Gelboden angezeigt wird. Bioaktive Luziferase kleine störende RNA Nanopartikel zeigt deutlich verminderte Luziferase-Aktivität im Vergleich zu Rührkontrolle. Im Gegensatz dazu gilt Luziferase kleine störende RNA Nanopartikel zwei nicht als bioaktiv.Um konsistente siRNA-Nanopartikel mit den gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften herzustellen, sollte man Polymerlösungen mit entsprechenden Konzentrationen verwenden und den pH-Wert der Pufferlösungen bei jedem Schritt des Protokolls validieren. Mit diesen Methoden in unserer Forschung konnten wir siRNA-Nanopartikel-basierte Therapien für zuvor undruggnable krebserregende Gene produzieren und die Wirksamkeit dieser Therapien in präklinischen Modellen von Brustkrebs testen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulierung von Diblock Polymernanopartikel durch Nanopräzipitation Technik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...