Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

המחברים אסירי תודה לג. קרייג דובאל ורבקה קוק לגישה למידע ולמשאבי מעבדה לניהול מחקר זה. המחברים אסירי תודה למכון ואנדרבילט למדע ננו-סקאלה והנדסה (VINSE) עבור גישה DLS ו-TEM (NSF EPS 1004083) כלים. המחברים אסירי תודה לקרן המדע הלאומית לתמיכה בתוכנית המלגות למחקר בוגר (NSF 1445197). המחברים אסירי תודה למכון הלאומי לבריאות לתמיכה כספית (NIH R01 EB019409). המחברים אסירי תודה למחלקה להגנת Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי לתמיכה כספית (משרד ההגנה CDMRP OR130302).

1. הכנה ואפיון של סי-NPs
<ol><li>הכנת סי-NP<ol>
<li>התמוססות פולימר ב 10 מ"מ חומצת לימון מאגר (pH 4.0) ב 3.33 mg/mL. פולימר יכול להיות הומס הראשון בריכוז 10x ב אתנול כדי להבטיח פירוק. הערה: פולימר יכול להיות מומס בריכוזים נמוכים יותר, אבל להשתמש בריכוזים מעל 3.33 mg/mL יכול למנוע מערך NP הומוגנית.</li>
		<li>הוסף siRNA (50 μM ב-...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

ה-si-NPs המתואר כאן מיוצרים על ידי האגודה האלקטרוסטטית של הארגון האנייוני והפולימרים הניגיים לתוך polyion מתחמי (פוליפוניים). Complexing אלקטרוסטטית של siRNA ואת בלוק DB הנתונים של הפולימרים יתד-DB הוא הקלה על ידי ערבוב ב-pH נמוך (4.0). ב-pH 4.0, DMAEMA הוא מאוד protonated, וכתוצאה מכך בלוק DB טעונה מאוד. זה מבטיח כי הפולימ...

בגלל sirnas לעכב את התרגום של חלבונים מ-mrna רצפים, הם יכולים תיאורטית לשמש סמים כל הפתווגיות ידוע1,2,3,4,5. עם זאת, השימוש sirna ברפואה מוגבל על ידי הפרופיל הטוב ביותר הפרמקוקינטיים של sirna מולקולות6,7. כאשר מוזרק באופן מהיר, sirnas מתנקה במהירות דרך הכליות ו/או מושפל על ידי נוקלאוסים8,9. בשל גודלו הגדול וחיוב שלילי, siRNA לא יכול להיכנס לתאים או לברוח מסלול endolysosomal כדי לגשת לקומפלקס השתקה מושרה RNA (RISC) שנמצא בתוך הציטוזול10,11,12, . שלוש עשרה כך, מאמץ נרחב התמקד בעיצוב ויישום של אסטרטגיות משלוח siRNA14. מאמץ זה התמקד בעיקר בפיתוח של חלקיקי השומנים, פולימר מבוסס חלקיקים אשר חבילת siRNA, להגן עליו מפני הרשאה והשפלה ב vivo, וליזום ספיגת הסלולר ולהימלט אנדוזומתית דרך ionizable, הקבוצות מאמין. הצלחות טרום קליני רבים דווחו ולאחרונה, ההצלחה הקלינית הראשונה דווחה עבור משלוח ננו-חלקיק הכבד מבוסס siRNA לטיפול transthyretin תורשתי-תיווך (חטאר) עמילואידוזיס15.
ישנם הרבה סרטן גרימת הגנים כי הם כרגע "undruggable" על ידי פרמקולוגיה קונבנציונלי (כלומר, תרופות מולקולה קטנה), מוטיבציה העיצוב של חלקיקים מפולימר siRNA (si-NPs) לטיפול בסרטן16. עם זאת, יש קבוצה נפרדת של פרמטרי עיצוב שיש לשקול עבור משלוח siRNA לא הכבד. מערכת המסירה חייבת להגן על המטען המאסור של הפוליפקס שגורם להצמנות בתוך המחזור הסיסטמי17,18,19. עבור משלוח הגידול, במיוחד, si-NP יציבות חיונית כדי להעניק מחזור ארוך ולכן הצטברות מוגברת בתוך גידולים דרך חדירות משופרות ושמירה (epr) אפקט20,21. יתר על כן, שליטה על גודל si-NP הוא חיוני מאז רק חלקיקים כ 20-200 ננומטר קוטר בגודל מינוף EPR22, וקטן יותר Si-NPs (~ 20 – 50 בקוטר nm) התערוכה חדירה משופרת הגידול על חלקיקים בגודל גדול יותר מיקרוחלקיקים23.
כדי לטפל אלה אילוצי העיצוב הנוספים עבור המסירה גידול מערכתית של siRNA בעקבות והעברת המינהל, באופן נייטרליים טעונה, pH-תגובה si-NPs פותחו (איור 1)24. הג-NPs האלה הם מנובטים, או לאחרונה, Zwitterionated25, עבור טעינה משטח נייטרלי ועמידות לספיחה חלבונים וopsonization במחזור הדם. כיוון שהם לא יכולים להסתמך אך ורק על האופי לנהוג משלוח תאיים, בריחה יעילה מאוד אנדוזומלית היא הכרחית להשגת גנים חזקים השתקה. לפיכך, הליבה של אלה si-NPs מורכב ליבה אנדוסומאין מאוד, אשר הוא אינרטי ב-pH מסחטות (7.4), אבל אשר מופעלת בצורה כמו מתג בתנאים acidified של מסלול endolysoזומבית [pH 6.8 (מוקדם אנזומים) – 5.0 ( ליסוזומים)]. לבסוף, תערובת של תכנים הידרוליים ומופובי בליבת סי-NPs מספקים הן כוחות הייצוב האלקטרוסטטית והן של ואן דר ואלס, שיפור יציבותו של ה-si-NPs בדם לעומת מערכות המזרות בלבד.
שילוב של פונקציות רבות לתוך עיצוב פשוט יחסית ניתן להשתמש בתוספת הפיכה שרשרת פיצול (רפסודה) מבוקרת לייצר פולימרים עם ארכיטקטורה מורכבת וקומפוזיציה מדויקת. כדי לייצר si-NPs עם המטען הנייטרלי הקרקע, pH-תגובתיות, ו NP יציבות, הרפסודה משמש לסנתז פולי (אתילן גליקול-b-[2-(dimethylamino) אתיל מתיונין-co-בוטיל מתיונין) (יתד-DB; איור 1A). יתד-DB הוא אלקטרוסטטי משלימה עם siRNA, ויוצרים si-NPs עם הקורונה יתד ו DB/siRNA core (איור 1B). פג יוצרת שכבת הידרופיפילית. לא מופעלת על הקורונה סי-NP בלוק DB מורכב מ-50:50 היחס הטוחנת של 2-(dimethylamino) אתיל מתיונין (DMAEMA) ו בוטיל מתיונין (BMA). מכלולי מערכות בעלי מבנה סטטי מחויב siRNA. BMA שותפים עצמאיים בתוך ליבת NP על ידי האינטראקציות ואן דר ואלס, הגדלת יציבות NP. ביחד, DMAEMA ו-BMA להקנות השומנים תלויי-pH בלהה-lytic התנהגות לחסום את הפולימר DB. ב-pH מסחטות, בלוק DB מובאת si-NP הליבה והוא האינרטי bilayers השומנים. תחת תנאים חומציים, כגון אלה בתוך מסלול endolysoזוממה, ionizable DMAEMA בתוך בלוק DB מקלה על אפקט ספוג פרוטונים, שם מאגרים אנדוזומאים מוביל אוסמוטי נפיחות וקרע26. בנוסף, BMA הידרופובי moieties בתוך בלוק DB באופן פעיל להשתלב ו lyse השומנים bilayers, וכתוצאה מכך אנדוסווליזיס חזק. Thus, siRNA היא משלימה עם יתד-DB לטופס si-NPs כי הם נייטרליים טעונה ויציבה מאוד ב-pH מסירה אבל אשר משבש bilayers השומנים ב pH חומצי, להבטיח משלוח ציטוסולג של המטען siRNA.
להלן מתוארים ההליכים הניסיוניים להפקת si-NPs מ-יתד-DB. שיטות לאפיון הפרמטרים הפיזיקליים והביופעילות של סי-NPs מוצגים ודנים. על מנת להעריך במהירות את הפעילות הביוגנטית של si-NP, לוציפראז משמש כגן מודל עבור המשך הלימודים. גחלילית לluciferase הוא החלבון האחראי ' זוהר ' של גחליליות27. בהתאם לכך, תאים של מיונקים המזוהמים בגנים הלוצילזיים של גחלילית מייצרים "זוהר" ביולוגינט שניתן ללכוד באמצעות לימלומטר כדי לכמת את רמות הביטוי של לוציפראז. כאן, אנו משתמשים לוציפראז כדי להעריך אתריים של si-NPs על ידי אספקת sirna נגד לluciferase וכימות הפחתת המקבילה בביולומינסנציה ב-לוציפראז-הבעת תאים לעומת תאים המקבלים sirna מעורבל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

ההצלחה של siRNA כרפואה מולקולרית ממוקד תלויה המסירה cytosolic יעיל שלה תאים בתוך רקמת הפתולוגיה. הצלחה קלינית לטיפול בעבר "undruggable" מטרות מחלות הכבד עם siRNA הושג. עם זאת, מסירה יעילה siRNA הגידול מחייבת שיקולים עיצוב נוספים פרמקוקינטיים, כולל זמן מחזור ארוך, התחמקות של איברי הסיווג (למשל, כבד וכליות), וחדירה לגידול ושמירה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ומבחינה גופנית פיסיופיזיולוגיה/ביולוגיים אפיון של חלקיקים פולימריים מיועד משלוח siRNA יעיל, במיוחד רקמות שאינן הכבד כגון גידולים. חלקיקים siRNA מוכנים על ידי complexation אלקטרוסטטית של siRNA ואת diblock סומד פולי (אתילן גליקול-b-[2-(dimethylamino) אתיל מתיונין-co-בוטיל מתיונין) (יתד-DB) כדי ליצור מתחמי polyion ( פוליפלסים) כאשר siRNA ממוקם בתוך הליבה פוליפקס ו-פג צורות של הידרופיפילית, הקורונה הטעונה באופן נייטרליים. יתר על כן, בלוק DB הופך ממברנה-lytic כמו שלפוחיות של המסלול endolysoזומacidify (< pH 6.8), מפעיל בריחה אנדוזומטית ו ציטוסולג משלוח של siRNA. שיטות לאפיון המאפיינים הפיסיוכימיים של חלקיקים siRNA כגון גודל, משטח המטען, החלקיקים מורפולוגיה, ואת הטעינה siRNA מתוארים. Bioactivity של חלקיקים siRNA נמדד באמצעות לוציפראז כמו גן מודל בתוך מהירה, תפוקה גבוהה של גנים השתקה שיטת. עיצובים אשר עוברים אלה המבחנים הראשוניים (כגון מבוססי יתד-DB פוליפלסים) נחשבים מתאימים תרגום למחקרים בעלי חיים טרום קלינית הערכת המסירה של siRNA כדי גידולים או אתרים אחרים של פתולוגיה.

כמה מאפיינים חיוניים של ה-si-NPs יעיל עבור במסירה vivo siRNA הם בגודל הנכון (~ 20 – 200 ננומטר בקוטר), אריזה siRNA, והשתקה גנים ביולוגית. אמנם זו אינה רשימה ממצה (כפי שנדונה בדיון), מאפיינים בסיסיים אלה יש לאשר לפני שוקל בדיקה נוספת של ניסוח.
א?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

שיטות להכין ולאפיין את המאפיינים הפיסיוכימיים ואת אתריים של מחויב נייטרליים, מגיב pH-תגובה sirna מוצגים. הקריטריונים של siRNA nanomedicines מוצלחת כגון גודל, מורפולוגיה, טעינה משטח, העמסה siRNA, והשתקה גנים נדונים.

הכנת מנטרל-טעון, pH-מגיבים חלקיקים פולימריים עבור משלוח ציטוזה מסירה

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

הפרוטוקול הנוכחי הוא משמעותי משום שהוא מאפשר לחוקרים לייצר חלקיקים טעונים siRNA, ולאפיין כראוי חלקיקים אלה כדי להבטיח את התאמתם לניהול לבעלי חיים לפני מחקרים עתידיים. היתרון של גישה זו הוא לייצר חלקיקים המגדילים את הזמינות הביולוגית של siRNA ולייצר חלקיקים טעונים באופן ניטרלי ובכך מתאימים לניהול מערכתי. טכניקה זו היא השפעה כי חלקיקי siRNA ניתן ליישם לטיפול מספר עצום של מחלות המחייבות ניהול מערכתי כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, והפרעות אוטואימוניות, בין היתר.כדי להתחיל, להמיס פולימר באתנול בריכוז של 33.3 מיליגרם למיליליטר ומערבבים כדי להבטיח פירוק. לאחר מכן השתמש פיפטה להעביר פתרון פולימר 10 מילימולרית חומצה ציטרית חיץ להגיע לריכוז של 3.33 מיליגרם למיליליטר. הוסף מים מזוקקים לתוך צינור המכיל RNA מפריע קטן כדי להשיג ריכוז של 50 micromolar.מערבבים את הפולימר ופתרונות RNA מפריעים קטנים ביסודיות בצינור על ידי צינור למעלה ולמטה כדי להשיג יחס חנקן לפוספט של 10. מניחים את הצינור בטמפרטורת הסביבה במשך 30 דקות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ פוספט 10 מילימולרים ב- pH שמונה לצינור כדי להשיג ריכוז של 0.28 מיליגרם למיליליטר ומערבבים בעדינות על ידי צינורות או היפוך הצינור.כדי לאשר כי ה- pH הסופי הוא ניטרלי, סביב 7.2 כדי 7.5, פיפטה 10 microliters של פתרון חלקיקי RNA מפריעים קטנים על רצועות בדיקת pH. ראשית, להכין מדגם פיזור אור דינמי על ידי סינון מיליליטר אחד של חלקיקי RNA מפריעים קטנים בריכוז של 0.28 מיליגרם למיליליטר דרך 0.45 מיקרומטר גודל נקבובית מסנני מזרק לתוך קוורץ מרובע או cuvette פוליסטירן. לאחר מכן הקליטו מדידות גודל וטעינה על פני השטח באמצעות מכשיר פיזור אור דינמי בהתאם למפרטי היצרן.כדי לאשר את הגודל והמורפולוגיה של חלקיקי RNA קטנים מפריעים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור להוסיף תחילה חמישה microliters של פתרון חלקיקי RNA קטנים מפריעים מסוננים ב 0.28 מיליגרם למיליליטר לכל רשת TEM. מניחים את הרשתות בטמפרטורת הסביבה למשך 60 שניות. כתם יבש עם נייר סינון למשך שלוש שניות.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תסנובת אצטט 3%uranyl לכל רשת ודגירה למשך 20 שניות. כתם יבש במשך שלוש שניות. ואז למקם את הרשתות במייבש להתייבש לילה לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.כדי לבצע פיגור ג'ל אגרוז, תחילה להוסיף שני גרם של אבקת אגרוז אלקטרופורזה כיתה ל 100 מיליליטר של חיץ 1X טריס אצטט-EDTA ב pH שמונה ב beaker לייצר 2%agarose ג'ל. מערבבים להשעות את ההתעוררות. מניחים את המזווה שנחשף במיקרוגל כדי לחמם במשך 1 עד 3 דקות עד שכל אגרוז מומס.לאחר הקירור, מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של אתידיום ברומיד בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר לתוך הקוסם ומערבבים היטב. לאחר מכן יוצקים את ההתעוררות לתוך מגש ג'ל ומ מניחים מסרק כדי לייצר בארות. תן לג'ל להתייבש במשך 30 דקות.בזהירות להסיר את המסרק להשאיר מאחור טעינת בארות, ויוצקים 1X טריס אצטט-EDTA מאגר לתוך מגש ג'ל למלא את קו המילוי המרבי. לאחר מכן מניחים שני aliquots microliter של טעינת צבע ללא SDS או הפחתת סוכנים על סרט פרפין עבור כל ניסוח חלקיקי RNA מפריע קטן ביחסי חנקן לפוספט שונים. פיפטה לערבב 10 microliters של פתרון חלקיקי RNA קטן מפריע עם טעינת צבע על סרט פרפין.מוסיפים את התערובת ל בארות ג'ל אגרוז. חבר את מערכת האלקטרופורזה לאספקת חשמל והפעל מקור מתח ב- 100 וולט למשך 35 דקות או עד שהדגימות חצו 80% מאורך הג'ל. מעבירים את הג'ל מהמגש לטרנסילומינטור UV ומדמיין את רצועות ה-RNA המפריעות הקטנות על טרנסילומינטור UV בהתאם למפרט היצרן.לקבוע את יחס החנקן האופטימלי פוספט מבוסס על היעלמות של להקות RNA מפריעות קטנות בתחתית הג'ל. כדי להפיל את הגן מודל luciferase, הראשון זרע לוסיפראז הבעת תאים בצלחת 96 היטב שחור מוקף עם DMEM ב 10%FBS בצפיפות של 2, 000 תאים לגם. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור לילה כדי לאפשר לתאים לדבוק.בבוקר להסיר מדיה ולהוסיף 10 microliters לכל באר של חלקיקי RNA מפריעים קטנים מדולל לתוך מדיה סרום מלא עבור ריכוז RNA מפריע קטן סופי של 100 ננומולרים. מחזירים את בארות החממה במשך 24 שעות כדי לטפל בתאים עם חלקיקי RNA מפריעים קטנים. למחרת, החלף מדיה במדיה מלאה בסרום המכילה 150 מיקרוגרם למיליליטר D-luciferin.דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני מדידת זוהר על קורא צלחת. לאחר מכן חזור על רענון המדיה פעמיים עם מדיה סרום מלא טרי ללא D-luciferin, ואחריו דגירה במשך 24 שעות. החלף את המדיה במדיה מלאה בסרום המכילה 150 מיליגרם למיליליטר D-luciferin ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.למדוד זוהר בנקודת הזמן של 48 שעות. עבור מחקרים אורך, להשאיר את המכסה על גבי צלחת היטב כאשר מחוץ לארון biosafety כדי לשמור על תאים בתנאים סטריליים ולהמשיך את הדגירה לאחר החלפת מדיה המכילה לוציפרין עם מדיה מלאה טרייה. מדידות פיזור אור דינמי מראות כי קטן מפריע RNA חלקיק אחד יש קוטר ממוצע של 35 ננומטר.הנוכחות של שיא יחיד עם רוחב שיא צר מצביעה על התפלגות חד-מוגדיאלית ופולידיספרסיות נמוכה. מדידות TEM מאשרות את מדידת הגודל מתפזרות אור דינמית מרמזת על נוכחות של אוכלוסייה אחידה של חלקיקי RNA קטנים מפריעים וחשפה את המורפולוגיה הכדורית של חלקיקי ה- RNA המפריעים הקטנים. ריכוז גבוה מדי של פולימר בשלב ההכנה הביא קטן להתערב RNA חלקיקים שניים בקוטר לא רצוי של יותר מ 200 ננומטר, אוכלוסייה multimodal ו polydispersed, אגרגטים בפתרון להרכיב שום מורפולוגיה חלקיקים ברורה.שני חלקיקי RNA קטנים מפריעים אחד ושניים להציג מטען משטח ניטרלי מסומן על ידי כמעט אפס ממוצע ערכי זטה פוטנציאליים. בדיקת פיגור ג'ל אגרוז מראה את היעלמותן של להקות RNA קטנות מפריעות בתחתית הג'ל, מה שמצביע על קומפלקסציה של רנ"א קטן ומפריע לפולימר. פולימר מורכב RNA מפריע קטן אינו מסוגל לנדוד דרך הג'ל ולכן הוא דמיין בחלק העליון של הג'ל הסמוך בארות טעינה.כמו יחס חנקן לפוספט הוא גדל קטן מפריע RNA קומפלקסציה עולה כפי שצוין על ידי ירידה בעוצמה של רצועת RNA מפריע קטן בתחתית הג'ל. לוציפראז ביואקטיבי קטן מפריע RNA חלקיק אחד מציג באופן משמעותי פחתה פעילות לוציפראז בהשוואה לשליטה מקושקשת. לעומת זאת, לוציפראז קטן מפריע RNA חלקיקים 2 אינו נחשב ביואקטיבי.כדי לייצר חלקיקי siRNA עקביים עם תכונות פיזיוכימיות רצויות, יש להשתמש בפתרונות פולימר עם ריכוזים מתאימים ולאמת את ה- pH של פתרונות החיץ בכל שלב של הפרוטוקול. באמצעות שיטות אלה במחקר שלנו הצלחנו לייצר טיפולים מבוססי ננו-חלקיקים siRNA עבור גנים גורמי סרטן בעבר בלתי ניתנים לשחזור ולבדוק את היעילות של טיפולים אלה במודלים פרה-קליניים של סרטן השד.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

הנקבובי הסיליקון microparticles למשלוח Therapeutics siRNA

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...